千年健萜類化學(xué)成分及其細(xì)胞毒活性研究

楊仁勇，王云濤，王夢(mèng)然，田 露，劉曉菡，杜玉慶，姜 艷，王春華，馬 麗，趙 峰*

1.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，國(guó)家中醫(yī)藥管理局方劑效應(yīng)與臨床評(píng)價(jià)重點(diǎn)研究室，山東 煙臺(tái) 264003

2.煙臺(tái)市口腔醫(yī)院，山東 煙臺(tái) 264001

千年健Homalomena occulta(Lour.) Schott.為天南星科千年健屬植物，本屬植物約140 種，分布于熱帶亞洲和美洲，我國(guó)有3 種，主要分布于廣東、廣西、云南和海南。千年健的干燥根莖入藥，為瑤族群眾所習(xí)用，治療風(fēng)濕腰腿痛、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、胃痛、腸胃炎、骨折、外傷出血等癥[1]。自2000年收載入《中國(guó)藥典》，用于祛風(fēng)濕、壯筋骨，治療風(fēng)寒濕痹、腰膝冷痛、拘攣麻木、筋骨痿軟[2]。研究報(bào)道，該植物的主要次級(jí)代謝產(chǎn)物為揮發(fā)油和倍半萜，以及少量的生物堿、酚酸和三萜類成分。揮發(fā)油主要含芳樟醇、松油烯-4-醇、α-松油醇等單萜類，顯示出抗氧化和殺線蟲(chóng)活性[3-4]。近年來(lái)從千年健中發(fā)現(xiàn)了10 余種骨架類型的倍半萜，包括杜松烷型、桉烷型、愈創(chuàng)木烷型、isodaucane 型，以及天然來(lái)源較為少見(jiàn)的oplopanane、oppositane 和axane 等結(jié)構(gòu)類型的倍半萜，它們顯示出細(xì)胞毒和抑菌活性，尤其是能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，抑制脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子一氧化氮（NO）、環(huán)氧化酶2 （cyclooxygenase，COX-2）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2），具有潛在的抗骨質(zhì)疏松和抗炎活性，是千年健的主要有效成分[5-12]。為了繼續(xù)研究千年健的活性成分，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用多種色譜學(xué)方法，從千年健乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部位得到11 個(gè)萜類化合物（圖1），包括2 個(gè)單萜：千年健烯A（homalomene A，1）、3,7-二甲基-1-辛烯- 3,6-二醇（3,7-dimethyl-1-octene-3,6-tetraol，2）；5個(gè)桉烷型倍半萜：4(15)-eudesmene-1β,6α-diol（3）、菠蘿香藤素（ananosmin，4）、1β,4α-dihydroxy-11,12, 13-trinor-8,9-eudesmen-7-one （ 5 ）、 1β,4β,7α- trihydroxyeudesmane（6）、mucrolidin（7）；1 個(gè)oppositane 型倍半萜：bullatantriol（8）；1 個(gè)杜松烷型倍半萜：cadinane-4β,5α,10α-triol（9）；和2 個(gè)isodaucane 型倍半萜：4α-hydroxy-homalomenol C（10）、(1R,4S,5S,6S,7S,10R)-isodauc-6,7,10-triol（11）。其中，化合物1 為新化合物，化合物2 為新天然產(chǎn)物，化合物3～5 為首次該屬植物分離得到，化合物10 為首次從該植物分離得到。通過(guò)單晶X-射線衍射技術(shù)進(jìn)一步確定了化合物11 的立體構(gòu)型。化合物5～7 和9～11 顯示出中等強(qiáng)度或弱細(xì)胞毒活性，其中化合物10 的活性最好，對(duì)測(cè)試的3 種人肝癌腫瘤細(xì)胞株HepG2、SMMC-7721 和QGY-7703 的半數(shù)抑制濃度（IC50）值分別為（37.56±6.73）、（33.39±2.75）和（44.24±5.15）μmol/L。

圖1 千年健中萜類化合物的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of terpenoids from H.occulta

