失眠患者血清鈣調(diào)蛋白及GABA/Glu水平檢測及其意義

蘇 婷，高 威，李華欣，袁 梅

失眠的定義是指有足夠的時間和睡眠環(huán)境適宜的情況下，對睡眠效果不滿意的主觀體驗，表現(xiàn)為難以入睡、睡眠維持障礙、早醒、睡眠質(zhì)量下降和總睡眠時間減少，是一種最常見的睡眠障礙[1，2]。2006 年中國睡眠研究會進行了一項研究，范圍涉及6個城市，其結(jié)果表明，中國內(nèi)地成人失眠的平均發(fā)生率為 57%(44%～68%)[3]。2008年一項國際綜合調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)睡眠問題的患病率在美國為56%，在西歐為31%，在日本為23%[4]。失眠對患者的身心健康和生活質(zhì)量造成嚴重影響，因失眠產(chǎn)生的疲勞、精神不集中是造成交通事故和安全生產(chǎn)事故的主要原因之一，對個人和社會都造成嚴重的損失[5]。

但目前失眠的發(fā)病機制尚不明確。多個研究結(jié)果表明，多種神經(jīng)遞質(zhì)如谷氨酸(glutamate，Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)等參與了中樞對睡眠的調(diào)節(jié)且發(fā)揮了相當關(guān)鍵的作用[6～8]。神經(jīng)遞質(zhì)主要是由神經(jīng)元突觸以囊泡胞吐形式釋放到突觸間隙實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導，該過程是由鈣離子(calcium，Ca2+)流信號觸發(fā)。Ca2+在細胞外信號轉(zhuǎn)導和神經(jīng)元功能控制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。它參與控制神經(jīng)細胞膜的興奮性、神經(jīng)分泌、突觸可塑性、基因表達和程序性細胞死亡。而鈣離子的生理功能主要通過鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)來實現(xiàn)。CaM調(diào)節(jié)突觸蛋白磷酸化，并在調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放中發(fā)揮作用。這些研究表明，CaM可能在神經(jīng)遞質(zhì)GABA、Glu的調(diào)控中起到重要作用。然而，異常表達的CaM是否通過影響GABA及Glu水平參與失眠的發(fā)病目前尚無報道。本文通過檢測血清CaM及GABA/Glu 在失眠患者血清中的水平及其相關(guān)性，探討其與失眠發(fā)病的相關(guān)性。

1 對象和方法

1.1 一般資料 本研究失眠組為2017 年1月至 2019 年4月南華大學附屬第二醫(yī)院睡眠中心就診的符合入選標準的失眠患者，共119例，其中男51例，女68例，平均年齡(51.65±11.73) 歲。健康對照組為南華大學附屬第二醫(yī)院健康體檢者，隨機選取102例，其中男45例，女57例)，平均年齡(51.53±13.12) 歲。

1.2 診斷與納入、排除標準 納入標準：(1)年齡≥18周歲；(2)所有失眠組的患者均符合睡眠障礙國際分類第三版失眠的診斷標準；(3)失眠組的患者失眠病程≥3 m。所有研究者有以下任意情況之一者均排除在本研究之外：(1)腦血管??；(2)多導睡眠圖(PSG)監(jiān)測排除合并有睡眠呼吸暫停綜合征、不寧腿綜合征、快速動眼運動睡眠期行為異常(RBD)等其他睡眠障礙性疾??；(3)有嚴重的心肺肝腎功能障礙患者；(4)嚴重的內(nèi)分泌疾病、自身免疫性疾病、癌癥、感染性疾病、傳染性疾病、血液系統(tǒng)疾病病史；(5)近期有外傷手術(shù)史、妊娠史；(6)HAMA焦慮量表評分>14分，HAMA抑郁量表評分≥18分。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準(倫理編號2016-01-0001)，所有研究對象或家屬均簽署知情同意書。

1.3 研究方法 血漿CaM、GABA、Glu水平測定：抽取失眠組及對照組靜脈血約3 ml，室溫放置2 h或4 ℃過夜后于3000 r/min，離心20 min，收集血清 0.5 ml，-20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆?。CaM水平采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗法，使用奧地利tacan GmbH 5082全自動酶標儀測定。人CaM-ELISA試劑盒購自蘇州卡爾文生物科技有限公司。GABA和Glu的測定采用雙抗體夾心法測定。Glu和GABA標準品由美國Sigma公司提供。檢測過程嚴格按照試劑盒的說明操作。

