一測多評法同時(shí)測定蒙藥扎沖十三味丸中8種成分

寶魯爾，王 徽，吳杰斯，白塔那，陳紅梅，王秀蘭*

1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000

2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000

扎沖十三味丸（Zhachong Shisanwei Pills，ZSP）又名嘎日迪十三味丸、十三味麝香丸、十三味大鵬金翅丸、扎沖朱素木，在蒙醫(yī)臨床上使用歷史較長，此方由木香、訶子、甘草、麝香、肉豆蔻、制草烏、石菖蒲、丁香、沉香、珍珠（制）、磁石（煅）、禹糧土、珊瑚（制）共13 味單藥組成，具有除“協(xié)日烏素”、鎮(zhèn)靜安神、祛風(fēng)通竅、舒筋活血功效，用于左痰右瘓、手腳麻痹、腰腿不利、言語不清、口眼歪斜、神經(jīng)麻痹、半身不遂、筋骨疼痛、關(guān)節(jié)疼痛、風(fēng)濕[1]。臨床上用于治療缺血性腦血管?。ò酌}?。?、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（協(xié)日烏素病）、面肌痙攣、周圍性神經(jīng)麻痹、坐骨神經(jīng)痛、冠心病心絞痛等疾病[2-4]。

蒙藥是蒙古族歷代蒙醫(yī)經(jīng)典醫(yī)籍傳承的寶貴財(cái)富，具有獨(dú)特的功效。近幾年研究蒙藥復(fù)方的學(xué)者和研究人員逐漸增多，同時(shí)，為了順應(yīng)國際和國內(nèi)的用藥需求，對蒙藥復(fù)方的質(zhì)量控制也不再是單一成分的含量測定，而通過對多成分同時(shí)測定實(shí)現(xiàn)蒙藥復(fù)方的多指標(biāo)質(zhì)量評價(jià)。一測多評法（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）是一種采用1 個(gè)成分來實(shí)現(xiàn)對多個(gè)成分同步監(jiān)控的有效方法，近年來在蒙藥復(fù)方制劑多指標(biāo)成分定量測定中得到廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)采用QAMS法同時(shí)測定ZSP中主要活性成分沒食子酸、鞣花酸、綠原酸、丁香酚、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛腦、甘草酸銨、沉香四醇的含量，為蒙藥ZSP 的多指標(biāo)質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity II 型高效液相，美國Agilent科技有限公司；Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Inertsil ODS-3 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；BDS HypersilTMC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；島津LC-20A（20A）型高效液相，日本島津科技有限公司；QUINTIX35-1CN 型十萬分之一電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；KQ-300VDY 型醫(yī)用超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 材料

ZSP，9 個(gè)批次，批號1908003、1908005、1908008、1909010、1909011、1909016、1911004、1911005、1911006，內(nèi)蒙古奧特奇蒙藥股份有限公司。對照品沒食子酸（批號110831-201605，質(zhì)量分?jǐn)?shù)90.8%）、綠原酸（批號110753-200413，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.3%）、鞣花酸（批號111959-201903，質(zhì)量分?jǐn)?shù)88.8%）、沉香四醇（批號111980-201904，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.6%）、丁香酚（批號110725-201917，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.1%）、甘草酸銨（批號110731-201619，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.0%）、α-細(xì)辛腦（批號100298-201203，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100.0%）、β-細(xì)辛醚（批號112018-201802，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.3%）均購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 定量方法

2.1.1 色譜條件 Inertsil ODS-3 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～7 min，30%甲醇；7～20 min，30%～51%甲醇；20～28 min，51%～59%甲醇；28～55 min，59%～75%甲醇；檢測波長為0～7 min，271 nm（沒食子酸）；7～20 min，252 nm（綠原酸、沉香四醇）；20～28 min，254 nm（鞣花酸）；28～33 min，281 nm（丁香酚）；33～45 min，257 nm（β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛腦）；45～55 min，237 nm（甘草酸銨）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量7 μL。該色譜條件下對照品及樣品色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品 (A) 和ZSP 樣品 (B) 的HPLC 圖Fig.1 HPLC of mixed reference substances (A) and ZSP sample (B)

