Box-Behnken響應面法優(yōu)化白藜蘆醇Labrasol/P407混合膠束處方工藝及體外評價

韓德恩 ，申延利，田 萍，位恒超，祝俠麗，賈永艷 *

1.河南中醫(yī)藥大學藥學院，河南 鄭州 450046

2.河南省中藥特色炮制技術工程研究中心，河南 鄭州 450046

3.河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004

白藜蘆醇（resveratrol）是一種天然脂溶性的非黃酮類多酚化合物，廣泛存在于葡萄、桑葚、虎杖、決明等多種植物之中[1]。白藜蘆醇具有抗腫瘤[2-4]、抗氧化[5]、抗衰老[6]、保護心血管[7]等作用，具有很好的藥用價值和保健功能。但白藜蘆醇在水中的溶解度低、穩(wěn)定性差、代謝消除快、生物利用度低，嚴重限制其應用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇是尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（uridine diphosphate glucuronidase transferase，UGT）的底物，在腸道和肝臟發(fā)生葡萄糖醛酸化代謝，生成白藜蘆醇-葡萄糖苷酸結合物，導致極低的白藜蘆醇血藥濃度，生物利用度不足1%[9-11]。

聚合物膠束具有特殊的“核-殼”結構，可增加藥物的溶解度，進一步提高藥物的生物利用度，因此被廣泛應用于難溶性藥物的口服給藥系統(tǒng)[12-14]。然而單一聚合物形成的膠束體系存在載藥量低、穩(wěn)定性差、稀釋不穩(wěn)定等諸多問題[15-17]。近年來，由不同嵌段聚合物[18]、聚合物/表面活性劑[19]或聚離 子復合物[20]組成的混合膠束，發(fā)揮多種材料的協(xié)同作用，使膠束具有更大的穩(wěn)定性、更高的載藥量和更強的抗稀釋能力，引起越來越多的關注。李金鳳等[21]制備的泊洛沙姆403/407 混合聚合物膠束，提高白藜蘆醇溶解度約197 倍，且具有很強的抗稀釋能力和顯著的緩釋效果，然而目前仍缺乏有效的方法來克服白藜蘆醇口服給藥的首關代謝效應。辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（Labrasol）為非離子型表面活性劑，對口服難溶性藥物有極強的增溶能力[22-23]。且已有研究表明，Labrasol 可抑制白藜蘆醇葡萄糖醛酸化代謝，提高白藜蘆醇的口服生物利用度約5.6倍[24]。泊洛沙姆407（P407）是一種兩親性的三嵌段共聚物，具有較強的親水性、良好的生物相容性、低免疫原性等優(yōu)點，常被用作聚合物膠束或混合膠束的載體材料[25]。

本實驗選用Labrasol 和P407 作為載體材料，采用薄膜分散-探頭超聲法制備Res-Labrasol/P407混合膠束（Res-Labrasol/P407-MM），以期望通過膠束增溶與Labrasol 抑制UGT 代謝的雙重作用提高白藜蘆醇的溶解度與生物利用度，從而更好地發(fā)揮白藜蘆醇的藥效作用。采用Box-Behnken 響應面法優(yōu)化Res-Labrasol/P407-MM 的最佳處方，并對其外觀形態(tài)、粒徑分布、Zeta 電位、體外釋放進行評價。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695 高效液相色譜儀，美國沃特世科技（上海）有限公司；MS105DU 十萬分之一分析天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；斜式N-1100S-W旋轉蒸發(fā)儀，埃朗科技國際貿(mào)易（上海）有限公司；UPD-Ⅱ-107 優(yōu)普系列超純水機，成都超純科技有限公司；JY92-IIN 超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；SHA-C 型水浴振蕩器，鞏義市予華儀器有限公司；HJ-4D 數(shù)顯恒溫測速磁力加熱攪拌器，江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所；VORTEX3旋渦混勻器，德國IKA 公司；DZF-6020 型真空干燥箱，寧波江南儀器廠；JW-3021HR 低溫高速離心機，安徽嘉文儀器裝備有限公司；Nano-ZS90 電位及粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；Tecnai F30 高分辨透射電子顯微鏡（TEM），荷蘭Philips- FEI 公司；FD-1A50 真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；DSC1 差示掃描量熱儀，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 試劑

