水翁花總黃酮酶法提取工藝及抗氧化活性研究

葉春林，李瀚鑫，汪雅莉，陳穎

（浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310023）

水翁花開(kāi)始記載于《嶺南采藥錄》中，是桃金娘科植物水翁的干燥花蕾，別名水雍花、大蛇藥、水榕花、酒翁、水香。具有清熱解暑、生津止渴的功效，主要用于治療傷風(fēng)感冒、口渴腹脹或嘔吐泄瀉[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，水翁花具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗內(nèi)毒素以及保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等作用[2-4]。

水翁花主要分布于廣東、廣西、海南、福建等省，印度、越南、馬來(lái)西亞等地也有分布。在民間應(yīng)用非常廣泛，療效確切，夏季常作涼茶以解暑，也是“清熱涼茶”等中成藥的主要原料[5]。水翁花蕾中已知的化學(xué)成分有黃酮類(lèi)、氨基酸、熊果酸、齊墩果酸、橙酮等[6-9]。其中，黃酮類(lèi)化合物是水翁花的主要成分[10-12]，黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)重要的天然有機(jī)化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌和抗腫瘤等多種作用[13-15]。本試驗(yàn)以水翁花為原料，采用纖維素酶法提取水翁花中的總黃酮，利用響應(yīng)面優(yōu)化其提取工藝條件，并研究水翁花總黃酮的抗氧化能力，以期為水翁花的研究及開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水翁花蕾：產(chǎn)于廣東，粉碎過(guò)60目篩；纖維素酶（biological reagen，BR）（酶活：15 000 U/g）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（光譜純）：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；BS224S精密天平：SARTORIUS公司；PHS-3C型pH計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司；DKS-24型電熱恒溫水浴鍋：杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 水翁花總黃酮提取率的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[16]，得到總黃酮質(zhì)量濃度（Y，mg/mL）與吸光度（X）的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=0.085 3X-0.000 8，R2=0.999 3。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，可算出總黃酮的質(zhì)量濃度。

按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算，按下式計(jì)算總黃酮的提取率。

式中：c為水翁花提取液總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；n為提取液稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；W為提取用水翁花的質(zhì)量，mg。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 酶用量

精確稱(chēng)取1 g水翁花粉于三口燒瓶中，設(shè)置溫度55℃，pH值為5.0，酶用量為0.25%、0.50%、0.75%、1.0%、1.25%的條件下提取60 min。根據(jù)1.3.1項(xiàng)下方法，計(jì)算總黃酮的提取率。

1.3.2.2 酶解溫度

精確稱(chēng)取1 g水翁花粉于三口燒瓶中，設(shè)置溫度40、45、50、55、60 ℃，pH 值為 5.0，酶用量為 0.50%的條件下提取60 min。根據(jù)1.3.1項(xiàng)下方法，計(jì)算總黃酮的提取率。

1.3.2.3 酶解時(shí)間

精確稱(chēng)取1 g水翁花粉于三口燒瓶中，設(shè)置溫度55℃，pH值為5.0，酶用量為0.50%的條件下提取20、40、60、80、100 min。根據(jù) 1.3.1 項(xiàng)下方法，計(jì)算總黃酮的提取率。

1.3.2.4 pH值

精確稱(chēng)取1 g水翁花粉于三口燒瓶中，設(shè)置溫度55℃，pH 值為 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，酶用量為 0.50%的條件下提取60 min。根據(jù)1.3.1項(xiàng)下方法，計(jì)算總黃酮的提取率。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，以酶用量（A）、酶解溫度（B）、酶解時(shí)間（C）、pH 值（D）為獨(dú)立自變量，水翁花總黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)[17]，因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 因素和水平設(shè)計(jì)Table 1 Design of factors and levels

1.3.4 水翁花總黃酮抗氧化活性的研究

1.3.4.1 清除ABTS+自由基能力

分別配制總黃酮質(zhì)量濃度為 0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 mg/mL的水翁花總黃酮溶液和VC對(duì)照溶液，參照SINGH等[18]的方法測(cè)定ABTS+自由基清除率。

