基于酶解修飾的玉米蛋白-葉黃素納米粒制備

常影，焦巖, *，佟佳路，崔璐麟，韓赫，鄭博瀚

1. 齊齊哈爾大學食品與生物工程學院（齊齊哈爾 161006）；2. 黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室（齊齊哈爾 161006）

葉黃素是人體所需的一種重要的類胡蘿卜素，來源于多種植物的果實、根莖和花等，具有多種生理功能和保健作用。葉黃素對單線態(tài)氧和自由基具有較強的清除作用，能夠減少自由基對機體的損傷和增強免疫力[1-2]；葉黃素可以過濾對人體有害的藍光，減少其對人體皮膚和視網膜等輻射損傷[3]；葉黃素和玉米黃素在人體視網膜中發(fā)揮重要作用，可保護視網膜中的黃斑區(qū)防止損傷[4]；葉黃素還具有抗炎和抗免疫反應作用，可防止動脈硬化等疾病的發(fā)生，還具有預防和抑制多種癌癥等功效[5-7]。但是，葉黃素分子結構中含有多個不飽和雙鍵等活性基團，不僅溶解性差，而且在光、熱和酸堿等條件下極易發(fā)生分解和喪失活性，在體內吸收利用率也較低。因此，目前多采用分子包埋等方法來提高葉黃素的穩(wěn)定性和體內外傳遞性能[8]。

玉米蛋白是一種醇溶性蛋白，來自于玉米淀粉加工的副產物玉米黃粉中，具有安全無毒、可生物降解等優(yōu)點，被廣泛用于食品和飼料等行業(yè)[9]。玉米蛋白分子含有較多的疏水性氨基酸，具有兩親性質和自組裝性能，對脂溶性成分具有包埋和載運和緩控釋作用，作為葉黃素等生物活性物質載體具有生物相容性、可降解性、自組裝性及抗分解等優(yōu)點，可提高有效提活性成分的穩(wěn)定性，延長活性成分作用時間，因此近年來多用于活性油脂、香精香料等成分的負載與包埋，以提高其穩(wěn)定性和生物活性[10-11]。

但是，玉米醇溶蛋白含有較多的疏水性氨基酸，溶解性和吸收性較差，難以將負載芯材輸送到有效部位而增強吸收和利用率。

因此，研究采用酶法修飾玉米醇溶蛋白可改變其微觀結構和功能特性，限制性酶解得到的玉米蛋白肽作為功能載體可顯著提高對葉黃素的包封率、溶解分散性和穩(wěn)定性，進而增強葉黃素的活性和生理功能。本研究為玉米蛋白作為葉黃素類生物活性有效載體及其功能性研究與開發(fā)提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高純度玉米醇溶蛋白，胃蛋白酶，美國Sigma公司。葉黃素，純度≥95%，上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、石油醚和其他化學試劑等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Nano-Zs90粒徑分析儀，德國新帕泰克有限公司；F30型透射電子顯微鏡，美國FEI公司；RE2000E型旋轉蒸發(fā)儀，西安太康生物科技有限公司；CJJ-931型磁力加熱攪拌器，常州萬達升實驗儀器有限公司；TDL-5-A型離心機，上海安亭科學儀器廠；UV-2450型紫外分光光度計，日本島津；PC/PLC LD-53型冷凍干燥機，美國Millrock公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米蛋白酶法修飾

采用胃蛋白酶對玉米醇溶蛋白進行酶解修飾：取0.5 g玉米醇溶蛋白加入到25.0 mL純水中混勻，加入一定量的胃蛋白酶，調節(jié)pH，在40～65 ℃條件下酶解1～6 h。酶反應后在95 ℃條件下蒸煮5 min滅酶。玉米蛋白酶解物凍干后儲存在4 ℃條件下備用[12]。