1 儀器與材料

Avance III 500 MHz 或Avance III HD 600 MHz核磁共振儀（德國(guó)Bruker 公司）；iS50 紅外光譜儀、Q Exactive Focus 高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛世爾公司）；安捷倫1100 Series LC-MSD-Trap-SL 或Agilent 6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS 型質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；Autopol III 型旋光儀（美國(guó)Rudolph 公司）；Synergy H1 酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek 公司）；Waters 600 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；柱色譜硅膠（青島海洋化工廠）；制備及分析薄層色譜板（煙臺(tái)江友硅膠發(fā)展有限公司）；凝膠Sephadex LH-20（GE Pharmacia 公司，美國(guó)）；Rp C18色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm，北京慧德易科技有限責(zé)任公司）；鹽酸阿霉素（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)S0702A）；所用試劑均為分析純或色譜純（廣東汕頭西隴科學(xué)股份有限公司）。

千年健藥材購(gòu)自河北省安國(guó)中藥市場(chǎng)，經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院王櫻霖教授鑒定為千年健H.occulta(Lour.) Schott，標(biāo)本（S-QNJ-2010）保存于濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院。

2 方法

2.1 提取與分離

取干燥的千年健根9 kg，粉碎，用95%乙醇室溫超聲波輔助提取3 次，提取液減壓蒸干得浸膏400 g。浸膏加適量蒸餾水，充分分散后，用醋酸乙酯萃取3 次，減壓蒸干得到醋酸乙酯萃取部分198 g。

醋酸乙酯萃取部分用硅膠（100～200 目）柱色譜分離，石油醚-丙酮（10∶0、10∶0.5、10∶1、2∶1、1∶1）梯度洗脫，得到6 個(gè)部分（Fr.1～6）。Fr.3（45.5 g）用硅膠柱色譜分離，石油醚-醋酸乙酯（10∶1、10∶2、2∶1、1∶1、0∶1）洗脫，得到4個(gè)部分Fr.3-1～3-4。Fr.3-3 用丙酮重結(jié)晶得到化合物8（2.1 g）。Fr.4（23 g）用硅膠柱色譜進(jìn)一步純化，石油醚-丙酮（100∶0→0∶100）梯度洗脫，得到20 個(gè)部分Fr.4-1～Fr.4-20。Fr.4-3（0.15 g）用Sephadex LH-20 凝膠柱色譜分離，石油醚-氯仿-甲醇（5∶5∶1）洗脫，得到10 個(gè)部分。Fr.4-3-7 用制備薄層色譜純化，氯仿-丙酮（3∶1）作展開(kāi)劑，得到化合物4（20 mg）。Fr.4-4（0.2 g）用Sephadex LH-20 凝膠柱色譜分離，石油醚-氯仿-甲醇（5∶5∶1）洗脫，得到10 個(gè)部分。Fr.4-4-5 用丙酮重結(jié)晶得到化合物7（9.1 mg）。Fr.4-4-6 用制備薄層色譜純化，氯仿-丙酮（4∶1）作展開(kāi)劑，得到化合物1（3 mg）。Fr.4-4-10 用Sephadex LH-20 凝膠柱色譜純化，石油醚-氯仿-甲醇（5∶5∶1）洗脫，得到化合物11（18 mg）。Fr.4-6（1.2 g）用Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，石油醚-氯仿-甲醇（5∶5∶1）洗脫，得到5 個(gè)部分。Fr.4-6-2 用液相色譜純化，甲醇-水（70∶30，2 mL/min）洗脫得到化合物10（9.7 mg）。Fr.4-6-5 用制備薄層色譜純化，氯仿-丙酮（3∶1）作展開(kāi)劑，得到化合物3（2 mg）。Fr.4-9（2 g）用Sephadex LH-20 凝膠柱色譜分離，石油醚-氯仿-甲醇（5∶5∶1）洗脫，得到9 個(gè)部分。Fr.4-9-5 用半制備型液相色譜純化，甲醇-水（70∶30，2 mL/min）洗脫得到化合物9（8 mg）。Fr.4-9-6 用半制備型液相色譜純化，甲醇-水（65∶35，2 mL/min）洗脫得到化合物2（5 mg）和5（8 mg）。Fr.4-9-8經(jīng)丙酮重結(jié)晶得到化合物6（1.1 g）。