2 結(jié) 果

2.1 失眠組和對照組患者一般資料和血清 CaM 、GABA、Glu水平的比較 (1)失眠組中性別、年齡和對照組比較(P>0.05)，無統(tǒng)計學差異；(2)失眠組患者與對健康照組相比，血清CaM、GABA、GABA/Glu水平降低，Glu水平升高，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表 1)。

表1 失眠組和對照組患者一般資料和血清生化指標的比較

2.2 失眠組患者血清CaM水平與GABA/Glu水平的關(guān)系 進一步通過 pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，失眠患者血清 CaM 水平與GABA/Glu水平呈正相關(guān)(r=0.475，P<0.01)(見圖1)。

圖1 血清CaM水平與GABA/Glu水平的關(guān)系

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)失眠患者血清CaM水平降低、GBAB水平下降，Glu 水平升高，GABA/Glu水平下降，且血清CaM水平與GABA/Glu水平呈正相關(guān)，對失眠發(fā)病機制的研究具有重要意義。

腦內(nèi)興奮性和抑制性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的水平失衡是失眠的重要病因，據(jù)研究，人的大腦中有一百多種腦神經(jīng)質(zhì)，其中與失眠有直接關(guān)系的主要有GABA、Glu等，這些物質(zhì)是參與睡眠覺醒周期調(diào)節(jié)的過程中最主要神經(jīng)遞質(zhì)。GABA是一種廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[9]；在谷氨酸脫羧酶的催化下由興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸通過脫羧反應(yīng)而產(chǎn)生，并與突觸后膜的 GABA 受體結(jié)合，導致離子通道打開，使帶負電的氯離子流入細胞，帶正電的鉀離子流出細胞，通過突觸后神經(jīng)元放電速率減慢來抑制中樞神經(jīng)元[10]。Watson等[11]研究結(jié)果顯示，大鼠快速動眼睡眠減少、覺醒增加與腦橋網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中GABA水平的下降有關(guān)。GABA在大腦組織中的含量與睡眠-覺醒的深度呈正相關(guān)[12，13]。發(fā)表在Sleep 雜志上的研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，原發(fā)性失眠患者的平均腦GABA水平降低了近30%。

Glu是腦中含量最高的游離氨基酸，主要分布于海馬、大腦皮質(zhì)、紋狀體和小腦，是腦組織中重要的興奮性氨基酸類遞質(zhì)[14]。Glu對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元可以起到興奮作用，如果Glu的釋放過量，就會產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性，從而誘發(fā)失眠。一項關(guān)于分析內(nèi)因性失眠癥的研究顯示失眠患者GABA 水平明顯降低，而 Glu水平明顯升高[15]。這與我們的研究結(jié)果一致。

腦內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Glu與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA循環(huán)代謝保持相對平衡狀態(tài)，兩者的比值 GABA/Glu常用作評估中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮和抑制狀態(tài)。既往研究結(jié)果表明，腦內(nèi)Glu和GABA含量及其受體功能的改變在睡眠的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，參與睡眠-覺醒過程及不同睡眠時相的轉(zhuǎn)換[16]。目前直接測定失眠患者腦內(nèi)Glu和GABA水平較困難，但既往研究顯示可以通過測定Glu和GABA在血漿中的水平間接反映其在腦內(nèi)的水平[6，7]。有研究表示Glu/GABA的比值可以作為判斷失眠的客觀指標[17]。本研究結(jié)果顯示，失眠患者血清GBAB/Glu水平低于健康對照組。這表明失眠患者存在血清GBAB、Glu比例失衡。

CaM 是一種高度保守的酸性蛋白質(zhì)，廣泛存在于各種真核生物細胞，它由 148 個氨基酸組成單條多肽，CaM能與Ca2+結(jié)合。Ca2+被稱為細胞內(nèi)的第二信使，其濃度變化可調(diào)節(jié)細胞的功能，調(diào)節(jié)各種細胞事件(包括運動性，胞吐作用，細胞骨架組裝，肌肉收縮等)，這種調(diào)節(jié)主要通過鈣調(diào)蛋白來實現(xiàn)。