1.3.2 玉米醇溶蛋白（Zein）及其酶修飾產物（ZH）負載葉黃素納米粒的制備

根據前期研究方法采用反溶劑法制備ZL和ZHL納米粒，并進行適當改進：取一定量的玉米醇溶蛋白（Zein）或其酶修飾產物（ZH）溶解到85%的乙醇溶液中配制成質量濃度0.5 mg/mL溶液，加入等體積85%葉黃素乙醇溶液，在1 000 r/min下室溫磁力攪拌30min，然后在3 000 r/min下離心5 min，取上清液注入到等體積磷酸鹽緩沖液中混勻后，經真空濃縮法除去乙醇，得到ZL和ZHL納米粒溶液[13]。

1.3.3 葉黃素標準曲線的制作及含量的測定

取上述配制不同質量濃度的葉黃素85%乙醇溶液，在最大吸收波長445 nm處測定吸光度，制作葉黃素標準曲線，如圖1所示。得到葉黃素質量濃度與吸光度的標準方程y=0.176 3x+0.004 4（R2=0.999 1），因此，0.5～3.0 mg/mL質量濃度范圍內葉黃素標準液在波長445 nm處線性關系良好[13]。

1.3.4 包封率的測定

取3.0 mL ZL和ZHL納米粒溶液，加入3 mL石油醚振蕩混勻1.0 min，在3 000 r/min離心轉速下離心5.0min，重復試驗操作3次，合并上清液，在445 nm處測吸光度并計算葉黃素含量，根據以式（1）計算包封率[14]。

圖1 葉黃素標準曲線

式中：EE為包封率，%；C為葉黃素溶液質量濃度，μg/mL；M為葉黃素總質量，μg；V為溶液的總體積，mL。

1.3.5 酶解修飾玉米醇溶蛋白對葉黃素包封率影響單因素試驗

1.3.5.1 酶解時間對玉米蛋白負載葉黃素包封率的影響

將0.5 g玉米醇溶蛋白加入到25.0 mL純水中混勻，在胃蛋白酶用量為1.5%，溫度為50 ℃條件下酶解1～6h，酶反應后在95 ℃條件下蒸煮5 min滅酶。按照上述方法制備ZL和ZHL納米粒并測定包封率，研究酶解時間對玉米蛋白負載葉黃素包封率的影響。

1.3.5.2 酶用量對玉米蛋白負載葉黃素包封率的影響

在胃蛋白酶用量分別為5，10，15，20，25和30 mg/g蛋白，pH 3.0，溫度為50 ℃條件下酶解4 h，酶反應后在95 ℃條件下蒸煮5 min滅酶。按照上述條件制備ZL和ZHL納米粒并測定包封率，研究酶用量對玉米蛋白負載葉黃素包封率的影響。

1.3.5.3 酶解溫度對玉米蛋白負載葉黃素包封率的影響

在胃蛋白用量分別為1.5%，pH 3.0，溫度為40，45，50，55，60和65 ℃條件下酶解4 h，酶反應后在95 ℃條件下蒸煮5 min滅酶。按照上述方法制備ZL和ZHL納米粒并測定包封率，研究酶解溫度對玉米蛋白負載葉黃素包封率的影響。

1.3.6 酶解修飾玉米蛋白制備葉黃素納米粒正交試驗

在單因素試驗的基礎上選取酶解時間、酶用量、酶解溫度和pH 4個主要的影響因素，以葉黃素包封率為指標，采用正交試驗設計，分別采用酶解玉米蛋白進行負載葉黃素納米粒制備試驗。正交試驗設計見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.7 粒徑分析測定

將上述方法制備的ZL和ZHL納米粒溶液用0.45 μm濾膜過濾，取1.0 mL樣品置于Nano-Zs90粒徑分析儀樣品池中進行分析，得到二者的粒徑大小分布圖譜[15]。

