急性腦卒中患者血清PTX3、miR-199a的水平變化及臨床意義

張 芹，張淑青，王新昌，何 楠，魏丹丹，楊科朋

急性腦卒中是一種常見的腦血管疾病，可分為出血性卒中和缺血性卒中，其中缺血性卒中更為常見，約占80%[1]。急性腦卒中具有起病急、病情進(jìn)展快、致殘率高、致死率高等特點(diǎn)，可對(duì)患者的生活質(zhì)量以及生命健康構(gòu)成巨大的威脅[2]。由于急性腦卒中治療時(shí)間窗較短，因此快速、正確地分型診斷超早期腦卒中具有非常重要的臨床意義，其對(duì)患者的治療與轉(zhuǎn)歸均有直接的影響，除病史和體格檢查、影像學(xué)檢查外，實(shí)驗(yàn)室檢查在超早期腦卒中的診斷、分型中也有重要的作用[3]。正五聚蛋白3(pentraxin 3，PTX3)是一種參與了機(jī)體炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，且其在動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展中均起到了重要的作用[4]。miR-199a是一種與新生血管形成密切相關(guān)的微小RNA，過往的研究多為其與惡性腫瘤相關(guān)的內(nèi)容，然而近年來的研究發(fā)現(xiàn)[5]，miR-199a在腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮了一定的作用。本研究旨在探討急性腦卒中患者血清PTX3、miR-199a的表達(dá)情況，并進(jìn)一步分析了二者與患者神經(jīng)功能的關(guān)系及其對(duì)疾病的輔助診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月到2019年12月期間在我院接受治療的急性腦卒中患者83例作為研究組，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均為急性缺血性腦卒中，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《中國急性缺血性腦卒中診治指南》[6]；(2)發(fā)病至入院時(shí)間<6 h；(3)臨床資料完整；(4)患者家屬對(duì)本次研究知情同意，并簽署了知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有顱內(nèi)出血者；(2)合并惡性腫瘤者；(3)腦卒中復(fù)發(fā)病例；(4)合并慢性炎癥性疾病或者近期有嚴(yán)重感染性疾病；(5)存在嚴(yán)重心、肝、腎等重要臟器功能障礙者；(6)近期有大型外科手術(shù)史者。83例患者中男性53例，女性30例，年齡48～74歲，平均年齡(59.63±5.94)歲，合并基礎(chǔ)疾病：高血壓52例，糖尿病19例，高脂血癥15例，吸煙史35例。質(zhì)量指數(shù)17.52～24.83 kg/m2，平均體質(zhì)量指數(shù)(21.62±2.48)kg/m2。另選取同期在我院進(jìn)行體檢的志愿者40例作為對(duì)照組，其中男性26例，女性14例，年齡43～73歲，平均年齡(58.49±6.24)歲，合并基礎(chǔ)疾?。焊哐獕?8例，糖尿病8例，高脂血癥7例，吸煙史14例。質(zhì)量指數(shù)17.85～25.42kg/m2，平均體質(zhì)量指數(shù)(21.94±2.56)kg/m2。兩組研究對(duì)象的一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本次研究已獲得了我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)功能評(píng)估 采用美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institute of Health stroke scale，NIHSS)評(píng)估患者的神經(jīng)功能[7]，該得分越高代表病情越嚴(yán)重。根據(jù)NIHSS評(píng)分對(duì)研究組患者進(jìn)行再次分組，其中≤4分納入到輕度組(26例)，5～15分納入到中度組(30例)，≧16分納入到重度組(27例)。

