不同益生菌發(fā)酵劑對復(fù)合果蔬汁品質(zhì)的影響

趙榮敏

（石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與藥品工程系，河北 石家莊 050081）

沙棘、胡蘿卜和黑棗廣泛種植于我國北方地區(qū)，三者的果實中富含多種碳水化合物、氨基酸、維生素、脂肪酸和多種微量元素，并含有大量的黃酮和多酚等生物活性物質(zhì)[1-4]。綜合三者的成分對人體十分有益，具有抗氧化、抗突變、保護(hù)胃腸道、保護(hù)肝臟、增強(qiáng)免疫力等作用[2-4]。這三者通常都被生食或榨汁，但由于其酸味和澀味明顯而不被人們所接受，亟需加大三者的綜合加工，提高產(chǎn)品的附加值。研究三者的加工工藝對于果蔬加工產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

益生菌具有抗氧化、抗菌、抗炎及一些其它益生特性，可為宿主帶來多種益處[5]。通過發(fā)酵技術(shù)將這一至關(guān)重要的益生功能傳遞給宿主是一個非常有前景的應(yīng)用。使用益生菌發(fā)酵技術(shù)研發(fā)具有保健功能的發(fā)酵果蔬汁，不僅可以增加果蔬制品的種類，還有助于提高果蔬制品的保健功效[6]。含酵母自溶物的果蔬經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，發(fā)酵產(chǎn)品中礦物質(zhì)、β-胡蘿卜素、甜菜苷、維生素和一些其它營養(yǎng)物質(zhì)的含量顯著高于未發(fā)酵的果蔬[7]。此外，乳酸菌發(fā)酵橙汁可增加類胡蘿卜素和黃酮的含量[8]。

目前，對于益生菌發(fā)酵果蔬的研究報道較多，但以沙棘、胡蘿卜和黑棗為原料發(fā)酵復(fù)合果蔬汁的研究鮮有報道，且不同益生菌發(fā)酵劑及其組合對該復(fù)合果蔬汁的影響也未知。本研究以沙棘、胡蘿卜和黑棗為主要原料，基于現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)，接種不同益生菌發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵，探究發(fā)酵過程中體外抗氧化能力、益生菌菌落總數(shù)、主要理化指標(biāo)（pH值、總酸、可溶性蛋白、還原糖）、有機(jī)酸和活性成分（總黃酮和總多酚）含量的變化規(guī)律，同時利用相關(guān)性分析對各品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行分析，為復(fù)合果蔬汁的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘原漿：呂梁野山坡食品有限責(zé)任公司；胡蘿卜汁、黑棗汁：福建綠泉食品有限公司。

乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基、羥自由基清除能力檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉等（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸、草酸、蘋果酸、檸檬酸、乳酸、琥珀酸、莽草酸、富馬酸、丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：國家食品藥品檢測中心；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（分析純）：上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1109C型無菌操作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；GL-21M型高速冷凍離心機(jī)：長沙平凡儀器廠；AB-50型電子分析天平、FE28型pH計：瑞士Mettler-Toledo公司；UV1800型紫外可見光分光光度計：日本島津公司；Agilent 1260型液相色譜儀：美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌懸液制備

試驗所用益生菌為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，LP）和鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus，LR）均來自食品與藥品工程微生物實驗室。將乳酸菌接入乳酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化，37℃培養(yǎng)24 h，4 500 r/min離心15 min，用無菌生理鹽水清洗沉淀，將其溶于生理鹽水中，配制成活菌數(shù)為2.1×107CFU/mL左右的菌懸液。

1.3.2 復(fù)合果蔬汁發(fā)酵工藝

將沙棘原漿、胡蘿卜汁和黑棗汁按一定比例混合，115℃滅菌20 min，冷卻至室溫（25℃）后裝入3L已滅菌玻璃瓶中，分別接種植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和它們的組合[1∶1（體積比），LP+LR]，接種量為2%菌懸液，混勻后37℃靜置發(fā)酵36 h，每隔6 h進(jìn)行取樣，并立即置于-20℃保存。

1.3.3 益生菌菌落總數(shù)的測定

參照GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》測定益生菌菌落總數(shù)[9]。

1.3.4 發(fā)酵過程中pH值、總酸、可溶性蛋白和還原糖的測定

使用pH計直接測定pH值；參照GB 5009.239—2016《食品酸度的測定》測定總滴定酸的含量（以乳酸計）[10]；采用考馬斯亮藍(lán)法測定可溶性蛋白的含量[11]；參照GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》測定還原糖的含量（以葡萄糖計）[12]。