2.2 抗腫瘤活性評(píng)價(jià)

參照文獻(xiàn)報(bào)道方法[13]，應(yīng)用MTT 法測(cè)試了化合物對(duì) 3 株人肝癌 HepG2、SMMC-7721 和QGY-7703 細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。腫瘤細(xì)胞復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋藥物濃度為100、50、25、12.5、6.25、3.13 μmol/L。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，按照2×104個(gè)/孔、每孔100 μL 種板；培養(yǎng)12 h 后，棄上清，將各濃度藥物按每孔100 μL 體積加入細(xì)胞中，每濃度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔；對(duì)照組加含1% DMSO 的培養(yǎng)基。加藥培養(yǎng)24 h 后，棄上清，每孔加100 μL 無(wú)血清培養(yǎng)基配制的MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，棄上清，每孔加DMSO 150 μL，于微孔板振蕩器上震蕩10 min 后，用酶標(biāo)儀測(cè)得570 nm 處的吸光度（A）值并按照公式計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，菜用GraphPad Prism 5軟件計(jì)算IC50值。

細(xì)胞存活率＝A實(shí)驗(yàn)/A對(duì)照

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無(wú)色膠狀物，[α]20D＋33.0 (c0.15, MeOH)。HR-ESI-MS 給出準(zhǔn)分子離子峰m/z209.114 9 [M＋Na]+（計(jì)算值209.114 8，C10H18O3Na），提示其分子式為C10H18O3，不飽和度為2。紅外光譜顯示有羥基（3396 cm-1）和雙鍵（1681 cm-1）的特征吸收峰。1H-NMR 譜（表1）顯示1 個(gè)烯氫信號(hào)δH5.20 (1H, dq,J= 8.4, 1.2 Hz, H-6)，結(jié)合13C-NMR 給出的10 個(gè)碳信號(hào)以及不飽和度，提示化合物1 可能是單環(huán)單萜。1H-NMR 譜還給出2 個(gè)與烯鍵相連的甲基雙峰信號(hào)δH1.70 (3H, d,J= 1.2 Hz, CH3-8), 1.73 (3H, d,J= 1.2 Hz, 7-CH3)，1 個(gè)甲基單峰信號(hào)δH1.30 (3H, s, 3-CH3)，以及4 個(gè)與氧原子相連的碳上的質(zhì)子信號(hào)δH3.46 (1H, dd,J= 12.0, 5.0 Hz, H-1a), 3.57 (1H, dd,J= 12.0, 4.2 Hz, H-1b), 3.70 (1H, dd,J= 6.0, 4.2 Hz, H-2), 4.88 (1H, m, H-5)。其中，甲基與烯氫質(zhì)子間較小的偶合常數(shù)（J= 1.2 Hz），提示為烯丙位4J遠(yuǎn)程偶合，是連在雙鍵上的偕二甲基，結(jié)構(gòu)中存在 (CH3)2C=CH-片段。13C-NMR 譜共顯示10 個(gè)碳信號(hào)，結(jié)合HSQC 譜，確定為3 個(gè)甲基、2 個(gè)亞甲基（1 個(gè)連氧）、2 個(gè)連氧次甲基、1 個(gè)連氧季碳和2 個(gè)烯碳，并對(duì)直接相連的1H 和13C 信號(hào)進(jìn)行了準(zhǔn)確歸屬?；衔? 的1H-1H COSY 譜顯示2 個(gè)偶合系統(tǒng)，分別是 H2-1/H-2 和 H2-4/H-5/H-6/H-8 (H-10)，二者通過(guò)連氧季碳（C-3，δC78.8）相連，該連接方式經(jīng)HMBC 譜給出的遠(yuǎn)程相關(guān)信息進(jìn)一步確證。HMBC 譜中（圖2），H-1 與C-2 (δC88.0)、C-3 (δC78.8) 相關(guān)，H-9 與C-2、C-3、C-4 (δC47.0) 相關(guān)，H-4 與C-2、C-3、C-5 (δC74.3)、C-9 (δC21.5) 相關(guān)，H-6 與C-4、C-8 (δC24.5)、C-10 (δC16.8) 相關(guān)，H-8 和H-10 與C-6 (δC125.5)、C-7 (δC135.5) 相關(guān)。H-2 與C-5 間的HMBC 遠(yuǎn)程相關(guān)表明C-2 與C-5 通過(guò)氧原子相連形成四氫呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)，可能是由月桂烷型無(wú)環(huán)單萜的2-OH 與5-OH 脫水縮合形成?；衔? 的相對(duì)構(gòu)型經(jīng)NOESY 譜確證，NOESY譜中（圖3），H-1 與H-9 相關(guān)，H-9 與H-4a 相關(guān)， H-4a 與H-6 相關(guān)，說(shuō)明它們?cè)谒臍溥秽h(huán)平面的同側(cè)，推測(cè)為α 構(gòu)型。H-2 與H-5 相關(guān)，H-5 與H-4b相關(guān)，提示他們?yōu)棣?構(gòu)型。因此，鑒定化合物1 的結(jié)構(gòu)如圖1 所示，命名為千年健烯A。