1.3.4.2 β-胡蘿卜素/亞油酸抗氧化體系

參照文獻(xiàn)[19]方法，并稍作修改。稱(chēng)取0.5 mg β-胡蘿卜素、25 μL 亞油酸及 200 μL Tween-40，用氯仿將其定容到1 mL。取配好的溶液至圓底燒瓶中，40℃旋轉(zhuǎn)蒸干，然后用蒸餾水將其定容到100 mL的容量瓶中。0.5 mL 不同濃度的黃酮溶液（0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL）加入2.5 mL的上述新鮮配制的β-胡蘿卜素/亞油酸介質(zhì)液，50℃孵育60 min，470 nm處，測(cè)定吸光度。以丁基羥基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）做陽(yáng)性對(duì)照。抗氧化能力采用下式計(jì)算。

式中：A0為開(kāi)始時(shí)，不同質(zhì)量濃度下的吸光度；A60為孵育60 min，不同質(zhì)量濃度下的吸光度；為開(kāi)始時(shí)，質(zhì)量濃度為0的吸光度；為孵育60 min，質(zhì)量濃度為0的吸光度。

1.3.4.3 總還原能力

水翁花總黃酮的總還原能力測(cè)定，參照文獻(xiàn)[20]，修改如下：0.5 mL不同濃度的黃酮溶液（0.15 mg/mL～0.75 mg/mL）與 0.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液、0.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）充分混勻；溶液在50℃的水浴中反應(yīng)30 min后，再加入10%的三氯乙酸0.5 mL，混勻。溶液在1500×g條件下，離心10min。取上清0.5 mL，與0.1 mL 0.1%FeCl3以及1.5 mL蒸餾水混勻，搖勻靜止5 min，在700 nm測(cè)吸光度。陽(yáng)性對(duì)照選用 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytolu-ene，BHT）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Design Expert 10.0.7軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，用OriginPro9.1軟件作圖，測(cè)定數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶用量對(duì)總黃酮提取率的影響

酶用量對(duì)總黃酮提取率的影響如圖1所示。

圖1 酶用量對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.1 Effects of cellulase dosage on yield of total flavonoids

由圖1可知，隨著纖維素酶添加量增大，水翁花總黃酮的提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，在酶添加量為0.5%時(shí)達(dá)到最大值。其原因可能是酶用量的增加，纖維素酶與更多的水翁花細(xì)胞壁作用，促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)黃酮的溶出，提高了總黃酮提取率；而當(dāng)酶用量過(guò)大時(shí)，酶與底物的作用達(dá)到飽和，酶解作用反而受到抑制，降低了提取率[21]。故酶用量選擇0.5%為0水平，進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化。

2.1.2 酶解溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

酶解溫度對(duì)總黃酮得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 酶解溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2 Effects of hydrolysis temperature on yield of total flavonoids

由圖2可以看出，在酶解溫度40℃～55℃時(shí)，隨著酶解溫度升高，總黃酮的提取率增大，最大值在55℃處獲得，繼續(xù)升高溫度，提取率呈下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)闇囟壬呤沟妹覆糠只蛉孔冃?，酶的活性降低，不利于黃酮的浸出與提取[22]。故酶解溫度選擇55℃為0水平，進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

酶解時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 Effects of hydrolysis time on yield of total flavonoids

由圖3可得，總黃酮提取率在20 min～60 min內(nèi)隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)而增大，再繼續(xù)增加時(shí)間，總黃酮提取率反而下降。其原因可能是剛開(kāi)始，酶解時(shí)間太短，酶解反應(yīng)不完全，水翁花的細(xì)胞壁在這個(gè)過(guò)程中得到的破壞不大，其中黃酮成分不易溶出，提取率較低，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮成分不斷溶出，提取率升高。但酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，部分黃酮結(jié)構(gòu)受到破環(huán)，反而降低了提取率[23]。故酶解時(shí)間選擇60 min為0水平，進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化。

2.1.4 pH值對(duì)總黃酮提取率的影響

pH值對(duì)水翁花總黃酮得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 pH值對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 Effects of pH on yield of total flavonoids

由圖4分析可知，當(dāng)溶液pH值小于5.0時(shí)，總黃酮提取率隨著pH值的增大而增大，當(dāng)pH值達(dá)到5.0時(shí)總黃酮提取率達(dá)到最大值，隨后總黃酮提取率逐漸下降。這是因?yàn)槊附夥磻?yīng)有適宜的pH值，在此pH值條件下纖維素酶的活力最大。在水翁花總黃酮提取過(guò)程中酶在pH值為5.0時(shí)為最適宜，過(guò)高或過(guò)低的pH值，酶的活性都會(huì)降低[24]，最佳的pH值選擇為5.0。故pH值選擇5.0為0水平，進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