2.1.2 混合對照品溶液制備 分別精密量取沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、丁香酚、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛腦、甘草酸銨對照品儲備液適量，混合均勻，加甲醇進(jìn)行稀釋，制成含沒食子酸0.184 mg/mL、綠原酸0.116 mg/mL、沉香四醇0.167 mg/mL、鞣花酸0.063 mg/mL、丁香酚0.207 mg/mL、β-細(xì)辛醚0.042 mg/mL、α-細(xì)辛腦0.025 mg/mL、甘草酸銨0.094 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 精密稱取樣品2.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定 質(zhì)量，超聲35 min，放冷至室溫，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.1.4 線性關(guān)系考察 將“2.1.2”項(xiàng)下混合對照品溶液按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣0.5、2.0、3.5、5.0、6.5、8.0 μL，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，各組分的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1?？梢娫摲椒ㄔ谠囼?yàn)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對照品溶液，以“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、丁香酚、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛腦、甘草酸銨峰面積的RSD 值分別為0.40%、0.73%、0.35%、0.51%、0.93%、0.79%、1.81%、1.69%，表明在該條件下儀器精密度良好。

表1 線性關(guān)系測定結(jié)果Table 1 Results of determination of linearity relation

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取ZSP 粉末2.0 g，精密稱定，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、丁香酚、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛腦、甘草酸銨峰面積的RSD 值分別為0.14%、1.08%、0.22%、0.08%、0.72%、0.47%、1.84%、1.71%，表明該供試品溶液在室溫下24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次ZSP 粉末（批號1908003）2.0 g，精密稱定，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、丁香酚、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛腦、甘草酸銨峰面積的RSD 值分別為0.06%、1.03%、0.19%、0.12%、0.29%、0.57%、1.86%、1.54%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批次ZSP 粉末（批號1908003）共6 份，每份1.0 g，精密稱定，置50 mL 具塞錐形瓶中，精密量取質(zhì)量濃度為 1.66 mg/mL 沒食子酸、0.52 mg/mL 綠原酸、0.97 mg/mL沉香四醇、0.67 mg/mL 鞣花酸、1.74 mg/mL 丁香酚、0.29 mg/mL β-細(xì)辛醚、0.26 mg/mL α-細(xì)辛腦、0.56 mg/mL 甘草酸銨的混合對照品溶液1 mL，再按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算8 種成分的加樣回收率以及RSD 值，結(jié)果顯示，沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、丁香酚、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛腦、甘草酸銨的平均加樣回收率分別為 94.49%、100.43%、91.90%、94.66%、99.82%、95.85%、99.66%、97.34%，RSD 值分別為0.45%、0.42%、0.26%、0.64%、0.60%、1.37%、0.78%、1.95%，表明該方法具有良好的回收率。

2.2 相對校正因子（fs/i）的確定及耐用性考察

2.2.1fs/i的測定 取“2.1.2”項(xiàng)下混合對照品溶液進(jìn)樣分析，記錄各成分的峰面積，以丁香酚為內(nèi)參物，取多個(gè)質(zhì)量點(diǎn)計(jì)算所得的fs/i，取平均值作為定量用fs/i［fs/i＝fs/fi＝AsCi/AiCs，其中As為丁香酚對照品的峰面積，Cs為丁香酚對照品的質(zhì)量濃度，Ai為待測成分的峰面積，Ci為待測成分的質(zhì)量濃度］[5-7]。計(jì)算待測組分沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛腦、甘草酸銨的fs/i，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛腦、甘草酸銨與內(nèi)參物丁香酚之間的fs/i分別為0.433 4、1.068 3、0.505 6、0.141 6、0.429 0、0.346 2、1.748 8，RSD 值分別為0.77%、0.40%、0.90%、0.82%、0.61%、1.42%、1.69%。

2.2.2 不同色譜儀器和色譜柱對fs/i的影響 本實(shí)驗(yàn)考察了Agilent 1260 高效液相色譜儀器（美國）和LC-20A（20A）高效液相色譜儀（日本島津）對fs/i的影響，Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Inertsil ODS-3 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、BDS HypersilTMC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）對fs/i的影響，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，2 臺色譜儀器和3 根色譜柱測得各待測成分fs/i的RSD均小于2.0%，表明fs/i在不同色譜儀器和色譜柱下具有良好的耐用性。

2.2.3 不同柱溫對fs/i的影響 本實(shí)驗(yàn)考察了不同柱溫（25、30、35、40 ℃）對fs/i的影響，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，在不同柱溫測得各待測成分fs/i的RSD 均小于2%，表明fs/i在柱溫有波動(dòng)時(shí)具有良好的耐用性。

表2 ZSP 中7 種成分的fs/iTable 2 fs/i of seven components for ZSP

表3 不同色譜儀器和色譜柱對fs/i 的影響Table 3 Effects of different instruments and columns on fs/i