表1 化合物1 的氫譜和碳譜數(shù)據(jù) (600/150 MHz, CD3OD)Table 1 1H-NMR a nd 13C-NMR data of c ompound 1 (600/150 MHz, CD3OD)

圖2 化合物1 的主要1H-1H COSY 和HMBC 相關(guān)Fig.2 K ey 1H-1H C OSY an d HMBC c orrelations of compound 1

圖3 化合物1 的主要NOESY 相關(guān)Fig.3 Key NOESY correlations of compound 1

化合物3：白色無(wú)定形粉末，10%硫酸-乙醇溶液顯紫色。ESI-MSm/z: 239.1 [M＋H]+。1H-NMR (500 MHz, acetone-d6)δ: 0.66 (3H, s, H-14), 0.88 (3H, d,J= 6.8 Hz, H-12), 0.95 (3H, d,J= 6.8 Hz, H-13), 1.72 (1H, d,J= 10.8 Hz, H-5), 3.49 (1H, dd,J= 11.5, 3.9 Hz, H-1), 3.81 (1H, dd,J= 10.8, 9.5 Hz, H-6), 4.77 (1H, d,J= 1.5 Hz, H-15a), 4.94 (1H, d,J= 1.5 Hz, H-15b)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 79.5 (C-1), 32.4 (C-2), 35.5 (C-3), 146.8 (C-4), 56.3 (C-5), 67.5 (C-6), 49.8 (C-7), 18.7 (C-8), 36.7 (C-9), 42.2 (C-10), 26.4 (C-11), 16.6 (C-12), 21.7 (C-13), 12.1 (C-14), 108.4 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]，故鑒定化合物3 為4(15)-eudesmene-1β,6α-diol。

化合物4：白色無(wú)定形粉末，10%硫酸-乙醇溶液顯紫色。ESI-MSm/z: 257.1 [M＋H]+。1H-NMR (500 MHz, acetone-d6)δ: 4.35 (1H, dd,J= 11.4, 4.5 Hz, H-6), 3.27 (1H, dd,J= 9.8, 4.6 Hz, H-1), 1.71 (1H, d,J= 11.4 Hz, H-5), 1.30 (3H, s, H-15), 1.11 (3H, d,J= 6.7 Hz, H-12), 0.93 (3H, d,J= 6.7 Hz, H-13)；13C-NMR (125 MHz, acetone-d6)δ: 78.7 (C-1), 28.3 (C-2), 35.9 (C-3), 72.1 (C-4), 50.3 (C-5), 72.6 (C-6), 47.2 (C-7), 22.6 (C-8), 35.9 (C-9), 40.7 (C-10), 25.2 (C-11), 21.8 (C-12), 24.0 (C-13), 13.6 (C-14), 23.2 (C-15)。以上數(shù)據(jù)經(jīng)DEPT 譜和HMBC 譜進(jìn)行了準(zhǔn)確歸屬，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]，故鑒定化合物4為菠蘿香藤素。