為進(jìn)一步優(yōu)化水翁花總黃酮提取條件，以黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值，應(yīng)利用Design-Expert 10.0.7軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，根據(jù)表1設(shè)定的因素和水平，共設(shè)計(jì)29個(gè)處理組，其中5個(gè)零水平處理組，響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of Box-Behnken experiment

續(xù)表2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 The result of Box-Behnken experiment

根據(jù)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到總黃酮提取率（Y）對(duì)酶用量（A）、酶解溫度（B）、酶解時(shí)間（C）、pH值（D）的回歸模型為：Y=3.81+0.22A+0.15B+0.023C-0.12D-0.018AB+0.018AC-0.16AD-0.095BC-0.010BD-0.15CD-0.053A2-0.35B2-0.53C2-0.39D2，其中Y為水翁花總黃酮提取率。對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 水翁花黃酮提取回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the extraction of the flavonoids from Cleistocalyx operculatus

由方差分析可知，該模型的F=30.16，P<0.000 1，回歸模型達(dá)到極顯著，能夠正確反映各因素與響應(yīng)值之間的變化關(guān)系。失擬項(xiàng)P=0.116 4>0.05，模型失擬度不顯著，表明該模型擬合程度比較好，試驗(yàn)誤差小。決定系數(shù)R2=0.969 7，表明可用該模型解釋96.97%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)；調(diào)整的確定系數(shù)，表明有93.58%的總黃酮提取率變異分布與所研究的A、B、C、D 4個(gè)工藝因素相關(guān)。模型的CV較小，為3.47%，說(shuō)明試驗(yàn)穩(wěn)定、可靠。一次項(xiàng) A、B 和二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2的 P＜0.001，表明 A、B 和 A2、B2、C2、D2對(duì)總黃酮提取率的影響是極顯著的；一次項(xiàng)D和交互項(xiàng)AD的P＜0.01，表明D和AD對(duì)總黃酮提取率的影響是高度顯著的；交互項(xiàng)CD的P＜0.05，表明CD對(duì)總黃酮提取率有顯著影響。而一次項(xiàng) C、交互項(xiàng) AB、AC、BC、BD 的 P＞0.05，表明其對(duì)總黃酮提取率沒(méi)有顯著性影響。在試驗(yàn)考察范圍內(nèi)，各因素對(duì)水翁花總黃酮提取率的影響主次順序?yàn)椋好赣昧浚久附鉁囟龋緋H值＞酶解時(shí)間。

應(yīng)用Design-Expert 10.0.7軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)曲面圖如圖5所示。

圖5 各因素兩兩交互作用對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface map of the effect of the interaction between the two test variables and the yield of total flavonoids

由圖5可知，各因素對(duì)水翁花總黃酮的提取率的影響不同。其中，酶用量的影響最為顯著，隨著酶用量的延長(zhǎng)，總黃酮提取率先增大后減少，表現(xiàn)為曲面較陡；酶解溫度和pH值的影響次之，表現(xiàn)為曲面相對(duì)平緩；酶解時(shí)間的影響最小，曲面最為平緩。可見(jiàn)，響應(yīng)面圖分析結(jié)果與方差分析結(jié)論一致。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design Expert 10.0.7軟件分析，得到最佳提取工藝參數(shù)為：酶用量0.558 25%、酶解溫度56.05℃、酶解時(shí)間60.74 min、pH值4.89。為便于試驗(yàn)操作，將最佳提取條件進(jìn)行修正為：酶用量0.56%、酶解溫度56℃、酶解時(shí)間61 min、pH值4.9，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到水翁花總黃酮實(shí)際提取率為（3.85±0.09）%，與預(yù)測(cè)值（3.87±0.08）%穩(wěn)合的很好。

