甜葉菊花和葉中酚類成分分析及含量測(cè)定

謝虹，陳云，梁建生

（揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009）

甜葉菊（Stevia rebaudiana Bertoni）為菊科（Compositae）斯臺(tái)比亞屬（Stevia）多年生草本植物，因葉片中含有低熱值和高甜度的甜菊糖苷（steviol glycosides，SGs）而得到人們的高度關(guān)注[1]。SGs是一類二萜糖苷類化合物的總稱，甜度約為蔗糖甜度的300倍，因而作為一種天然來源的“甜味劑”被廣泛應(yīng)用于食品和飲料工業(yè)[2]。SGs還可治療糖尿病、牙科疾病、肥胖病、高血壓和癌癥等疾病[3-4]。甜葉菊中含有30多種濃度各異的SGs，其中甜菊苷（stevioside，St）和瑞鮑迪苷A（rebaudiosideA，RA）含量最豐富[5]。研究表明，酚類是甜葉菊中另一類含量豐富的活性物質(zhì)，甜葉菊中酚類主要有酚酸和類黃酮兩類，而酚酸主要包括綠原酸類化合物[6]。國(guó)內(nèi)對(duì)甜葉菊酚類的研究多集中在葉片綠原酸類化合物含量的測(cè)定方面[7-9]，而有關(guān)類黃酮成分分析及含量測(cè)定研究較少。

甜葉菊屬于短日照植物，在長(zhǎng)日照下只有長(zhǎng)莖葉進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。當(dāng)日照逐漸縮短，其才能現(xiàn)蕾開花進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段[10]。以St含量高的甜葉菊品種為材料的研究表明SGs含量在現(xiàn)蕾初期達(dá)到最高，開花后SGs含量明顯下降[11]，因此甜葉菊產(chǎn)地多以田間群體10%～20%的植株現(xiàn)蕾作為最適采收期[12]，因而產(chǎn)業(yè)界至今未挖掘甜葉菊花的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。上世紀(jì)末，甜葉菊栽培品種隨著市場(chǎng)需求經(jīng)歷了從高St向高RA含量及高RA/St比的品種更替，羅慶云等[11]的研究結(jié)果表明高RA甜葉菊品種葉的采收可在現(xiàn)蕾至種子成熟時(shí)段進(jìn)行。作為植物精華的鮮花除具有觀賞價(jià)值外，還含有豐富的類黃酮、酚酸、氨基酸、微量元素和維生素等活性成分，具有食用和藥用價(jià)值[13]。本文以甜葉菊的花和葉為研究對(duì)象，鑒定其酚類成分并測(cè)定含量，為建立甜葉菊多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)體系和擴(kuò)大甜葉菊開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甜葉菊花（去苞片）、葉片：江蘇寶蓮生物科技有限公司甜葉菊種植基地，55℃過夜烘干后研磨成細(xì)粉，過50目篩，備用。

1.2 試劑與儀器

新綠原酸、隱綠原酸、1，3-二咖啡?？鼘幩?、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C對(duì)照品：成都曼思特生物科技有限公司；槲皮素-7-O-葡萄糖苷對(duì)照品：上海源葉生物科技有限公司；木犀草素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷對(duì)照品：索萊寶生物科技有限公司；綠原酸、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蘆丁對(duì)照品：成都瑞芬思生物科技有限公司；槲皮素-3-O-木糖苷、山奈酚-3-O-鼠李糖苷、山奈酚3-O-阿拉伯糖苷對(duì)照品：四川省維克奇生物科技有限公司。以上對(duì)照品均為色譜純（質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%）。甲酸（色譜純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）：瑞典OCEANPAK公司；甲醇（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；固相萃取試劑盒（2 mL）：安捷倫科技有限公司。

高效液相色譜（1260）-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜分析儀（6460Triple Quad LC/MS）、高效液相色譜儀（1200）：安捷倫科技有限公司；電子天平（AL204）：梅特勒-托利多公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9141A）：德國(guó)美墨爾特公司；冰凍離心機(jī)（5804R）：德國(guó)艾本德公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 供試品溶液