化合物5：白色無(wú)定形粉末，10%硫酸-乙醇溶液顯灰黃色。ESI-MSm/z: 211.1 [M＋H]+。1H-NMR (500 MHz, acetone-d6)δ: 7.34 (1H, d,J= 10.0 Hz, H-9), 5.84 (1H, d,J= 10.0 Hz, H-8), 3.44 (1H, dd,J= 11.7, 4.2 Hz, H-1), 2.69 (1H, dd,J= 17.8, 14.2 Hz, H-6a), 2.49 (1H, ddd,J= 17.8, 3.8, 0.7 Hz, H-6b), 1.82 (1H, dd,J= 14.2, 3.8 Hz, H-5), 1.24 (3H, s, H-14), 1.17 (3H, s, H-15)；13C-NMR (125 MHz, acetone-d6)δ: 75.1 (C-1), 27.7 (C-2), 40.1 (C-3), 71.3 (C-4), 49.5 (C-5), 35.8 (C-6), 203.6 (C-7), 126.7 (C-8), 161.5 (C-9), 43.6 (C-10), 13.8 (C-14), 29.2 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17]，故鑒定化合物5 為1β,4α-dihydroxy-11,12,13-trinor-8,9-eudesmen- 7-one。

化合物6：白色無(wú)定形粉末，10%硫酸-乙醇溶液顯紫色。ESI-MSm/z: 257.1 [M＋H]+。1H-NMR (500 MHz, acetone-d6)δ: 3.20 (1H, dd,J= 12.3, 4.5 Hz, H-1), 1.08 (3H, s, H-15), 1.00 (3H, s, H-14), 0.94 (3H, d,J= 6.8 Hz, H-12), 0.93 (3H, d,J= 6.8 Hz, H-13)；13C-NMR (125 MHz, acetone-d6)δ: 78.9 (C-1), 27.2 (C-2), 40.0 (C-3), 70.3 (C-4), 44.8 (C-5), 28.8 (C-6), 72.3 (C-7), 29.4 (C-8), 34.6 (C-9), 38.9 (C-10), 39.3 (C-11), 16.5 (C-12), 16.6 (C-13), 11.1 (C-14), 29.4 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8,18]，故鑒定化合物6 為1β,4β,7α-trihydroxyeudesmane。

化合物7：白色無(wú)定形粉末，10%硫酸-乙醇溶液顯紫色。ESI-MSm/z: 257.1 [M＋H]+。1H-NMR (500 MHz, acetone-d6)δ: 3.88 (1H, dd,J= 12.8, 9.6 Hz, H-6), 3.13 (1H, dd,J= 11.4, 4.5 Hz, H-1), 1.02 (1H, d,J= 9.3 Hz, H-5), 1.45 (3H, s, H-15), 1.01 (3H, s, H-14), 0.90 (3H, d,J= 6.8 Hz, H-12), 0.84 (3H, d,J= 6.8 Hz, H-13)；13C-NMR (125 MHz, acetone-d6)δ: 78.4 (C-1), 27.2 (C-2), 41.5 (C-3), 71.1 (C-4), 56.9 (C-5), 68.5 (C-6), 51.9 (C-7), 18.4 (C-8), 37.9 (C-9), 40.8 (C-10), 25.7 (C-11), 20.7 (C-12), 15.3 (C-13), 12.7 (C-14), 34.1 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[19]，故鑒定化合物7 為mucrolidin。

