疲勞運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌代謝組學(xué)研究

郭新明，吳麗君，孫 卓，向 歡，田俊生

運(yùn)動(dòng)作為一種應(yīng)激源對機(jī)體機(jī)能會(huì)產(chǎn)生重要影響。長時(shí)間、中等強(qiáng)度適量運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)機(jī)體有氧代謝、增強(qiáng)心肺功能、提高機(jī)體免疫力。急性大強(qiáng)度或長時(shí)間大運(yùn)動(dòng)量運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體氧化還原失衡進(jìn)而造成機(jī)體氧化損傷及肌肉疲勞[1-2]，甚至引發(fā)各種疾病，如：神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫炎癥損傷、關(guān)節(jié)肌肉損傷等[3-5]。

代謝組學(xué)（metabonomics/metabolomics）是20世紀(jì)90年代末，自人類基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之后，迅速發(fā)展起來的以高通量檢測與數(shù)據(jù)處理為手段、以信息建模與系統(tǒng)整合為目標(biāo)、以群組指標(biāo)分析為基礎(chǔ)的一門生物學(xué)科[6]?？梢圆活A(yù)先設(shè)定將要檢測的具體指標(biāo)“全景式”掃描所有代謝產(chǎn)物，從而反映藥物、環(huán)境、運(yùn)動(dòng)等外界因素對機(jī)體代謝的影響[7-9]。目前，代謝組學(xué)技術(shù)已經(jīng)在功能基因組學(xué)、生理學(xué)、毒理學(xué)、疾病診斷、藥物療效與作用機(jī)理等方面廣泛應(yīng)用[10]。在體育領(lǐng)域少有學(xué)者采用代謝組學(xué)方法進(jìn)行探究?；谄谶\(yùn)動(dòng)對機(jī)體產(chǎn)生較大擾動(dòng)，本研究采用1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)研究疲勞運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌小分子物質(zhì)代謝的變化狀況，試圖從代謝角度闡明疲勞運(yùn)動(dòng)對機(jī)體機(jī)能產(chǎn)生影響的作用途徑與機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象與分組

20只7周齡健康雄性SD大鼠（體重160～180 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號：SCXK（京）2012-0001）適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對照組C與運(yùn)動(dòng)組E（每組10只）。每籠5只分籠飼養(yǎng)，溫度為25～28℃，相對濕度為40%～60%，游泳適應(yīng)訓(xùn)練在（30±2）℃約40 cm的水中進(jìn)行。

1.2 疲勞模型的建立與判定

疲勞模型參照A.KALANTARⅠ[11]與侯麗娟[12]的大鼠游泳運(yùn)動(dòng)方案。實(shí)驗(yàn)正式開始前，E組大鼠適應(yīng)性游泳3天，再分3階段進(jìn)行正式游泳訓(xùn)練，每階段7天共21天。第1階段：大鼠每天下午自2：30開始游泳100 min；第2階段：大鼠每天下午自2：30開始游泳3 h；第3階段：大鼠每天分別于上午8：00，下午2：30開始各游泳3 h。大鼠游泳期間，采用木棒驅(qū)使以保證其不停歇地運(yùn)動(dòng)。

疲勞判定方法為大鼠游泳時(shí)肢體不協(xié)調(diào)且在10 s內(nèi)不能上浮至水面進(jìn)行自主呼吸[12-13]。

1.3 檢測方法

1.3.1 試劑與儀器 主要有Brucker600-MHz AVACNCEⅢNMR核磁共振儀（600.13 MHz proton frengnency）；可調(diào)高速勻漿機(jī)；渦旋混合器；高速冷凍離心機(jī)；臺式真空離心濃縮系統(tǒng)（eppendorf）；磷酸鹽緩沖液（0.01%的TSP，0.2MOL/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH=7.4）；甲醇溶液（分析純≥99.5%）。

1.3.2 骨骼肌樣本收集與處理 骨骼肌樣本在訓(xùn)練結(jié)束后即刻采集。先用生理鹽水洗凈血液，再用濾紙吸干，用鋁箔紙包好后裝入密封袋中，于-80℃冰箱中保存、待測。