1.2.2 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 抽取所有研究對(duì)象的靜脈血5 ml，以3000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，提取血清，采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清PTX3、中樞神經(jīng)特異蛋白(Soluble protein-100β，S100-β)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron-specific enolase，NSE)的水平。相關(guān)試劑盒購于南京建成生物工程研究所，相關(guān)檢測(cè)均嚴(yán)格遵循對(duì)應(yīng)試劑盒的操作指南進(jìn)行。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)血清中miR-199a的相對(duì)表達(dá)量，Trizol 試劑盒(Fcrmenas 公司)提取血清中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)提取cDNA，以U6為內(nèi)參基因，引物系列如下，U6正向引物：5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3’，反向引物：5’-ATGGAGCCACCGATCCACA-3’，miR-199a正向引物：5’-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3’，反向引物：5’-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3’。反應(yīng)條件：95℃預(yù)熱30 s，95℃ 15 s、60℃ 15 s、72℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-Ct法計(jì)算血清中miR-199a的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 兩組研究對(duì)象的相關(guān)指標(biāo)比較 研究組患者的血清PTX3、S100-β、NSE水平高于對(duì)照組，血清miR-199a水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，如表1所示。

表1 兩組研究對(duì)象的相關(guān)指標(biāo)比較

2.2 不同神經(jīng)功能患者的相關(guān)指標(biāo)比較 三組患者的血清PTX3、miR-199a、S100-β、NSE水平以及NIHSS評(píng)分整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，重度組患者的血清PTX3、S100-β、NSE水平以及NIHSS評(píng)分高于中度組和輕度組，血清miR-199a水平低于中度組和輕度組(P<0.05)，中度組患者的血清PTX3、S100-β、NSE水平以及NIHSS評(píng)分高于輕度組，血清miR-199a水平低于輕度組(P<0.05)(見表2)。

表2 不同神經(jīng)功能患者的相關(guān)指標(biāo)比較

2.3 血清PTX3、miR-199a與神經(jīng)功能的關(guān)系 經(jīng)Pearson分析顯示，急性腦卒中患者血清PTX3與S100-β、NSE、NIHSS評(píng)分均呈正相關(guān)(r=0.321、0.358、0.372，P<0.05)，血清miR-199a與S100-β、NSE、NIHSS評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.393、-0.412、-0.405，P<0.05)。

2.4 血清PTX3、miR-199a對(duì)急性腦卒中的診斷價(jià)值分析 ROC分析顯示(見圖1)，血清PTX3、miR-199a對(duì)急性腦卒中均有一定的診斷價(jià)值，PTX3和miR-199a的曲線下面積分別為0.864(95%CI0.799～0.928)、0.807(95%CI0.704～0.910)，二者聯(lián)合診斷時(shí)兩者均為陽性結(jié)果為陽性，否則為陰性，結(jié)果顯示二者聯(lián)合可進(jìn)一步提高對(duì)急性腦卒中的診斷價(jià)值，具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 血清PTX3、miR-199a對(duì)急性腦卒中的診斷價(jià)值分析

圖1 血清PTX3、miR-199a對(duì)急性腦卒中的診斷價(jià)值分析(A：PTX3；B：miR-199a)

3 討 論

腦部血液供應(yīng)障礙是急性缺血性腦卒中的重要發(fā)病原因，腦部組織缺血后會(huì)出現(xiàn)缺血、缺氧性損傷，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致部分腦組織壞死，出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)功能障礙。急性腦卒中是世界第二、中國首位的死亡原因，患者在發(fā)病3 m時(shí)病死率為9%～9.6%，而致殘率為34.5%～37.1%，嚴(yán)重威脅中老年人群的生命健康[8]。據(jù)統(tǒng)計(jì)[9]，我國近20年來急性腦卒中的死亡率并沒有下降，而且隨著老年化社會(huì)的到來，其患病率和發(fā)病率已呈增高趨勢(shì)，如何有效的防治急性腦卒中已成為我國重要的公共衛(wèi)生問題。