Labrasol，批號N1805070014，南京都萊生物技術有限公司；P407，批號196801，大連美侖生物技術有限公司；白藜蘆醇對照品，批號wkq180608，質(zhì)量分數(shù)＞98%，購自四川省維克奇生物科技有限公司；甲醇、乙腈，美國賽默飛世爾科技有限公司；透析袋MD25，截留相對分子質(zhì)量8000～14 000，北京索萊寶生物科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 Res-Labrasol/P407-MM 與Labrasol/P407-MM的制備

采用薄膜分散-探頭超聲法制備Res-Labrasol/ P407-MM。精密稱取適量白藜蘆醇、P407、Labrasol于50 mL 圓底燒瓶中，加入10 mL 甲醇超聲使其完全溶解，40 ℃減壓旋轉蒸發(fā)除去甲醇，減壓真空干燥2 h（30 ℃）以除去殘留溶劑并形成干燥透明分散薄膜。在40 ℃水浴條件下水化洗膜10 min，探頭超聲（260 W，工作3 s，間歇3 s）5 min 使其分散均勻。于4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，濾液即為藍色透明的 Res-Labrasol/P407-MM，同法制備空白膠束Labrasol/P407-MM（不含白藜蘆醇）。按《中國藥典》2020年版甲醇量檢測法測定以上樣品，甲醇體積分數(shù)＜0.05%。

2.2 白藜蘆醇載藥量、包封率測定

HPLC 法測定載藥膠束中的白藜蘆醇含量[26]。色譜柱為Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長306 nm；流動相為甲醇-水（55∶45）；柱溫25 ℃；體積流量1 mL/min；進樣量10 μL。在該條件下理論塔板數(shù)大于3000。

精密量取Res-Labrasol/P407-MM 溶液1 mL 于10 mL 棕色量瓶中，加入甲醇9 mL，細胞破碎儀超聲2 min（功率200 W，工作3 s，間歇3 s）。吸取超聲后甲醇溶液1 mL 置于低溫高速離心機中，15 000 r/min 離心10 min，取上清液注入HPLC，測定膠束中白藜蘆醇含量，圖1 顯示空白膠束對白藜蘆醇含量測定無干擾，專屬性良好。

取2 mL 的Res-Labrasol/P407-MM 溶液置于低溫高速離心機中，15 000 r/min 離心30 min，用蒸餾水超聲分散沉淀的膠束，重復離心3 次，最后用0.22 μm 微孔濾膜濾過，分別按如下公式計算包封率和載藥量[27]。

W1為測得的游離白藜蘆醇含量，W2為白藜蘆醇總投藥量，W3為Res-Labrasol/P407-MM 總量

圖1 空白膠束 (A)、白藜蘆醇對照品 (B) 和Res-Labrasol/ P407-MM (C) HPLC 圖Fig.1 HPLC of blank micelle (A), resveratrol (B) and Res-Labrasol/P407-MM (C)

2.3 藥物沉降率測定

藥物沉降率是指在一定條件下一定時間內(nèi)從膠束制劑中析出藥物的量，用于評價制劑的穩(wěn)定性[28]。將所制備的膠束置于4 ℃下放置48 h，12 000 r/min離心10 min，分離析出的藥物，取適量上清液，加甲醇稀釋至適當倍數(shù)，按“2.2”項下進樣測定藥物含量，計算藥物沉降率。

沉降率＝(新制備膠束中的藥物含量－放置48 h 離心后膠束中的藥物含量)/新制備膠束中的藥物含量

2.4 單因素考察

2.4.1 Labrasol與P407的比例考察 載體材料總量為200 mg，白藜蘆醇投藥量為40 mg，甲醇與水化體積均為10 mL，其他條件同“2.1”項下，考察P407占載體材料的質(zhì)量比分別為0.25、0.50、0.75 時對粒徑、載藥量和包封率的影響。結果顯示，隨著P407比例的增大，膠束的粒徑逐漸減小但穩(wěn)定性下降，載藥量和包封率均呈現(xiàn)先增加后基本不變的趨勢。綜合考慮各因素，當Labrasol 與P407 比例為1∶1時，得到的膠束粒徑較小，載藥量和包封率較高，且樣品穩(wěn)定性良好。因此，確定Labrasol 與P407比例為1∶1 進行后續(xù)Box-Behnken 響應面法實驗。