1.3.8 透射電子顯微鏡（TEM）觀察

將ZL和ZHL納米粒樣品放入具有碳膜的400目的銅格柵上，然后采用紅外燈將載有納米顆粒的銅格柵烘干，15 min后進行觀測ZL和ZHL納米粒的微觀結構[16]。

1.3.9 數據分析

所有試驗均進行3次平行試驗，數據分析采用SPSS 10.0和Excel軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 ZHL納米粒制備單因素試驗結果與分析

2.1.1 玉米蛋白酶解時間對葉黃素包封率的影響

由圖2以看出，隨著酶解時間的延長，由于大分子的玉米蛋白不斷的被蛋白酶水解為小分子蛋白和肽類，和葉黃素的結合效率提高，因此，玉米蛋白酶解物對葉黃素的包封率逐漸升高，4 h達到最大。當酶解時間繼續(xù)增加，葉黃素包封率降低，可能是由于產生較多的小分子肽類不利于葉黃素的包埋而使得包埋率有所降低，因此，酶解4 h所制備的玉米蛋白酶解物負載葉黃素效果最佳。

圖2 玉米蛋白酶解時間對葉黃素包封率的影響

2.1.2 酶用量對葉黃素包封率的影響

由圖3以看出，在酶用量較低的情況下，由于蛋白酶的濃度低，酶解效率低，從而使得葉黃素包封效果較差；當酶用量達到15 mg/g時，酶對底物蛋白適當水解，酶解產物能夠與葉黃素結合充分，包封率最高；但當酶用量超過15 mg/g時，由于酶解過度，產生大量的小分子物質，包封率又出現下降趨勢，因此，該酶用量條件下所制備葉黃素納米粒效果最好。

圖3 酶用量對葉黃素包封率的影響

2.1.3 玉米蛋白酶解溫度對葉黃素包封率的影響

由圖4可知，溫度對玉米蛋白的酶解效果和葉黃素的包封率有重要影響，隨著溫度的增加，包封率增大，在40～55 ℃之間，增加的趨勢較為明顯，當溫度超過55 ℃，包封率變化呈下降趨勢。因為溫度升高有助于酶活性增強，進而酶解蛋白產生較多的小分子蛋白提高對葉黃素的包封率，但是由于溫度過高會使蛋白變性，使酶逐漸失去活性，使酶解效率降低，因此，55 ℃時為最適酶解溫度。

圖4 玉米蛋白酶解溫度對葉黃素包封率的影響

2.1.4 玉米蛋白酶解pH對葉黃素包封率的影響

由圖5可知，胃蛋白酶受pH的影響較大，酶活性在酸性pH 1.0～2.0條件下酶活較高。但是，pH較低時葉黃素不穩(wěn)定，且影響水解物對其包封效果，當酶解的pH達到3.0時酶解物對葉黃素的包封效果最佳，可達到94.8%，此pH條件下蛋白被適度水解，有利于與葉黃素結合使得包封效果較好。隨著pH的升高，酶的活性逐漸減小，酶解效果降低使得對葉黃素的包封率降低。

圖5 玉米蛋白酶解pH對葉黃素包封率的影響

2.2 正交試驗結果與分析

按上述方法分別進行正交試驗測定葉黃素的包封率，結果如表2所示。

表2 正交試驗設計及結果

從表2可知，玉米蛋白酶解對葉黃素包封率影響因素大小順序為C（酶解溫度）＞D（pH）＞A（酶解時間）＞B（酶解用量），最佳組合為A1B1C2D1，在此最佳組合條件下進行重復試驗驗證，得到優(yōu)化后葉黃素的包封率為95.86%±0.95%（n=3），小于A1B2C2D2條件下包封率，即酶解時間3 h、酶解用量15 mg/g、酶解溫度55 ℃、酶解pH為3.0，此時葉黃素最大包封率，為96.03%±1.38%。