化合物8：無(wú)色方晶，mp 179.1～181 ℃，10%硫酸-乙醇溶液顯灰黃色。ESI-MSm/z: 257.2 [M＋H]+。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ: 4.19 (1H, d,J= 4.4 Hz, 1-OH), 3.97 (1H, s, OH), 3.66 (1H, s, OH), 3.11 (1H, ddd,J= 11.4, 4.4, 4.4 Hz, H-1), 1.91 (1H, d,J= 13.5 Hz, H-5), 1.15 (3H, s, H-15), 1.10 (3H, s, H-12), 1.09 (3H, s, H-13), 0.89 (3H, s, H-14)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 78.7 (C-1), 40.5 (C-2), 41.5 (C-3), 70.3 (C-4), 59.2 (C-5), 32.1 (C-6), 51.8 (C-7), 32.5 (C-8), 28.5 (C-9), 47.1 (C-10), 70.6 (C-11), 31.8 (C-12), 30.6 (C-13), 15.2 (C-14), 30.5 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[20]，故鑒定化合物8 為bullatantriol。

化合物9：白色無(wú)定形粉末，10%硫酸-乙醇溶液顯紫色。ESI-MSm/z: 257.2 [M＋H]+。1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 3.49 (1H, brs, H-5), 2.07 (1H, m, H-11), 1.22 (3H, s, H-15), 1.09 (3H, s, H-14), 0.95 (3H, d,J= 6.9 Hz, H-12), 0.81 (3H, d,J= 6.9 Hz, H-13)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 43.5 (C-1), 19.79 (C-2), 32.2 (C-3), 71.1 (C-4), 72.2 (C-5), 39.2 (C-6), 41.6 (C-7), 20.7 (C-8), 41.6 (C-9), 71.9 (C-10), 25.0 (C-11), 14.2 (C-12), 20.7 (C-13), 20.2 (C-14), 27.0 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]，故鑒定化合物9 為cadinane-4β,5α,10α-triol。

化合物10：白色無(wú)定形粉末，10%硫酸-乙醇溶液顯紫色。ESI-MSm/z: 271.2 [M＋H]+。1H-NMR (500 MHz, acetone-d6)δ: 3.39 (1H, brs, H-6), 2.32 (1H, t,J= 1.6 Hz, H-5), 1.34 (3H, d,J= 0.5 Hz, H-15), 1.24 (3H, s, H-14), 0.98 (3H, d,J= 6.9 Hz, H-12), 0.92 (3H, d,J= 6.9 Hz, H-13)；13C-NMR (125 MHz, acetone-d6)δ: 53.1 (C-1), 33.4 (C-2), 37.7 (C-3), 87.1 (C-4), 58.5 (C-5), 81.0 (C-6), 68.4 (C-7), 33.4 (C-8), 32.8 (C-9), 105.4 (C-10), 33.1 (C-11), 17.3 (C-12), 16.3 (C-13), 22.6 (C-14), 26.1 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17]，故鑒定化合物10 為4α- hydroxy-homalomenol C。

化合物11：白色無(wú)定形粉末，10%硫酸-乙醇溶液顯紫色。ESI-MSm/z: 257.1 [M＋H]+。前期已報(bào)道該化合物的HRESIMS、1H-NMR、13C-NMR、HMBC 和NOESY 數(shù)據(jù)，通過(guò)與同時(shí)得到的化合物的旋光值和核磁數(shù)據(jù)比對(duì)，鑒定化合物 11 為 (1R,4S,5S,6S,7S,10R)-isodauc-6,7,10-triol[9,21]?；衔?1 與其對(duì)映異構(gòu)體的碳譜僅C-5、C-6、C-7、C-10和C-15 的化學(xué)位移稍有不同，為了排除二者僅部分手性碳構(gòu)型不同的可能性，應(yīng)用氯仿-甲醇（1∶1）反復(fù)重結(jié)晶得到了化合物11 的無(wú)色塊狀晶體，以Cu Kα 輻射為光源，經(jīng)單晶X-射線衍射法確證其立體構(gòu)型與前期鑒定的一致（圖4）?；衔?1 的單晶數(shù)據(jù)已上傳至CCDC，CCDC 號(hào)為1051601。