2.4.2 投藥量考察 固定載體材料Labrasol與P407均為100 mg，甲醇與水化體積均為10 mL，其他條件同“2.1”項下，考察白藜蘆醇投藥量為30、35、40、45 mg 時對粒徑、載藥量和包封率的影響。結果顯示，隨著投藥量增加，膠束粒徑和載藥量隨投藥量的增加而增大，包封率隨投藥量的增大而減小；當投藥量為45 mg 時，膠束的包封率急劇下降，載藥量也有所減小。綜合以上考察，將投藥量20～40 mg 設為待優(yōu)化項進行Box-Behnken 響應面法實驗。

2.4.3 旋蒸溫度考察 固定載體材料Labrasol 與P407 均為100 mg，白藜蘆醇投藥量為30 mg，甲醇與水化體積均為10 mL，其他條件同“2.1”項下，考察30、40、50、60 ℃水浴條件對粒徑、載藥量和包封率的影響。結果顯示，旋蒸溫度對膠束粒徑、載藥量和包封率影響不大；但旋蒸溫度為60 ℃時，載藥量和包封率明顯減小。綜合考慮，確定旋蒸溫度為40 ℃進行后續(xù)Box-Behnken 響應面法實驗。

2.4.4 水化洗膜溫度考察 固定載體材料Labrasol與P407 均為100 mg，Res 投藥量為30 mg，甲醇與水化體積均為10 mL，其他條件同“2.1”項下，考察30、40、50、60、70 ℃水浴條件對粒徑、載藥量和包封率的影響。結果顯示，隨著水化溫度的提高，膠束粒徑變化不大，載藥量和包封率逐漸增大；但到70 ℃時，載藥量和包封率開始下降。因此，將40～60 ℃設為待優(yōu)化項進行Box-Behnken 響應面法實驗。

2.4.5 水化體積考察 固定載體材料Labrasol 與P407 均為100 mg，白藜蘆醇投藥量為40 mg，甲醇為10 mL，其他條件同“2.1”項下，考察水化體積分別為8、10、12 mL 時對粒徑、載藥量和包封率的影響。結果顯示，水化體積對粒徑、載藥量和包封率的影響較大；隨著水化體積的增加，膠束粒徑逐漸減小，載藥量和包封率逐漸增加。因此將8～12 mL 的水化體積作為待優(yōu)化項進行Box-Behnken響應面法實驗。

2.5 Box-Behnken 響應面法優(yōu)化處方

在單因素實驗結果的基礎上選擇投藥量（X1）、水化體積（X2）和水化溫度（X3）為考察因素，低、中、高3 個水平，以膠束樣品的質(zhì)量濃度（Y1）和藥物沉降率（Y2）為評價指標進行Box-Behnken 響應面法實驗設計[29]。Box-Behnken 試驗設計方案和結果見表1。

表1 Box-Behnken 響應面法實驗設計及結果Table 1 Design and results of Box-Behnken response surface method

通過Design-Expert 8.0.6 軟件，對表1 數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到2 項式擬合方程。F值與相關系數(shù)（R2）結果表明方程的擬合效果準確可靠，使用模擬方程代替真實的實驗點進行結果預測是可行的，2 項式擬合方程如下：Y1＝2.63＋0.89X1－0.65X2－0.086X3－0.10X1X2＋0.013X1X3＋0.025X2X3＋5.003X12＋0.27X22－0.022X32，F(xiàn)＝140.79，R2＝0.989 0；Y2＝8.56＋21.17X1－3.94X2＋2.36X3＋1.84X1X2－5.15X1X3－0.23X2X3＋18.63X12＋2.23X22＋2.28X32，F(xiàn)＝31.41，R2＝0.951 3。