NMR樣本處理：骨骼肌樣本經(jīng)4℃解凍，稱量0.2 g置于5 mL EP管中，加入600 mL甲醇與300 mL蒸餾水，在冰上進(jìn)行勻漿處理。勻漿后再低溫離心15 min（13 000 r/min）取上清液500 mL于2 mL EP管內(nèi)，用真空離心機(jī)將樣品吹干后加600μL混合磷酸鹽緩沖液在超聲清洗器作用下復(fù)溶，取上清液550μL于5 mm核磁管內(nèi)4℃保存、待測。

1.3.31H-NMR檢測 樣本在核磁共振儀上檢測，使用配有Bruker 5 mm BBO探頭，質(zhì)子頻率為600.13 MHz，光譜為Carr-Purcell-Meiboom-Gil（lCPMG）脈沖序列，自旋弛豫延遲320 ms，64K自由感應(yīng)衰減數(shù)據(jù)點(diǎn)在8 KHz譜寬度上共掃描64次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用MestReNova軟件（version 6.1.0-6224 Mesterlab Research，Santiago de compostella，Spain）對骨骼肌圖譜進(jìn)行處理。使用SⅠMCA-P（version 13.0 Umetric，Sweden）對積分值進(jìn)行中心化與規(guī)格化。然后再進(jìn)行PLS-DA與OPLS-DA分析，最終結(jié)合P值（P＜0.01或P＜0.05）與V IP值（VI P＞1）篩選出差異代謝物。采用SPSS（version 21.0）軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)與單因素方差分析對差異物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

2 研究結(jié)果

2.1 NMR數(shù)據(jù)多元統(tǒng)計(jì)分析

對C、E大鼠骨骼肌積分值數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA有監(jiān)督模式識別，建立回歸模型，模型驗(yàn)證是否成立將決定下一步PLS-DA與OPLS-DA的結(jié)果分析是否有意義。為保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效性，首先對建立的PLS-DA模型是否過擬合進(jìn)行驗(yàn)證，本研究采取200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)得到模型驗(yàn)證圖1a及驗(yàn)證參數(shù)：R2X=0.721，R2Y=0.991，Q2=0.961，參數(shù)越接近1表示所建模型可靠性越高。由圖1a可見R2與Q2最右側(cè)的點(diǎn)均明顯高于其他點(diǎn)，且R2趨勢不僅高于Q2并能很好分開，顯示本次模型驗(yàn)證參數(shù)的解釋及預(yù)測能力強(qiáng)，且模型驗(yàn)證成立。由圖1b可見，兩組樣本能單獨(dú)分開，說明疲勞運(yùn)動(dòng)的干預(yù)使大鼠骨骼肌代謝發(fā)生了變化。由圖1c可見，3D圖中各組所占空間獨(dú)立區(qū)域位置完全分開，說明兩組樣本數(shù)據(jù)具有顯著性差異。由圖1d可見，S-Plots圖中遠(yuǎn)離起點(diǎn)的單個(gè)變量V IP值較大，且與其他聚集物有顯著區(qū)別，說明它可能是潛在的生物標(biāo)志物。

2.2 1H-NMR檢測的差異代謝物指認(rèn)

結(jié)合國際公認(rèn)數(shù)據(jù)庫Human Metabolome Database（WWW.hmdb.ca）及相關(guān)代謝組學(xué)文獻(xiàn)，從核磁圖譜中共指認(rèn)出18種差異代謝物（見表1），差異代謝物圖譜見圖2。

圖1 大鼠骨骼肌回歸模型圖Figure1 Rat SkeletalMuscle Regression ModelDiagram

表1 E組與C組差異代謝物及變化趨勢（M±S D，n=8）Table1 Different Metabolites and Change Trends of E Group and C Group

圖2 兩組大鼠骨骼肌1H-NMR差異代謝物圖譜/ppmFigure2 1H-NMR DifferentialMetabolites Map of SkeletalMuscle of Two Groups of Rats/ppm

2.3 兩組大鼠骨骼肌差異代謝物變化

疲勞運(yùn)動(dòng)后兩組大鼠骨骼肌中共有18種差異代謝物：亮氨酸、乳酸、氧化三甲胺、次黃嘌呤、肌酸、磷酸膽堿（P＜0.01）、檸檬酸、醋酸、甘油、膽堿（P＜0.05）水平顯著升高；丙氨酸、肉毒堿、α-葡萄糖、琥珀酸（P＜0.01）、谷氨酰胺、甜菜堿、酪氨酸、半胱氨酸（P＜0.05）水平顯著降低。