分別稱取甜葉菊的花粉末5.00 g和葉粉末1.00 g，各加入30 mL甲醇，超聲輔助浸提30 min，6 000 r/min離心10 min，取上清，沉淀加入30 mL甲醇超聲輔助重復(fù)浸提2次，每次30 min，合并3次浸提的上清液并定容至100 mL，得甲醇浸提液。取1 mL浸提液置于固相萃取試劑盒中旋渦振蕩3 min，9 000 r/min離心8 min，取上清用10%乙腈稀釋至合適的濃度，過0.22 μm微孔濾膜，得供試品溶液。

1.3.2 高效液相色譜-質(zhì)譜鑒定酚類化合物

1）液相色譜條件：色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.5%甲酸水（B），梯度洗脫程序（0～5 min，5%～10%A；5 min～40 min：10%～34%A；40 min～45 min，34%～95%A；45 min～47min，95%A；47 min～48 min，95%～5%A；48 min～60 min，5%A）；流速：0.3 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2）質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），正/負(fù)離子掃描檢測(cè)模式；掃描范圍 m/z：50～1 000；毛細(xì)管電壓：4 kV（正）、3.5 kV（負(fù)）；干燥氣體溫度：300℃，干燥氣體流速：10 L/min；鞘氣溫度：132℃，鞘氣流速：7 L/min；霧化器壓力：103 kPa。

1.3.3 高效液相色譜法檢測(cè)酚類含量

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：SepaxGP-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：0.5%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫程序（0～5 min，5%～10%B；5 min～40 min：10%～34%B；40min～44min，34%～95%B；44min～48 min，95%～5%B）；流速：0.9 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.3.2 線性關(guān)系

精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、1，3-二咖啡?？鼘幩?、蘆丁、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-木糖苷、異綠原酸B、異綠原酸A、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷、異綠原酸C、山奈酚-3-O-鼠李糖苷15個(gè)對(duì)照品適量，置于25 mL容量瓶中，加甲醇超聲輔助溶解定容后得混合對(duì)照品溶液，用10%乙腈溶液按比例稀釋成相應(yīng)的濃度梯度進(jìn)行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。

1.3.3.3 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率試驗(yàn)

取“1.3.3.2”項(xiàng)下制備混合對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，以峰面積計(jì)算15種酚類的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值評(píng)估儀器精密度。取甜葉菊樣品按“1.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行5份，按“1.3.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積計(jì)算15種酚類的RSD值評(píng)估該方法重復(fù)性。取甜葉菊供試品溶液，分別于 0、4、8、12、24 h 進(jìn)行測(cè)定，以峰面積計(jì)算 15種酚類的RSD值評(píng)估供試品溶液穩(wěn)定性。精密稱取已知含量的同一批樣品適量，共9份，每3份為一組，分別精確加入低、中、高濃度的對(duì)照品溶液適量，按“1.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“1.3.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算加樣回收率。

1.3.3.4 甜葉菊花和葉中酚類含量測(cè)定

以2019年種植的甜葉菊一新品種盛花期（生長(zhǎng)160 d）10個(gè)植株混合葉和混合花為材料，按“1.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“1.3.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算酚類含量（平行測(cè)定3份，取平均值）。因無木犀草素-7-O-蕓香糖苷的對(duì)照品，其含量的計(jì)算以木犀草素-7-O-葡萄糖苷的峰面積及濃度為基準(zhǔn)，計(jì)算公式如下。

含量/（mg/g）=（C/W）×（A2/A1）×1.33

式中：C為木犀草素-7-O-葡萄糖苷對(duì)照品的濃度，mg/mL；A1為木犀草素-7-O-葡萄糖苷對(duì)照品峰面積；W為樣品的干質(zhì)量，g；A2為樣品中木犀草素-7-O-蕓香糖苷峰面積；1.33為木犀草素-7-O-蕓香糖苷與木犀草素-7-O-葡萄糖苷分子質(zhì)量之比。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Microsoft excel軟件和SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行整理與分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 甜葉菊中酚類物質(zhì)的鑒定