1.3.5 發(fā)酵過程中有機(jī)酸的測定

用高效液相色譜法測定復(fù)合果蔬汁中有機(jī)酸的含量[13]。取適量復(fù)合果蔬汁發(fā)酵液，4 500 r/min離心10 min，將離心后的上清液稀釋5倍微濾（0.45μm）過膜后待用。采用AgilentC18色譜柱，進(jìn)樣量為10μL，流動相為甲醇-水-磷酸溶液（A體積比80∶15∶5；B體積比為 5∶90∶5），柱溫 30℃，柱流速 0.5 mL/min，檢測波長210nm[13]。流動相梯度洗脫條件：0～5min，A∶B=0∶100；15min，A ∶B=10 ∶90；45min～55 min，A∶B=100 ∶0；65 min～75 min，A ∶B=0 ∶100[13]。

1.3.6 發(fā)酵過程中總黃酮和總多酚含量的測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定總黃酮的含量[14]，總黃酮含量用蘆丁當(dāng)量表示；采用Folin-Ciocalteu比色法測定總多酚的含量[15]，總多酚含量用沒食子酸當(dāng)量表示。

1.3.7 發(fā)酵過程中體外抗氧化能力的測定

DPPH自由基清除能力測定參考王儲炎等[16]的方法，取適量復(fù)合果蔬汁發(fā)酵液，4 500 r/min離心10 min，將 100 μL上清液加入到 100 μL 0.2 mmol/L DPPH 甲醇溶液，混勻后置于黑暗條件下反應(yīng)30 min，于517 nm下測定吸光度，分別以80%甲醇溶液和純水代替樣品作陽性對照和空白對照。DPPH自由基清除率計算公式如下。

DPPH 自由清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A0、A1和A2分別為空白、樣品和對照的吸光度值。

羥自由基清除能力測定參考LIU等[17]的方法，根據(jù)試劑盒的相應(yīng)步驟進(jìn)行測定。羥自由基清除率計算公式如下。

羥自由清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A0、A1和A2分別為空白、樣品和對照的吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組試驗均重復(fù)3次，采用Origin 9.0軟件繪圖，方差分析（ANOVA）用于分析組間差異，SPSS 19.0軟件進(jìn)行ANOVA和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中乳酸菌菌落總數(shù)的變化

復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中乳酸菌菌落總數(shù)的變化見圖1。

圖1 復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中乳酸菌菌落總數(shù)的變化Fig.1 Changes in the total numbers of colonies during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice

由圖1可知，復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中乳酸菌菌落總數(shù)呈現(xiàn)先增加后趨于平緩的趨勢，與吳萬林等[18]得出的結(jié)論一致。其中，LP組在發(fā)酵6 h時乳酸菌菌落總數(shù)迅速增加至6.12lg（CFU/mL），遠(yuǎn)高于LR組[5.54 lg（CFU/mL）]和LP+LR組[5.92 lg（CFU/mL）]（P<0.05），說明復(fù)合果蔬汁中營養(yǎng)物質(zhì)充足，可促進(jìn)乳酸菌的生長繁殖，而植物乳桿菌比鼠李糖乳桿菌更適宜該發(fā)酵環(huán)境。發(fā)酵30 h后，LP組和LR組中乳酸菌總數(shù)達(dá)到最大，分別為 8.21 lg（CFU/mL）和 8.04 lg（CFU/mL），隨后開始下降，這是因為隨著發(fā)酵時間的不斷延長，發(fā)酵體系中營養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗及大量次級代謝產(chǎn)物的積累不利于乳酸菌的生長[19]。

2.2 發(fā)酵過程中pH值、總酸、可溶性蛋白和還原糖的變化

復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中pH值、總酸、可溶性蛋白和還原糖的變化見圖2。

圖2 復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中pH值、總酸、可溶性蛋白和還原糖的變化Fig.2 Changes in the pH，total acidity，soluble protein content and reducing sugar content during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice

由圖2A可知，復(fù)合果蔬汁在發(fā)酵過程中pH值呈逐漸下降的趨勢，與XU等[20]報道一致。其中，LP+LR組在發(fā)酵36 h時具有最低的pH值，為3.52，顯著低（P<0.05）于LP組和LR組，表明植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的互利共生關(guān)系有利于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，促進(jìn)其生長代謝，從而加速發(fā)酵環(huán)境的酸化。如圖2B所示，復(fù)合果蔬汁在發(fā)酵過程中總酸含量整體上呈先快速增加后維持穩(wěn)定的趨勢，這可能是由于原料中有機(jī)酸的溶出及乳酸菌在生長代謝中產(chǎn)生了乳酸等有機(jī)酸[2]。隨著發(fā)酵的不斷延續(xù)，LP+LR組中總酸含量由最初的0.27 g/L增加至發(fā)酵36 h的2.04 g/L。LP+LR組發(fā)酵過程中總酸含量始終高于LP組和LR組，這與圖1的結(jié)論相吻合，產(chǎn)酸量與菌落總數(shù)呈正相關(guān)。由圖2C可知，復(fù)合果蔬汁在發(fā)酵過程中可溶性蛋白含量的變化趨勢與總酸含量的變化趨勢相反，與王越等[13]報道一致，這可能是由于可溶性蛋白能與脂肪、纖維素等結(jié)合形成致密且不溶于水的大分子物質(zhì)，且發(fā)酵環(huán)境的不斷酸化也會導(dǎo)致可溶性蛋白在大量H+水解作用下分解為多肽和氨基酸[13]。其中，在發(fā)酵36 h時，LP組和LR組中可溶性蛋白含量無顯著差異（P>0.05），其含量分別為0.22 g/L和0.25 g/L，而LP+LR組中可溶性蛋白含量為0.17 g/L，顯著低（P<0.05）于LP組和LR組發(fā)酵的復(fù)合果蔬汁。如圖2D所示，復(fù)合果蔬汁在發(fā)酵過程中還原糖含量呈先增加后下降再保持穩(wěn)定的變化趨勢。LP組、LR組和LP+LR組中還原糖含量分別在發(fā)酵6、12 h和6 h達(dá)到最大值，其含量分別為72.62、70.64 g/L和67.01 g/L，說明乳酸菌生長代謝過程中產(chǎn)生的酶可將復(fù)合果蔬汁中其它種類糖類化合物分解成還原糖，造成發(fā)酵初期還原糖含量增加。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵體系中還原糖含量不斷下降，這是由于乳酸菌的快速生長需要消耗大量碳源。在發(fā)酵36 h時，3種工藝發(fā)酵復(fù)合果蔬汁中還原糖含量無顯著差異（P>0.05）。

2.3 發(fā)酵過程中有機(jī)酸的變化

復(fù)合果蔬汁的風(fēng)味主要受有機(jī)酸、糖類等成分影響，其中，有機(jī)酸是影響其風(fēng)味的重要指標(biāo)[21]。復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中有機(jī)酸的變化見表1。

表1 復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中有機(jī)酸的變化Table 1 Changes in the content of organic acids during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice

由表1可知，在未發(fā)酵的復(fù)合果蔬汁中有機(jī)酸以蘋果酸為主，其含量占整個有機(jī)酸的73.54%，與陸敏等[22]研究結(jié)果相一致，但接種乳酸菌發(fā)酵會使復(fù)合果蔬汁中蘋果酸含量隨發(fā)酵時間的延長而降低。莽草酸、富馬酸和丙酮酸在3種不同工藝的復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中變化均不明顯，乙酸、草酸、檸檬酸、乳酸和琥珀酸則呈先增后降的變化趨勢。復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中乳酸的變化最顯著，其在未發(fā)酵的復(fù)合果蔬汁中不能被檢測，而在發(fā)酵36 h時的含量為15.78 mg/mL～16.82 mg/mL，其中，LP+LR組中乳酸含量最高，而LR組最低。此外，在發(fā)酵36 h時，LP+LR組中檸檬酸、乙酸和草酸的含量分別為6.74、1.24、0.87 mg/mL。3種工藝發(fā)酵復(fù)合果蔬汁中，除草酸含量無顯著差異（P>0.05）外，LP+LR組中乙酸含量顯著高于LP組（1.01mg/mL）和LR組（0.86mg/mL），而LR組中檸檬酸含量最高，可達(dá)7.06 mg/mL，顯著高于LP+LR組和LP組（6.47 mg/mL）。綜上可知，乳酸和檸檬酸是乳酸菌發(fā)酵復(fù)合果蔬汁中最主要的兩種有機(jī)酸，兩者之和占整個有機(jī)酸的87%左右。說明乳酸和檸檬酸是決定乳酸菌發(fā)酵復(fù)合果蔬汁口感的主要因素之一。

2.4 發(fā)酵過程中總黃酮和總多酚的變化

黃酮類化合物是一類廣泛存在于果蔬中的天然有機(jī)化合物，具有抗氧化、抗炎及抗菌等多種生物活性。復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中總黃酮和總多酚的變化見圖3。

圖3 復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中總黃酮和總多酚的變化Fig.3 Changes in total flavonoids contents and total polyphenol contents during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice

如圖3A所示，復(fù)合果蔬汁在發(fā)酵過程中總黃酮含量整體上呈先增加后維持穩(wěn)定的趨勢，這是因為乳酸菌在生長過程中會產(chǎn)生各種酶，這些酶會促進(jìn)纖維素、果膠等大分子物質(zhì)的分解，使大量黃酮類化合物溶于發(fā)酵體系中，從而提高果蔬汁中總黃酮的含量[23]。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行30 h后，3種工藝發(fā)酵果蔬汁的總黃酮含量趨于穩(wěn)定，其中LP+LR組發(fā)酵的復(fù)合果蔬汁中總黃酮含量最高，為0.45 g/L，而LP組發(fā)酵的復(fù)合果蔬汁中總黃酮含量最低，為0.35 g/L，LR組發(fā)酵的復(fù)合果蔬汁中總黃酮含量介于兩者之間，為0.41 g/L，顯著高于LP組（P<0.05）。結(jié)合圖1的結(jié)論可知，在復(fù)合果蔬汁發(fā)酵體系中鼠李糖乳桿具有比植物乳桿菌更強(qiáng)的合成黃酮類化合物的能力。

復(fù)合果蔬汁的顏色、味道等感官特性也受多酚類物質(zhì)含量的影響[24]。由圖3B可知，復(fù)合果蔬汁在發(fā)酵過程中總多酚含量整體上呈先增加后下降的趨勢，這主要是因為隨著發(fā)酵過程中單體酚類化合物的生物合成，促進(jìn)總多酚含量的增加，而酚類物質(zhì)的氧化與生成也是同時進(jìn)行的，到了發(fā)酵后期，生成的速率降低，而氧化過程仍在繼續(xù)，導(dǎo)致酚類物質(zhì)的減少[13,25]。在發(fā)酵30 h時，LP+LR組發(fā)酵的復(fù)合果蔬汁中總多酚含量達(dá)到最高，為12.22g/L，顯著高于LP組（9.92g/L）和LR組（10.58 g/L）（P<0.05）。此外，乳酸菌發(fā)酵復(fù)合果蔬汁可顯著提高（P<0.05）總多酚含量，比未發(fā)酵的復(fù)合果蔬汁增加了74%～113%，表明發(fā)酵技術(shù)有利于增加復(fù)合果蔬汁多酚類生物活性物質(zhì)的含量。

2.5 發(fā)酵過程中體外抗氧化能力的變化

復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中體外抗氧化能力的變化見圖4。

圖4 復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中體外抗氧化能力的變化Fig.4 Changes in antioxidant activity during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice

如圖4所示，復(fù)合果蔬汁在發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率和羥自由基清除率整體上均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。3種工藝的DPPH自由基清除率均在發(fā)酵30 h達(dá)到最大，其中，LP+LR組的DPPH自由基清除率最大，可達(dá)91.57%，而LP組的DPPH自由基清除率最低，為88.03%，LR組的DPPH自由基清除率介于兩者之間，為88.98%。此外，3種工藝的羥自由基清除率最大值則出現(xiàn)在發(fā)酵24 h，其中，LP+LR組的羥自由基清除率最大，為71.57%，顯著高（P<0.05）于LP組（66.43%）和LR組（67.98%）。這可能與乳酸菌的代謝產(chǎn)物及復(fù)合果蔬汁中活性物質(zhì)的變化有關(guān)[26]。綜上，植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌耦合發(fā)酵可明顯改善復(fù)合果蔬汁的體外抗氧化能力。

3 結(jié)論

本文使用不同益生菌及其組合發(fā)酵以沙棘、胡蘿卜和黑棗為原料制備的復(fù)合果蔬汁，探究復(fù)合果蔬汁發(fā)酵過程中關(guān)鍵理化性質(zhì)、有機(jī)酸、總黃酮和總多酚類活性物質(zhì)及體外抗氧化能力等的變化規(guī)律。結(jié)果表明，相比直接利用植物乳桿菌或鼠李糖乳桿菌發(fā)酵復(fù)合果蔬汁，植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌耦合發(fā)酵可顯著增加（P<0.05）乳酸菌的菌落總數(shù)，并提高（P<0.05）總酸、總黃酮、總多酚、乙酸和乳酸等物質(zhì)的含量及增加（P<0.05）體外抗氧化活性。3種工藝發(fā)酵復(fù)合果蔬汁中還原糖含量無顯著差異。本研究不僅豐富了復(fù)合果蔬汁的產(chǎn)品種類，還為乳酸菌發(fā)酵復(fù)合果蔬汁的加工和生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。