回歸模型的方差分析結果見表2。P＜0.05 表明考察因素對于響應值具有顯著性。進一步分析各方程中的各項，X1、X2、X3、X22對Y1有顯著性影響；X1、X2、X12對Y2有顯著性影響。應用Design-Expert 8.0.6 軟件繪制不同考察因素對于各響應值的3D 響應面圖。3D 響應面圖可用來評價各考察因素之間的交互作用以及確定各因素的最佳范圍。不同考察因素對Y1、Y2的影響結果如圖2 所示。綜合考慮上述Box-Behnken 模型擬合與分析結果，期望得到質(zhì)量濃度較大同時沉降率較小的白藜蘆醇混合膠束。通過Design-Expert 8.0.6 軟件的優(yōu)化模塊得到白藜蘆醇混合膠束的最優(yōu)處方為白藜蘆醇投藥量28 mg，水化體積9 mL，水化溫度40 ℃；預測樣品質(zhì)量濃度為2.91 mg/mL，沉降率為6.66%，載藥量為11.58%，包封率為93.54%。

表2 回歸模型方差分析Table 2 Variance analysis of regression model

2.6 最優(yōu)處方的驗證試驗

按照上述最優(yōu)處方條件制備3 批Res-Labrasol/ P407-MM，測定白藜蘆醇質(zhì)量濃度、沉降率、膠束粒徑，根據(jù)白藜蘆醇濃度計算載藥量和包封率。結果見表3，平均載藥量為11.62%、平均包封率為93.96%、膠束平均粒徑為69.00 nm，樣品質(zhì)量濃度和沉降率的實測值與預測值偏差較小，RSD 在5.5%以內(nèi)，表明模型預測性良好，制備工藝穩(wěn)定。

2.7 Res-Labrasol/P407-MM 膠束的表征

2.7.1 粒徑分析 取Res-Labrasol/P407-MM 膠束溶液5 mL，適當稀釋，采用Nano ZS90 電位及粒度分析儀測定膠束的粒徑、聚合物分散性指數(shù)（PDI）及Zeta 電位（圖3）。Res-Labrasol/P407-MM 膠束平均Zeta 電位為（-21.25±0.18）mV，平均粒徑為（69.00±1.58）nm，PDI 為0.25±0.03。結果表明，膠束帶負電荷，且粒徑分布均勻。

2.7.2 微觀形態(tài)觀察 膠束外觀見圖4-a，白藜蘆醇混懸液（左）明顯有懸浮藥物顆粒和藥物沉淀；Res-Labrasol/P407-MM（右）可見溶液呈藍色乳光，澄清透明。TEM觀察膠束粒子形態(tài)。將Res-Labrasol/ P407-MM 溶液適當稀釋后滴至銅網(wǎng)上，晾干后用 2%磷鎢酸染色，染色15 s 后吸取多余的溶液，自然晾干，TEM 觀察，結果見圖4-b，載藥膠束呈類球形，大小均勻，并具有膠束經(jīng)典的核-殼結構。

圖2 各因素對考察指標的效應面圖Fig.2 Effects of factors on response surface

表3 最優(yōu)處方的驗證試驗Table 3 Three batches samples for verification of optimized formulation

圖3 載藥膠束粒徑分布 (a) 與Zeta 電位 (b)Fig.3 Particle size distribution (a) and Zeta potential (b) of resveratrol micelles

圖4 載藥膠束外觀 (a) 和透射電鏡 (b) 圖Fig.4 Appearance (a) and TEM image (b) of resveratrol micelles