動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致斑塊破裂性血栓形成的病理基礎(chǔ)，其為各種缺血性心腦血管疾病的重要病理改變。PTX3是一種與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)的蛋白，位于人第3號(hào)染色體q25，其可有效促進(jìn)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，參與了急性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展[10]。近年研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA在缺血性腦卒中的病理生理機(jī)制中扮演著重要的角色，急性腦卒中患者的微小RNA表達(dá)譜有明顯變化，且這些異常表達(dá)的微小RNA通常與機(jī)體的炎癥、免疫反應(yīng)、內(nèi)皮功能損傷等有關(guān)[11]。miR-199a是近年來發(fā)現(xiàn)的與心腦血管疾病密切相關(guān)的微小RNA，其可介導(dǎo)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，參與了動(dòng)脈粥樣硬化的形成[12]。本研究結(jié)果顯示，研究組患者的血清PTX3水平高于對(duì)照組，血清miR-199a水平低于對(duì)照組，且隨著神經(jīng)功能損害加深，患者的血清PTX3水平逐漸升高，而血清miR-199a水平則逐漸降低，由此可見PTX3、miR-199a在急性腦卒中患者血清中呈異常表達(dá)，且其表達(dá)水平與患者的神經(jīng)功能損傷情況有關(guān)。PTX3是一種炎癥相關(guān)因子，其不但可以促進(jìn)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，同時(shí)其表達(dá)水平也與機(jī)體的炎癥反應(yīng)程度存在正反饋調(diào)節(jié)的關(guān)系，血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤壞死因子-ɑ、白介素-6等促炎因子的刺激下會(huì)增加PTX3的分泌[13]，進(jìn)而導(dǎo)致急性腦卒中的血清PTX3水平上升。miR-199a與急性腦卒中的研究尚處于初級(jí)階段，其在患者血清中表達(dá)降低可能與血流剪切力大小有關(guān)，相關(guān)研究顯示[14]，血管內(nèi)皮細(xì)胞在受到高剪切力后miR-199a的表達(dá)下降，而在受到低剪切力時(shí)其表達(dá)會(huì)明顯上調(diào)[15]。血栓的存在會(huì)導(dǎo)致血管壁的壓力和壁面剪切力上升，因此在急性腦卒中患者血栓形成的血管壁附近存在較高的血流剪切力，進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞中的miR-199a的表達(dá)下降，這可能是急性腦卒中患者血清miR-199a低表達(dá)的原因之一。此外，本研究結(jié)果還顯示，急性腦卒中患者血清PTX3與S100-β、NSE、NIHSS評(píng)分均呈正相關(guān)，血清miR-199a與S100-β、NSE、NIHSS評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)，這進(jìn)一步說明PTX3、miR-199a的表達(dá)水平與患者的神經(jīng)功能有關(guān)。PTX3可通過促進(jìn)平滑肌細(xì)胞遷移和增殖、上調(diào)組織因子的表達(dá)導(dǎo)致機(jī)體處于高凝狀態(tài)等方面來增加血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)，并且在出現(xiàn)急性腦卒中后還可以通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)加重患者的病情，增加患者的神經(jīng)功能損傷程度[16，17]。miR-199a亦是一種炎癥相關(guān)因子，曾慶壇等[18]的研究顯示，動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊內(nèi)miR-199a可有效抑制單核細(xì)胞炎性反應(yīng)，還有相關(guān)研究顯示[19]，miR-199a下降可導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，因此miR-199a可能是通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮功能來影響患者的病情，進(jìn)而影響患者的神經(jīng)功能。在診斷價(jià)值方面，ROC分析顯示，血清PTX3、miR-199a診斷急性腦卒中時(shí)的曲線下面積分別為0.864(95%CI0.799～0.928)、0.807(95%CI0.704～0.910)，可見二者對(duì)疾病均有一定輔助診斷價(jià)值。然而兩指標(biāo)的特異性均較低，故在聯(lián)合診斷時(shí)采用了串聯(lián)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，二者聯(lián)合可進(jìn)一步提高對(duì)急性腦卒中的診斷價(jià)值。

綜上所述，急性腦卒中患者血清PTX3呈高表達(dá)，miR-199a呈低表達(dá)，且二者的表達(dá)均與患者的神經(jīng)功能密切相關(guān)，二者對(duì)疾病均有一定輔助診斷價(jià)值。由于研究時(shí)間所限，僅有少量患者得到了長時(shí)間的隨訪，大部分患者的隨訪資料還在統(tǒng)計(jì)中，因此并未分析兩指標(biāo)與患者預(yù)后的關(guān)系，這一部分研究將在后續(xù)完成。