鈣調(diào)蛋白以高濃度(最高約100 μmol/L)存在于大腦中。Ca2+/CaM信號通路在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程中發(fā)揮著重要的作用。在腦內(nèi)，鈣調(diào)蛋白功能被認為可能與包括癲癇，卒中、記憶力減退和智力障礙等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理狀況有關(guān)。Wen 等運用外傷性大鼠模型研究發(fā)現(xiàn)外傷性后前額內(nèi)側(cè)皮質(zhì)Ca2+濃度增高，可激活CaM信號轉(zhuǎn)導通路，導致認知功能失調(diào)[18]。急性缺血性腦卒中患者血清 CaM 水平明顯增高，可作為判定腦梗死病情嚴重程度的重要指標[19]。CaMKIIγ是一種參與長期可塑性，學習和記憶的絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，它是鈣調(diào)蛋白的主要靶點。有研究顯示，CaMKIIγ(R292P)中的點突變會干擾鈣調(diào)蛋白向細胞核的穿梭，從而破壞空間學習，記憶并導致智力障礙[20]。在另一項研究中，Kv7鉀離子通道的突變可以降低鈣調(diào)蛋白的結(jié)合，從而破壞到質(zhì)膜的通道運輸。因此，神經(jīng)元的興奮性和放電頻率會受到影響，導致從輕度癲癇到早發(fā)性腦病的病理狀態(tài)[21]。此外，已通過實驗證實鈣調(diào)蛋白在阿爾茨海默病的傳導過程中的關(guān)鍵作用，并表明干擾鈣調(diào)蛋白結(jié)合或突變的功能可導致嚴重的神經(jīng)病理淀粉樣β斑塊形成[22]。這些研究結(jié)果共同證明了鈣調(diào)蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控中有重要作用。

然而，CaM是否與失眠的發(fā)病有關(guān)目前尚無報道。既往的研究和及我們的研究均表明，失眠與Glu、GABA等神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)[9][14]。其中，Glu是海馬區(qū)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，它的釋放是對突觸前神經(jīng)元膜去極化的反應(yīng)，并激活突觸后Glu受體。Glu受體的激活打開了連接到受體的離子通道，允許細胞外的鈣進入細胞內(nèi)的細胞質(zhì)，觸發(fā)了一系列的生化事件。Glu、GABA等神經(jīng)遞質(zhì)主要是由神經(jīng)元突觸以囊泡胞吐形式釋放到突觸間隙實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導，該過程是由Ca2+流信號觸發(fā)。Ca2+信號經(jīng)不同的鈣離子感受器蛋白將胞內(nèi)Ca2+濃度變化的信號傳遞給多種依賴Ca2+信號而發(fā)揮生物學功能，最終調(diào)控不同功能。而鈣離子生理功能的發(fā)揮主要是由CaM來調(diào)節(jié)。在神經(jīng)細胞中，CaM通過與多種相關(guān)蛋白的相互作用調(diào)控神經(jīng)細胞胞吞、胞吐、遞質(zhì)釋放作用方面受到廣泛的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)素拮抗劑，三氟拉嗪(TFP) 抑制了GABA的釋放，在去極化過程中，由細胞內(nèi)鈉水平升高和鈣進入神經(jīng)末梢所引起的遞質(zhì)釋放可能是由鈣調(diào)蛋白依賴過程介導的[23]。有證據(jù)表明，CaM調(diào)節(jié)突觸蛋白磷酸化，并在GABA、Glu等調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放中發(fā)揮作用。有報道發(fā)現(xiàn)JuA，一種非競爭性的CaM抑制劑，對小鼠活性有抑制作用[24]。JuA對谷氨酸介導的海馬興奮性信號通路具有抑制作用[25]，可能是通過其抗CaM發(fā)揮作用[26]。我們的研究發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白與GABA/Glu水平呈正相關(guān)。推測鈣調(diào)蛋白可能通過調(diào)控GABA、Glu等神經(jīng)遞質(zhì)釋放，影響GABA/Glu比值，而參與失眠的發(fā)病。CaM 在失眠發(fā)病的具體機制研究還需要進一步通過鈣調(diào)蛋白拮抗劑的動物實驗等來驗證。鈣調(diào)蛋白有望成為預(yù)測和治療失眠的一項新方法，對降低失眠的發(fā)生率及改善睡眠具有重要的意義。