2.4 兩組大鼠骨骼肌差異代謝物涉及的代謝通路

為明確與運(yùn)動(dòng)疲勞相關(guān)的代謝通路，先采用KEGG（http：//www.genome.jp）和HMDB（http：//www.hmdb.ca/）對代謝產(chǎn)物進(jìn)行分子注釋、相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)酶及參與通路個(gè)數(shù)進(jìn)行定量分析（見表2）。再采用MetaboAnalyst 4.0（http：//www.metaboanalyst.ca）對本研究兩組間差異代謝物進(jìn)行MetPA分析。將18種差異代謝物數(shù)據(jù)導(dǎo)入Pathway Analysis進(jìn)行分析得到圖3，兩組間18種差異代謝物共涉及30條代謝通路（見表3）。圖3中橫坐標(biāo)pathway impact表示由拓?fù)浞治龅玫降拇x通路的重要性值，縱坐標(biāo)-logP表示代謝通路富集分析的顯著性水平。Pathway impact與-logP值越大，則不同組間代謝差異的相關(guān)性越高，圓圈就越大。結(jié)合Pathway impact值與P值，篩選出4條P＜0.05且impact最高的代謝通路作為本研究潛在的靶標(biāo)代謝通路。結(jié)果顯示的4條與運(yùn)動(dòng)疲勞明顯相關(guān)的代謝通路（見圖4）分別為：（1）丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝；（2）TCA循環(huán)；（3）丙酮酸代謝；（4）苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代謝。

圖3 MetPA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的相關(guān)代謝通路Figure3 Related Metabolic Pathways Constructed by MetPA Database

2.5 疲勞運(yùn)動(dòng)對大鼠骨骼肌生物標(biāo)志物的影響

本研究采用受試者工作特征曲線（ROC）對疲勞運(yùn)動(dòng)差異代謝物進(jìn)行診斷能力評估。ROC曲線下的面積值（AUC）可表示標(biāo)志物的診斷效果。AUC越接近于1，說明診斷效果越好；在0.9以上時(shí)有較高準(zhǔn)確性，在0.7～0.9時(shí)有一定準(zhǔn)確性，AUC在0.5～0.7時(shí)有較低準(zhǔn)確性，AUC≤0.5時(shí)無診斷價(jià)值。本研究結(jié)合AUC與P（P＜0.05）值共篩選出17種差異代謝物，分別是：亮氨酸，乳酸，丙氨酸，谷氨酰胺，檸檬酸，肉毒堿，氧化三甲胺，α-葡萄糖，甘油，次黃嘌呤，肌酸，磷酸膽堿，酪氨酸，膽堿，琥珀酸，醋酸，半胱氨酸；其中參與以上4條疲勞代謝途徑的代謝物有丙氨酸（AUC=1.0）、谷氨酰胺（AUC=0.86）、琥珀酸（AUC=1.0）、檸檬酸（AUC=0.83）、乳酸（AUC=1.0）、醋酸（AUC=0.94）、酪氨酸（AUC=0.89）。本研究將這7種代謝物視為影響疲勞代謝的潛在標(biāo)志物。

3 討論

代謝組學(xué)是近年來生物學(xué)領(lǐng)域重要的研究方法之一，從總體代謝物輪廓上進(jìn)行代謝機(jī)制研究，是將分子生物學(xué)技術(shù)與計(jì)算機(jī)信息技術(shù)相結(jié)合的一種重要研究方法。本研究采用代謝組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)疲勞運(yùn)動(dòng)可引起大鼠骨骼肌代謝發(fā)生差異性改變，差異代謝物共有18種，涉及30條代謝通路，通過代謝途徑Met-PA分析，疲勞運(yùn)動(dòng)引起大鼠骨骼肌代謝改變與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、TCA循環(huán)、丙酮酸代謝以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代謝4條靶標(biāo)代謝通路代謝紊亂有關(guān)。

表2 疲勞運(yùn)動(dòng)代謝組學(xué)差異代謝物基本注釋表Table2 Basic Annotation Table of Metabolic Differences in Metabolomics of Fatigue Exercise Group