表4 不同柱溫對fs/i 的影響Table 4 Effects of different column temperatures on fs/i

2.2.4 不同體積流量對fs/i的影響 本試驗(yàn)考察了不同體積流量（0.8、1.0、1.2、1.4 mL/min）對fs/i的影響，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，在不同體積流量測得各待測成分fs/i的RSD 均小于2%，表明fs/i在體積流量有變化時(shí)具有良好的耐用性。

2.3 待測組分色譜峰定位

文獻(xiàn)對色譜峰的定位普遍采用相對保留時(shí)間和保留時(shí)間差來定位峰[8-11]。取混合對照品溶液，選取2 臺色譜儀器和3 根不同型號色譜柱，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以丁香酚為參照峰，計(jì)算其他7 種成分的相對保留時(shí)間（ti/s）和保留時(shí)間差（Δti/s）。結(jié)果見表6、7。

s 為內(nèi)參物，i為待測組分，t為保留時(shí)間

表6 的結(jié)果顯示，在相同色譜條件下，當(dāng)色譜柱發(fā)生變化時(shí)，沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸相對保留時(shí)間的RSD 值均大于5%，表明不能用相對保留時(shí)間定位色譜峰。

表7 的結(jié)果顯示，在相同色譜條件下，沒食子酸、鞣花酸、丁香酚、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛腦、甘草酸銨的保留時(shí)間差相差較大，其RSD 值均大于5%，表明不能用保留時(shí)間差定位色譜峰。

表5 體積流量對fs/i 的影響Table 5 Effects of volume flow rate on fs/i

表6 不同色譜柱測得的ti/sTable 6 ti/s of different columns

表7 不同色譜柱測得的Δti/sTable 7 Difference of retention time measured by different chromatographic columns

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用兩點(diǎn)校正法[12-13]定位色譜峰。精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對照品溶液7 μL，以確定的色譜條件分別在3 根色譜柱上測定，分別得到?jīng)]食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、丁香酚、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛腦、甘草酸銨的保留時(shí)間，以Agilent 1260 儀器和Inertsil ODS-3 色譜柱為標(biāo)準(zhǔn)儀器和標(biāo)準(zhǔn)色譜柱，以此儀器和色譜柱測定的沒食子酸和甘草酸銨的保留時(shí)間為橫坐標(biāo)（x），其他儀器和色譜柱測定的沒食子酸和甘草酸銨的保留時(shí)間為縱坐標(biāo)（y），分別建立線性方程，再將標(biāo)準(zhǔn)儀器和標(biāo)準(zhǔn)色譜柱上的綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、丁香酚、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛腦的保留時(shí)間為自變量，分別代入各對應(yīng)色譜柱線性方程中，求得綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、丁香酚、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛腦在相應(yīng)的各色譜柱上的理論預(yù)測保留時(shí)間，將計(jì)算得到的各待測組分理論預(yù)測保留時(shí)間與該組分在相應(yīng)柱上實(shí)測的保留時(shí)間差為絕對誤差（absolute error，AE，AE＝測量值－真實(shí)值），結(jié)果見表8。結(jié)果顯示，在色譜條件相同，色譜儀器和色譜柱不同時(shí)，沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、丁香酚、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛腦、甘草酸銨的實(shí)測保留時(shí)間與理論預(yù)測保留時(shí)間的差值較小，故本實(shí)驗(yàn)用兩點(diǎn)校正法來定位色譜峰。

表8 不同儀器和色譜柱時(shí)預(yù)測出峰時(shí)間Table 8 Peak time with different instruments and different chromatographic columns

2.4 QAMS 法與外標(biāo)法結(jié)果對比

取2.0 g ZSP 樣品粉末，精密稱定9 份，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄峰面積，采用QAMS 法建立內(nèi)參物丁香酚與沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛腦、甘草酸銨的相對校正因子，對9 個(gè)批號ZSP 樣品中各成分含量進(jìn)行計(jì)算，同時(shí)采用外標(biāo)法對沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛腦、甘草酸銨成分進(jìn)行含量測定，并以相對誤差（relative error，RE）為參數(shù)對2 種方法所得結(jié)果進(jìn)行比較[14]，結(jié)果見表9。結(jié)果顯示，QAMS 法與外標(biāo)法所測定結(jié)果之間差異的RE 均小于5%，表明2 種方法測之間差異較小，所以本實(shí)驗(yàn)之前建立的fs/i準(zhǔn)確可靠，可以用于測定蒙藥ZSP 中沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、丁香酚、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛腦、甘草酸銨的含量。