2.3 玉米蛋白酶解修飾前后對葉黃素包封效率的比較分析

按照1.3.2方法分別制備ZL和ZHL納米粒，對葉黃素的包封率進行分析測定，并對酶解修飾前后玉米蛋白負載葉黃素納米粒包封率進行比較分析，如圖6所示，玉米蛋白對葉黃素的包封率為80.79%±1.05%，而經過酶解修飾后的玉米蛋白對葉黃素的包封率在上述條件下最大可達96.03%±1.38%，包封率提高了15.24個百分點，說明經胃蛋白酶修飾的玉米蛋白可有效提高對葉黃素的負載能力。

2.4 ZL和ZHL納米粒粒徑分析

采用Nano-Zs90粒徑分析儀對玉米蛋白負載葉黃素納米粒（ZL）和酶解玉米蛋白負載葉黃素納米粒（ZHL）的粒徑分析，如圖7可知，所制備的ZL和ZHL納米粒的粒徑分布范圍較窄，大小均在100 nm范圍，且粒子徑分布區(qū)域較為均勻，說明玉米蛋白和酶解后的玉米蛋白均能通過上述反溶劑法對葉黃素進行負載包埋形成微觀納米粒子結構，粒子在溶液中分布較為均一穩(wěn)定。在相同條件下，ZL納米粒的平均粒徑為（158.40±3.22）nm，而該酶解玉米蛋白條件下ZHL納米粒的粒徑為由于酶解作用平均粒徑減小為（112.24±1.56）nm，可能是由于酶解作用產生了小分子蛋白和多肽，與葉黃素結合較好，導致所制備的納米粒的粒徑有所減小，并提高了葉黃素的包封效果。

圖6 酶解修飾前后玉米蛋白對葉黃素包封率比較

圖7 ZL和ZHL納米粒的粒徑分布

2.5 透射電子顯微鏡（TEM）結果與分析

采用H-7650透射電子顯微鏡對ZL和ZHL納米粒的微觀結構進行分析和比較，如圖8和圖9所示，玉米蛋白及其酶解物均能夠與葉黃素結合形成納米粒子復合體結構。Zein與葉黃素形成的納米粒ZL大致呈球形顆粒狀態(tài)，粒徑分布范圍在200 nm范圍以內，但是納米粒子聚集較多，分布不是很均勻，結果導致粒徑變大。而ZHL納米粒的粒子徑分布較小，且粒子比較均勻，分散性較好，與Nano-Zs90粒子徑分析結果較為一致。研究結果表明，酶解后的玉米蛋白由于顆粒減小，疏水性降低，在溶液中分散性和溶解性提高，能夠與葉黃素結合，對其負載形成均一穩(wěn)定的微納米結構和包埋體系，有效提高了葉黃素的分散性和穩(wěn)定性。

圖8 ZL透射電子顯微鏡微觀結構圖

圖9 ZHL透射電子顯微鏡微觀結構圖

3 結論

研究采用酶法對玉米蛋白進行酶解修飾提高對葉黃素的負載性能和包封效率。對酶解玉米蛋白-葉黃素納米粒的制備工藝條件進行了探討，并對其微觀結構進行了比較和分析。研究得到了玉米蛋白負載葉黃素納米粒的最佳制備工藝條件：在胃蛋白酶濃度15 mg/g、溫度55 ℃、pH 3.0，酶解時間3 h時，對葉黃素包封率最大為96.03%±1.38%，相比修飾前的80.79%±1.05%提高了15.24個百分點。Nano-Zs90分析儀和透射電鏡分析表明：經胃蛋白酶酶解修飾后的玉米蛋白負載葉黃素納米粒粒徑較小，分散性良好，且對葉黃素的包封效果提高。因此，采用酶解修飾方法可以提高玉米蛋白作為生物活性成分載體的負載性能，充分保護葉黃素在光熱等環(huán)境下的降解和損失，提高其穩(wěn)定性和生物活性，并且有利于增強葉黃素在水溶液中的溶解分散性，對于葉黃素類脂溶性活性物質的體內吸收利用和生物活性的發(fā)揮有重要的促進作用。