試驗(yàn)采用正/負(fù)離子模式對(duì)甜葉菊的葉和花中提取成分進(jìn)行掃描，圖1是樣品在正/負(fù)模式下的質(zhì)譜總離子流圖（total ion chromatogram，TIC）。

圖1 甜葉菊供試品總離子流圖Fig.1 TIC of sample of Stevia rebaudiana Bertoni

峰1、2和3的分子離子峰[M-H]-均為m/z 353，初步判斷為單咖啡酰奎寧酸。3個(gè)峰的特征離子m/z191和m/z179分別為失去咖啡酸部分和奎寧酸部分的碎片離子，m/z 173為奎寧酸進(jìn)一步失去H2O的碎片離子；咖啡酸可以和奎寧酸的1、3、4和5位上的羥基（-OH）脫水縮合，形成4種單咖啡酰奎寧酸。峰4、10、11和15的分子離子峰 [M-H]-均為m/z 515，特征離子m/z 353為失去咖啡酸及進(jìn)一步失去H2O的碎片離子，初步判斷這4個(gè)峰均為二咖啡?？鼘幩?；兩分子咖啡酸與奎寧酸脫水縮合，理論上與奎寧酸羥基（-OH）結(jié)合位置可能有 1，3-、1，4-、1，5-、3，4-、3，5-和 4，5-六種[14]。通過參閱參考文獻(xiàn)[1-2,6]及對(duì)照品確定峰1、2、3、10、11、15分別為新綠原酸（3-咖啡?？鼘幩幔⒕G原酸（5-咖啡?？鼘幩幔㈦[綠原酸（4-咖啡?？鼘幩幔?、異綠原酸 B（3，4-二咖啡?？鼘幩幔惥G原酸 A（3，5-二咖啡?？鼘幩幔?、異綠原酸C（4，5-二咖啡?？鼘幩幔?。另外，根據(jù)張維冰等[14]的文獻(xiàn)、峰的保留時(shí)間及對(duì)照品確定峰4為1，3-二咖啡?？鼘幩帷Ｔ谝酝难芯恐猩形匆娞鹑~菊中含有1，3-二咖啡?？鼘幩岬膱?bào)道[1,2,6-9]。

峰5、6、9和12均含有特征離子m/z 303，推測(cè)是槲皮素糖苷化合物。峰5的分子離子峰 [M-H]-為m/z 609，特征離子m/z 611和m/z303分別為[M+H]+和失去了蕓香糖（葡萄糖+鼠李糖）的碎片離子；峰6分子離子峰[M-H]-為m/z 463，特征離子m/z 465和m/z303分別為[M+H]+和失去了半乳糖或葡萄糖的碎片離子；峰9分子離子峰[M-H]-為m/z 433，特征離子m/z 303為[M+H]+失去了木糖的碎片離子；峰12分子離子峰[M-H]-為m/z 447，特征離子m/z 449和m/z303為[M+H]+和失去了鼠李糖的碎片離子。Barroso等[6]通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定到了葡萄牙產(chǎn)甜葉菊中槲皮素糖苷化合物包括蘆丁、槲皮素-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-木糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷。