3 討論

3.1 蒙藥ZSP 測定指標(biāo)成分的選定

蒙藥ZSP含量測定指標(biāo)及其測定方法文獻(xiàn)已有報(bào)道，但所選擇的測定指標(biāo)均為一種藥材中的一種或者多種指標(biāo)。本研究建立了多種藥材中的多指標(biāo)成分測定方法，采用高效液相色譜法同時(shí)測定了沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、丁香酚、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛腦、甘草酸銨的含量，用以表征蒙藥ZSP 的質(zhì)量，能更加全面地反映安全質(zhì)量。

3.2 供試品制備條件的選定

本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑（甲醇、75%甲醇、乙腈），超聲時(shí)間（25、35、45 min），以所測8 個(gè)成分的提取效率為指標(biāo)，最終確定ZSP 供試品溶液的制備方法為以甲醇為提取溶劑、超聲提取時(shí)間為35 min，過濾紙過濾方法來處理供試品。

表9 QAMS 法與外標(biāo)法測得9 批ZSP 中8 種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù) (n = 9)Table 9 Content of four constituents in three batches of ZSP by QAMS and external reference method (n = 9)

3.3 色譜條件的選定

在流動(dòng)相條件摸索中，考察了甲醇-水、甲醇- 0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液、甲醇- 0.1%磷酸水溶液流動(dòng)相體系，以ZSP 中所測8 種成分的分離效果為指標(biāo)，最終確定以甲醇為流動(dòng)相C、以0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相D，考察不同體積流量（0.8、1.0、1.2、1.4 mL/min）、不同柱溫（25、30、35、40 ℃）、不同進(jìn)樣量（5、7、10、15、20 μL），在保證各色譜峰分離度的前提下，盡量縮短分析時(shí)間，確定最終條件為甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫，體積流量1.0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量7 μL。

3.4 檢測波長的選定

蒙藥復(fù)方制劑所含成分復(fù)雜，各成分的最大吸收波長不同，當(dāng)采用某一個(gè)固定波長時(shí)，難以確保所測出各成分的靈敏度和精密度、獲得最大吸收，影響定量測定結(jié)果[15]。本實(shí)驗(yàn)采用DAD 檢測器在190～400 nm 進(jìn)行光譜掃描，對不同波長下檢測得的三維圖譜進(jìn)行分析對比。結(jié)果顯示，沒食子酸的最大吸收波長為271 nm、綠原酸與沉香四醇的最大吸收波長為252 nm、鞣花酸的最大吸收波長為254 nm、丁香酚的最大吸收波長為281 nm、β-細(xì)辛醚與α-細(xì)辛腦的最大吸收波長為257 nm，甘草酸銨的最大吸收波長為237 nm。為了使各成分在同一色譜圖中均被采集，故采用VWD 檢測器切換波長法進(jìn)行含量測定[16]。

3.5 內(nèi)參物的選定

建立一測多評法中選定好內(nèi)參物是很重要，選定內(nèi)參物的標(biāo)準(zhǔn)是易得、價(jià)廉、有效者、峰面積和保留時(shí)間穩(wěn)定、供試品中的含量高，故本實(shí)驗(yàn)選定丁香酚為內(nèi)參物[17]。

3.6 色譜峰定位法的選定

各待測成分色譜峰的準(zhǔn)確定位是一測多評法成功應(yīng)用的關(guān)鍵之一。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[18]，大多數(shù)采用相對保留時(shí)間和保留時(shí)間差法定位待測成分色譜峰。本實(shí)驗(yàn)當(dāng)中考察了相對保留時(shí)間法和保留時(shí)間差法、兩點(diǎn)校正法在不同廠家儀器和色譜柱中的重現(xiàn)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在不同色譜儀和不同色譜柱測得的各待測成分出峰時(shí)間有所不同，相對保留時(shí)間法和保留時(shí)間差法的RSD 均大于5%，故不適合對本實(shí)驗(yàn)一測多評法色譜峰定位。采用兩點(diǎn)校正法進(jìn)行定位色譜峰時(shí)，所得各待測成分色譜峰實(shí)測保留時(shí)間與預(yù)測保留時(shí)間差值較小，最終本實(shí)驗(yàn)選定采用兩點(diǎn)校正法定位待測成分色譜峰。

本實(shí)驗(yàn)建立QAMS 法同時(shí)測定ZSP（9 個(gè)批次）中8種成分的含量，對QAMS法的可行性進(jìn)行探討，結(jié)果表明QAMS 法測得結(jié)果與外標(biāo)法法測得結(jié)果沒有顯著差異，表明在對照品難以得到的情況下可以通過測定蒙藥ZSP中丁香酚的含量來計(jì)算出其他7 種成分的含量，實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)同步質(zhì)量控制，反映蒙藥ZSP 的質(zhì)量。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突