2.8 Res-Labrasol/P407-MM 體外釋放

采用動態(tài)透析法研究Res-Labrasol/P407-MM的體外釋放行為。取2 mL 載藥膠束溶液置于透析袋中（截留相對分子質(zhì)量為8000～12 000），將透析袋密封后分別置于裝有150 mL 人工胃液和人工腸液中的錐形瓶中。白藜蘆醇在水中的溶解度極低，為保證釋放藥物在釋放介質(zhì)中能夠被完全溶解，本實驗人工胃液和人工腸液含有0.5%聚山梨酯-80。置于37 ℃、100 r/min 水浴搖床中震搖，0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h 取樣2 mL，并及時補加等體積等溫度的釋放介質(zhì)。用相同的方法測定3 次，繪制膠束體外累積釋藥曲線（圖5）。結果顯示，白藜蘆醇混懸液在4 h 時釋放達到76%，Res-Labrasol/ P407-MM 在12 h 處釋放達到最大88%，之后釋藥量略微增加，緩慢釋放達到24 h。表明Res-Labrasol/ P407-MM 具有明顯的緩釋效應。

圖5 白藜蘆醇體外釋放曲線 (n = 3)Fig.5 In vitro release curves of resveratrol (n = 3)

3 討論

制備膠束常用的方法有薄膜分散法、直接溶解法、乳化-溶劑揮發(fā)法、透析法、微相分離法等。薄膜分散法制備過程簡單易操作，重現(xiàn)性好，所得膠束載藥量和包封率較高。將水化液進行探頭超聲處理，載藥通過疏水作用吸附于材料疏水段，將藥物包載其中，進一步發(fā)生鏈間糾纏，締合形成穩(wěn)固結構的膠束。超聲能夠極大程度地將水化液分散成較小的納米粒子，得到粒徑小且分布均勻的混合膠束。納米顆粒的粒徑是評價藥物制劑的關鍵指標之一，口服聚合物納米顆粒粒徑通常小于100 nm。本研究采用薄膜分散-探頭超聲法制備白藜蘆醇聚合物混合膠束，粒徑約69 nm，符合膠束制劑要求。

在制備過程中，首先通過單因素試驗考察非連續(xù)變量載體材料比例和成膜溫度，確定Labrasol/ P407 比例為1∶1，成膜溫度為40 ℃。采用Box- Behnken 響應面法優(yōu)化對膠束制備工藝影響較大的因素，投藥量、水化體積和水化溫度，得到最優(yōu)的處方制備工藝。在Box-Behnken 設計處方優(yōu)化實驗中，改用樣品濃度、沉降率為評價指標，而未將包封率、載藥量、粒徑作為指標，原因在于：在單因素考察實驗中發(fā)現(xiàn)，制備得到的膠束粒徑均較小且分布均勻，包封率及載藥量均較高。而本研究的關鍵是要得到增溶倍數(shù)高、穩(wěn)定性好的膠束體系，因此直接以樣品濃度和沉降率為評價指標，更便于篩選出符合要求的最優(yōu)處方。樣品濃度的高低直接反映白藜蘆醇溶解度的提高倍數(shù)，沉降率則直接反映膠束的穩(wěn)定性。濃度越大，沉降率越小，則得到的膠束制劑溶解度越大，穩(wěn)定性越好。

采用動態(tài)透析法考察載藥膠束的體外釋放行為。白藜蘆醇是從植物中提取分離出的天然產(chǎn)物，水溶性極差[30]，難以達到釋放的漏槽條件，經(jīng)文獻調(diào)研[31]及實驗考察，本實驗人工胃液和人工腸液含有0.5%聚山梨酯-80。體外釋放曲線可知，Res- Labrasol/P407-MM 具有顯著的緩釋效果。緩釋效果可能是由于白藜蘆醇的多羥基與載體材料結構上的羰基形成了氫鍵，致使藥物從膠束的疏水核心擴散到釋放介質(zhì)的過程更加緩慢，保證藥物不發(fā)生嚴重滲漏，從而達到持續(xù)給藥、提高藥物吸收量的目的。

綜上所述，本研究通過單因素實驗與Box- Behnken 響應面法實驗得到Res-Labrasol/P407 的最優(yōu)處方，成功制備了載藥膠束，與白藜蘆醇混懸液相比具有明顯緩釋特征。后繼本課題組采用外翻腸囊法評估Res-Labrasol/P407-MM 對白藜蘆醇葡萄糖醛酸化代謝的影響，并探討其在大鼠體內(nèi)的藥動學過程。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突