峰7、8、14和16的均含有特征離子m/z 287，推測(cè)可能是木犀草素或山奈酚糖苷化合物。由于木犀草素的極性大于山奈酚的極性，所以在反相液相色譜分離中，一般木犀草素糖苷化合物的保留時(shí)間小于山奈酚糖苷化合物的保留時(shí)間，因此可以初步判斷峰7和8為木犀草素糖苷化合物。峰7的分子離子峰[M-H]-為m/z 447，特征離子m/z 287為[M+H]+失去了半乳糖或葡萄糖的碎片離子。峰8的分子離子峰[M-H]-為m/z 593，特征離子m/z 595和m/z287分別為[M+H]+和失去了雙糖的碎片離子。Ciulu等[2]在甜葉菊的酚類鑒定研究中推測(cè)[M-H]-為m/z 593的分子離子峰可能是木犀草素-7-O-蕓香糖苷或山奈酚-3-O-蕓香糖苷，本研究以分子量同為594的木犀草素-7-O-新橙皮糖苷和山奈酚-3-O-蕓香糖苷對(duì)照品進(jìn)行HPLC分析，山奈酚-3-O-蕓香糖苷峰的出峰時(shí)間比峰8的出峰時(shí)間滯后2.175 min，而木犀草素-7-O-新橙皮糖苷比峰8的出峰時(shí)間提前0.971 min，因此判斷峰8應(yīng)為木犀草素-7-O-蕓香糖苷。峰14和16的分子離子峰[M-H]-分別為m/z 417和m/z 431，特征離子m/z 287為[M+H]+失去了阿拉伯糖和[M+H]+失去了鼠李糖的碎片離子。峰13的分子離子峰[M-H]-為m/z 431，特征離子m/z 271為[M+H]+失去了半乳糖或葡萄糖的碎片離子。

本研究通過對(duì)照品確定峰 5、6、7、8、9、12、13、14、16分別為蘆丁、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-木糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷、山奈酚-3-O-鼠李糖苷。

2.2 色譜條件的選擇

鑒于植物提取物成分多而復(fù)雜，為了有效進(jìn)行組分分離，必須對(duì)分離條件進(jìn)行優(yōu)化，不同的分離參數(shù)包括色譜柱、流動(dòng)相組成和檢測(cè)波長(zhǎng)等需通過試驗(yàn)確定。本試驗(yàn)比較了Agilent Eclipse XDB、Dubhe、Sepax GP、Welch Ultimate XB、Thermo scientific ODS Hypersil、DikMa Diamonsil等C18色譜柱的分離效果，結(jié)果表明采用Sepax GP-C18色譜柱，分離效果最好。從正/負(fù)離子模式下甜葉菊樣品的總離子流圖中提取200 nm～440 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的色譜圖進(jìn)行比較，如圖2所示。

圖2 對(duì)照品和甜葉菊供試品高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of reference substances and Stevia rebaudiana Bertoni samples

由圖2可知，大多數(shù)峰在330nm處有最大吸收。對(duì)高效液相流動(dòng)相的組成進(jìn)行考察，結(jié)果表明使用乙腈-水溶液作為流動(dòng)相組成比甲醇-水溶液流動(dòng)相組成的分離效果好，在流動(dòng)相中加入少量的甲酸，色譜峰更尖銳，并能有效減少色譜峰拖尾現(xiàn)象的產(chǎn)生。以乙腈-0.5%甲酸作為流動(dòng)相，調(diào)整流動(dòng)相比例，在40 min內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)多種成分的有效分離。

2.3 線性關(guān)系考察

將15種酚類對(duì)照品混合溶液配制成相應(yīng)的濃度梯度后，進(jìn)樣分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制系列標(biāo)準(zhǔn)曲線，15種酚類的相關(guān)系數(shù)R2為0.999 0～1，線性良好，結(jié)果見表1。

表1 15種酚類化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Table 1 Regression equation，correlation coefficien and linear range of fifteen phenolic compounds

2.4 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率試驗(yàn)

精密度試驗(yàn)中15種酚類的RSD值在0.17%～1.56%之間，表明該儀器精密度良好；重復(fù)性試驗(yàn)中15種酚類的RSD值在0.80%～1.35%之間，表明該方法重復(fù)性良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)中該15種酚類的RSD值在0.76%～2.31%之間，表明供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定；加樣回收率試驗(yàn)中15種酚類的平均回收率在85.60%～98.80%之間。

2.5 甜葉菊花和葉中酚類化合物含量測(cè)定

甜葉菊花和葉中酚類化合物含量的檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 甜葉菊花和葉中酚類化合物含量的檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection results of phenolic compounds contained in flower and leaf of Stevia rebaudiana Bertoni