表3 通過Met PA得到的疲勞代謝差異物通路分析結(jié)果Table3 Pathway Analysis Results of Fatigue Metabolic Difference Obtained by MetPA

圖4 與運(yùn)動(dòng)疲勞明顯相關(guān)的代謝通路Figure 4 Metabolic Pathways Obviously Related to Exercise Fatigue

本研究中差異代謝物丙氨酸（c00041）、谷氨酰胺（c00064）及琥珀酸（c00042）參與了丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路（圖4a）。在骨骼肌中，丙氨酸（Alanine，Ala）和葡萄糖可通過“丙氨酸-葡萄糖循環(huán)”不斷在肝臟和肌肉之間轉(zhuǎn)換，將骨骼肌釋放的Ala用作肝臟中糖異生的底物[14]。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中補(bǔ)充Ala有利于減輕神經(jīng)肌肉疲勞、延長力竭時(shí)間、改善運(yùn)動(dòng)能力[15]。有研究表明遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)至30分鐘Ala水平顯即顯著降低[16]，與本研究結(jié)果相似。本研究中疲勞運(yùn)動(dòng)后Ala水平顯著降低（P＜0.01），表明疲勞運(yùn)動(dòng)可能引起大鼠骨骼肌中Ala作為糖異生底物被消耗進(jìn)而影響丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑變化。谷氨酰胺（Glutamine，Gln）是體內(nèi)含量最豐富的氨基酸，在代謝途徑中可與上游谷氨酸相互轉(zhuǎn)換，是體內(nèi)氨代謝的途徑之一。同時(shí)，Gln還參與機(jī)體供能、調(diào)節(jié)血氨和乳酸水平、合成谷胱甘肽（GSH）、提高機(jī)體抗氧化能力和免疫力[17]。K.D.SⅠNGLETON[18]研究表明在進(jìn)行抗阻訓(xùn)練及耐力運(yùn)動(dòng)時(shí)，大鼠血漿和組織尤其是骨骼肌中Gln濃度急劇下降。若得不到及時(shí)補(bǔ)充肌肉就會(huì)發(fā)生分解，以滿足機(jī)體對谷氨酰胺的需求，從而影響肌肉體積，也會(huì)由于免疫系統(tǒng)的谷氨酰胺主要來源于骨骼肌的釋放導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降[19]。W.XⅠAO[20]的研究表明過度訓(xùn)練可引起大鼠巨噬細(xì)胞功能受損，預(yù)先補(bǔ)充谷氨酰胺可以部分逆轉(zhuǎn)這一損傷，進(jìn)而提高機(jī)體免疫力。本研究中大鼠疲勞運(yùn)動(dòng)后骨骼肌Gln水平顯著降低（P＜0.05），這可能是疲勞運(yùn)動(dòng)引起機(jī)體免疫力降低的原因之一。

三羧酸循環(huán)（TCA）是人體有氧供能的基本代謝途徑，是三大能源物質(zhì)糖、脂肪和氨基酸分解代謝的交叉點(diǎn)，TCA循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物也是許多生物合成途徑的起始物質(zhì)。本研究中琥珀酸（c00042）、檸檬酸（Citric acid，CA）（c00158）參與了此代謝途徑（見圖4b）。CA通過TCA循環(huán)轉(zhuǎn)換為α-酮戊二酸，CA積累的最初階段并沒有阻斷TCA循環(huán)。延胡索酸與異檸檬酸的減少及草酰乙酸、丙酮酸、CA增加均在CA積累的誘導(dǎo)期間，α-酮戊二酸脫氫酶的減少，可導(dǎo)致琥珀酸、延胡索酸水平降低[21]。CA作為乙酰-CoA進(jìn)入TCA循環(huán)的起始物質(zhì)，其濃度大小反映著TCA循環(huán)代謝水平的高低。S.JOSEPH[22]研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)大鼠在運(yùn)動(dòng)5h后骨骼肌中CA濃度持續(xù)累積，與本研究中疲勞大鼠骨骼肌CA水平變化一致。TCA是機(jī)體能量代謝的綜合反映[23]，這些中間代謝產(chǎn)物的變化可引起TCA代謝功能紊亂，本研究中運(yùn)動(dòng)組CA水平升高（P＜0.05）、琥珀酸水平下降（P＜0.01）可能導(dǎo)致TCA代謝紊亂從而導(dǎo)致機(jī)體疲勞。在代謝物途徑分析中琥珀酸不僅與TCA循環(huán)相關(guān)也與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝有關(guān)。