圖4 化合物11 的單晶ORTEP 圖Fig.4 X -ray ORTEP drawing of compound 11

化合物11 的單晶結(jié)構(gòu)：分子式2C15H28O3·CH3OH，含2 分子化合物11 和1 分子甲醇；相對(duì)分子質(zhì)量MR＝544.79，單斜晶系，P21空間群；晶胞參數(shù)a＝ 0.715 55(3) nm,b＝2.042 45(15) nm,c＝1.159 28(6) nm, α＝γ＝90°, β＝97.164(2)°;V＝1 681.3(7) nm3,T＝293(2) K, 晶胞內(nèi)分子數(shù)Z＝2,Dc＝1.076 mg/cm3,F(000)＝604。晶胞的衍射點(diǎn)數(shù) 5907 (3.84≤θ≤66.12)，可觀測(cè)的衍射點(diǎn)數(shù)4470 [I＞2σ(I)].可觀測(cè)衍射點(diǎn)的R為0.053 5，可觀測(cè)衍射點(diǎn)的RW為0.148 7，S 為1.052，F(xiàn)lack 因子是0.0(3)。

3.2 細(xì)胞毒活性結(jié)果

在濃度為100 μmol/L 時(shí)，化合物1～4、8 對(duì)3株人肝癌HepG2、SMMC-7721 和QGY-7703 細(xì)胞的抑制率均小于20%，無(wú)明顯的細(xì)胞毒作用。其他化合物表現(xiàn)出中等強(qiáng)度或弱細(xì)胞毒活性（表2），且有一定的選擇性，僅isodaucane 型倍半萜10、11對(duì) QGY-7703 顯示出抑制作用。對(duì) HepG2 和SMMC-7721 顯示抑制活性的化合物中，化合物10和11的活性最好，其IC50值為29.38～37.56 μmol/L。

表2 化合物5～7 和9～11 的細(xì)胞毒活性 ( ± s , n=3)Table 2 Cytotoxic activities of compounds 5—7 and 9—11 ( ± s , n=3)

表2 化合物5～7 和9～11 的細(xì)胞毒活性 ( ± s , n=3)Table 2 Cytotoxic activities of compounds 5—7 and 9—11 ( ± s , n=3)

化合物 HepG2 IC5 S 0/M(μ Mm Co l-·7L 7-21 1) QGY-7703 5 45.37±8.78 38.60.46±11.05 39.41.47±9.40 55±5.61 ＞100 6 35±5.37 ＞100 7 ＞100 ＞100 9 59.04±11.24 41.04±6.58 ＞100 10 37.56±6.73 33.39±2.75 44.24±5.15 11 33.22±6.25 29.38±8.49 62.98±7.91 鹽酸阿霉素 6.21±3.81 1.72±0.20 1.93±0.18

4 討論

千年健富含萜類成分，主要為低沸點(diǎn)的單萜揮發(fā)油和氧化度較高的倍半萜。倍半萜類成分顯示出更為多樣的骨架類型和能代表千年健傳統(tǒng)藥效的生物學(xué)活性，目前已報(bào)道10 余種骨架類型的倍半萜，它們對(duì)NO、COX-2 和PGE2等炎性因子的分泌具有顯著的抑制作用，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，可能是千年健的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究從千年健根莖分離得到2 個(gè)單萜和9 個(gè)倍半萜類化合物，其中化合物1 為新化合物，結(jié)構(gòu)中有1 個(gè)四氫呋喃環(huán)，可能是由月桂烷型無(wú)環(huán)單萜的2-OH 與5-OH脫水縮合形成，該類氧化環(huán)合形式的天然單萜報(bào)道較少。化合物2 為月桂烷型新天然單萜。化合物3～5 為首次從該屬植物分離得到的桉烷型倍半萜，其中化合物5 是降三碳倍半萜。通過(guò)單晶-X 射線衍射技術(shù)進(jìn)一步確證了化合物11 的立體結(jié)構(gòu)。初步的體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)中，桉烷型倍半萜（5～7）、杜松烷型倍半萜（9）和isodaucane 型倍半萜（10、11）顯示出一定的細(xì)胞毒活性。研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了千年健的化學(xué)物質(zhì)組成和生物學(xué)活性，為千年健的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)和依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突