由表2可以看出，甜葉菊葉片中含量最高的酚酸化合物為異綠原酸A，其次是綠原酸，而異綠原酸B、新綠原酸、隱綠原酸含量較少，1，3-二咖啡?？鼘幩岷孔畹?；花中同樣是異綠原酸A含量最高，綠原酸的含量次之，而異綠原酸C和異綠原酸B的含量相當(dāng)，隱綠原酸和1，3-二咖啡?？鼘幩岷枯^少?；ê腿~中酚酸總量分別達(dá)到（14.61±0.25）mg/g和（71.42±2.01）mg/g。

甜葉菊花和葉的類黃酮主要以類黃酮苷的形式存在，為槲皮素、木犀草素、山奈酚以及芹菜素的糖苷衍生物。在葉片中，除了山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷和山奈酚-3-O-鼠李糖苷的含量少于花中的含量，其他7種黃酮苷的含量均高于花中的含量，花和葉均以槲皮素-3-鼠李糖苷的含量最高。花和葉中類黃酮總量分別達(dá)（7.70±0.26）mg/g和（19.69±0.31）mg/g。

自Karak?se等[15]采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜在甜葉菊葉發(fā)現(xiàn)了24種酚類化合物后，Barroso等[6]采用HPLC法測(cè)定葡萄牙產(chǎn)甜葉菊葉片中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的含量分別為 0.55%、5.10%、0.29%、0.55%、4.92%、1.08%，綠原酸類總量達(dá)12.49%；郭志龍等[9]采用HPLC檢測(cè)國(guó)內(nèi)14個(gè)甜葉菊品種葉片中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的最高含量分別為 0.46%、3.29%、0.31%、0.32%、5.43%、1.95%，綠原酸類成分總量最高的品種可達(dá)9.78%。上述研究均顯示甜葉菊中酚酸化合物主要包括6種綠原酸類，其中主要成分均為綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C，綠原酸類成分是甜葉菊中一類含量較高的次生代謝產(chǎn)物，這一結(jié)論在本研究的甜葉菊品種中也成立（表2）。關(guān)于甜葉菊類黃酮化合物，Barroso等[6]通過HPLC-質(zhì)譜鑒定出了蘆丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-木糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷，推測(cè)了1種槲皮素糖苷化合物及4種山奈酚糖苷化合物，并指出類黃酮化合物中以槲皮素-3-O-鼠李糖苷含量最高（9.29 mg/g），這一結(jié)果在本研究中得以驗(yàn)證；本研究除了同樣鑒定出了蘆丁、槲皮素-3-O-木糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷外，還鑒定出了2種山奈酚、2種木犀草素和1種芹菜素的糖苷化合物，但沒有鑒定出槲皮素-3-O-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-葡萄糖苷，這或許是甜葉菊品種的差異所導(dǎo)致的。

3 結(jié)論

本研究通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定了甜葉菊花和葉中的16種酚類物質(zhì)，包括新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、1，3-二咖啡酰奎寧酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C等7種酚酸化合物和蘆丁、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-木糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷、山奈酚-3-O-鼠李糖苷等9種類黃酮化合物。

本研究建立了HPLC同時(shí)測(cè)定甜葉菊花和葉中16種酚類含量的方法，運(yùn)用該方法測(cè)定了花和葉中的酚類化合物的含量?；ê腿~中酚酸化合物均以異綠原酸A的含量最高，1，3-二咖啡?？鼘幩岷孔钌??；ê腿~中類黃酮化合物均以槲皮素-3-O-鼠李糖苷的含量最高，花中以芹菜素-7-O-葡萄糖苷含量最少，而葉中以槲皮素-3-O-木糖苷含量最少?；ê腿~中含有豐富的酚類化合物，甜葉菊的葉可以作為提取酚類成分的原料，而甜葉菊的花可以開發(fā)成為新型保健食品。