本研究中差異代謝物乳酸（c00186）、醋酸（c00033）涉及的代謝途徑為丙酮酸代謝（圖4c）。代謝途徑上游L-乳酸（c00186）、D-乳酸（c00256）以及L-蘋果酸（c00149）共同作用生成丙酮酸（c00022）；次代謝途徑中醋酸由上游物質(zhì)乙酰輔酶A（c00024）、乙酰磷酸（c00227）及乙醛（c00084）代謝生成。在氧氣充足時(shí)，骨骼肌、心肌等組織可在乳酸脫氫酶作用下將乳酸直接轉(zhuǎn)化成丙酮酸參與細(xì)胞及機(jī)體供能。而在缺氧狀態(tài)下，糖酵解作用增強(qiáng)，丙酮酸在乳酸脫氫酶作用下又轉(zhuǎn)化成乳酸。乳酸在體內(nèi)堆積會(huì)使機(jī)體pH下降，從而降低神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用、阻礙ATP合成，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)興奮性減弱、肌肉工作能力下降，運(yùn)動(dòng)疲勞發(fā)生[21]。遞增負(fù)荷至力竭運(yùn)動(dòng)后體內(nèi)乳酸明顯增多[24]。本研究中疲勞運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌中乳酸與醋酸顯著升高（P＜0.01），表明疲勞運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌乳酸等酸性物質(zhì)生成速率高于消除率，丙酮酸代謝出現(xiàn)異常。

酪氨酸（Tyrosine，Tyr）是兒茶酚胺（CA）神經(jīng)遞質(zhì)類物質(zhì)，也是合成多巴胺（DA）和去甲腎上腺素（NE）的前體。本研究中酪氨酸（c00082）涉及的代謝途徑為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代謝（圖4d）。當(dāng)CA神經(jīng)元頻繁釋放遞質(zhì)時(shí)會(huì)消耗其儲存的遞質(zhì)儲備[25]。外源性補(bǔ)充Tyr可防止神經(jīng)中樞對CA的消耗，且在急性應(yīng)激條件下Tyr補(bǔ)充可顯著改善機(jī)體的生理狀態(tài)及運(yùn)動(dòng)能力[26]。此外，有研究表明大腦5-羥色胺（5-HT）和DA都是與疲勞有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)，即體內(nèi)較高水平5-HT使運(yùn)動(dòng)能力降低、較高水平DA則有利于運(yùn)動(dòng)能力的提高[27]。蘭曉霞[28]研究顯示骨疲勞時(shí)實(shí)驗(yàn)組DA水平顯著低于對照組。CHAOULOFF[29]研究表明腦內(nèi)DA增加可抑制5-HT合成，而當(dāng)大腦5-HT/DA比率增大時(shí)將引發(fā)運(yùn)動(dòng)疲勞。腦內(nèi)多巴胺具有興奮神經(jīng)中樞、控制運(yùn)動(dòng)肢體協(xié)調(diào)性及增加運(yùn)動(dòng)時(shí)間的作用且運(yùn)動(dòng)中體內(nèi)Tyr的變化與DA變化一致[30]。本研究中，疲勞運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌內(nèi)Tyr水平明顯降低（P＜0.05），表明疲勞運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致合成DA的前體物質(zhì)減少從而導(dǎo)致疲勞的發(fā)生。

代謝物也可以作為底物對信號通路產(chǎn)生影響，所以下一步的研究可結(jié)合相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中蛋白或基因表達(dá)等變化，從分子和代謝兩個(gè)水平探究疲勞運(yùn)動(dòng)對特征代謝物和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的整體調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié)論

本研究采用代謝組學(xué)方法與代謝途徑分析與對照組相比共篩選出18種差異性代謝物和4條代謝途徑。疲勞運(yùn)動(dòng)使代謝產(chǎn)物發(fā)生差異性變化與運(yùn)動(dòng)引起的大鼠骨骼肌丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、TCA循環(huán)、丙酮酸代謝以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代謝途徑的變化有關(guān)。