2.4 抗氧化結(jié)果

2.4.1 ABTS+自由基清除作用

ABTS試劑與過(guò)二硫酸鉀反應(yīng)，可以生成綠色的ABTS+自由基，該自由基在734 nm有最大吸收。加入具有抗氧化活性的物質(zhì)會(huì)抑制ABTS+自由基的生成，使顏色減弱，所以，通過(guò)檢測(cè)734 nm的吸光度，可以評(píng)價(jià)抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力[25]。總黃酮對(duì)ABTS+自由基的清除作用見(jiàn)圖6。

圖6 總黃酮對(duì)ABTS+自由基的清除作用Fig.6 Inhibition effects of total flavonoids on ABTS+radical

由圖6可知，當(dāng)水翁花總黃酮從0.15 mg/mL增加到0.75 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+自由基的清除率從（19.4±2.2）%增長(zhǎng)到70.6±3.0%?？傸S酮對(duì)ABTS+自由基有很好的清除作用，對(duì)ABTS+自由基的清除率與總黃酮濃度成正比?？傸S酮的IC50=0.41 mg/mL，VC的IC50=0.20 mg/mL，IC50越小說(shuō)明抗氧化活性越好。

2.4.2 對(duì)β-胡蘿卜素/亞油酸體系的影響

β-胡蘿卜素/亞油酸抗氧化體系廣泛的應(yīng)用于抗氧化能力的評(píng)價(jià)[26]。亞油酸自動(dòng)氧化，生成的自由基與β-胡蘿卜素反應(yīng)，引起β-胡蘿卜素的黃色衰減（在470nm處吸光度減?。?；在有抗氧化劑存在時(shí)，褪色速度被減緩[27]?？傸S酮及BHA對(duì)油脂氧化的清除率見(jiàn)圖7。

圖7 總黃酮對(duì)油脂氧化的抑制作用Fig.7 Inhibition effects of total flavonoids on oil oxidation

由圖7可知，總黃酮顯示出一定的抑制油脂氧化作用，并且隨著濃度的增加，對(duì)油脂氧化的抑制作用也增強(qiáng)，在最高質(zhì)量濃度1.6 mg/mL時(shí)，對(duì)油脂氧化的清除率為（58.7±2.4）%。而B(niǎo)HA在此質(zhì)量濃度下，清除率已達(dá)（98.6±3.3）%。

2.4.3 總還原能力的測(cè)定

物質(zhì)的還原能力與其抗氧化活性之間存在密切關(guān)系。具有還原作用的物質(zhì)，通過(guò)給出電子，把Fe3+還原成Fe2+，使Fe2+發(fā)生普魯士藍(lán)反應(yīng)。普魯士藍(lán)在700nm處有最大吸收峰，故700 nm處吸光值越高，則還原力越強(qiáng)[28]?？傸S酮總還原能力見(jiàn)圖8。

圖8 總黃酮總還原能力Fig.8 Reducing power of the of total flavonoids

從圖8可知，水翁花總黃酮的還原能力隨濃度的增大而逐漸增大，具有濃度依賴(lài)性。當(dāng)濃度為0.75 mg/mL時(shí)，總黃酮和BHT的還原力（以700 nm處的OD值表示）分別為（0.60±0.03）和（0.83±0.05）。盡管黃酮的還原活性比具有極強(qiáng)還原能力的BHT要弱一點(diǎn)，但仍表現(xiàn)出很好的還原能力。

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用酶法提取水翁花中的黃酮類(lèi)化合物，同時(shí)對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化了總黃酮的提取工藝，獲得最佳工藝為：酶用量0.56%、酶解溫度56℃、酶解時(shí)間61 min、pH值4.9，總黃酮提取率為（3.85±0.09）%?？寡趸钚匝芯勘砻鳎?dāng)總黃酮溶液濃度為0.75 mg/mL時(shí)，其對(duì)ABTS+自由基的清除率達(dá)到（70.6±3.0）%，對(duì)ABTS+自由基的半數(shù)清除濃度IC50值為0.41 mg/mL；當(dāng)濃度為1.6 mg/mL時(shí)，對(duì)油脂氧化的清除率為（58.7±2.4）%；當(dāng)總黃酮溶液濃度為0.75 mg/mL時(shí)，測(cè)得700 nm處的吸光度值為（0.60±0.03），其還原力稍弱于BHT。試驗(yàn)結(jié)果表明水翁花總黃酮提取液具有較好的抗氧化活性，可以為水翁花黃酮類(lèi)化合物的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)。