游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)細(xì)胞自噬軸誘導(dǎo)生理性心肌肥大形成的影響

齊 潔，張 波，蔣 麗，張 鈞

生理性心肌肥大是心肌在細(xì)胞、分子層面因受到機(jī)械刺激后發(fā)生一系列的變化后形成的，表型主要有心臟體積、形態(tài)與功能等的改變[1]。有學(xué)者[2-4]研究已證實(shí)長期規(guī)律適宜強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)所誘導(dǎo)的心臟肥大對(duì)健康人群及心臟疾病患者均具有積極作用，正常健康人群的心臟病患病風(fēng)險(xiǎn)降低，心臟病病人的心功能可得到有效改善。常蕓等[5]的研究也早已證實(shí)神經(jīng)-內(nèi)分泌激素在運(yùn)動(dòng)性心臟肥大（exercise-induced cardiachypertrophy，ECH）過程中扮演重要角色。近年來許多學(xué)者[6-7]將研究熱點(diǎn)關(guān)注于自噬在心肌肥厚/心肌重構(gòu)中的重要作用。此外，馬曉雯等[8]通過實(shí)驗(yàn)證明了在耐力性運(yùn)動(dòng)后心肌自噬的活性增加，但是，在ECH模型中心肌自噬水平與生理性心肌肥大產(chǎn)生的規(guī)律及相關(guān)機(jī)制，仍尚未被完全闡明。

目前，越來越多的研究者開始關(guān)注運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)于心肌細(xì)胞自噬的影響。但鮮有報(bào)道系統(tǒng)闡述關(guān)于耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)心肌細(xì)胞自噬及自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響。相關(guān)研究表明，自噬的發(fā)生是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程。這一過程被理解為自噬軸。也有研究[9-11]分析自噬可能成為調(diào)控心肌肥厚的靶點(diǎn)。本研究通過建立10周游泳運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的ECH動(dòng)物模型，觀察了ECH中心肌細(xì)胞形態(tài)與心肌細(xì)胞自噬現(xiàn)象的變化，通過實(shí)驗(yàn)研究自噬軸中的自噬相關(guān)基因LC3B、Beclin1、Atg4B、Atg5、Atg7、Atg12、ULK1、SQSTM1的表達(dá)變化，探討了長期耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞自噬的影響。而自噬需要精準(zhǔn)調(diào)控，已有研究[12-13]報(bào)道微小RNA（microRNA，miRNA）在不同組織細(xì)胞自噬通路調(diào)控中扮演著重要角色。本研究我們通過生物信息學(xué)預(yù)測了在運(yùn)動(dòng)性心肌肥大中與自噬相關(guān)基因具有靶向調(diào)控作用的miRNAs，并驗(yàn)證了相關(guān)miRNAs的表達(dá)水平，初步確定了長期游泳運(yùn)動(dòng)在改變心肌miRNAs表達(dá)水平后，通過miRNAs調(diào)控自噬而誘導(dǎo)了運(yùn)動(dòng)性心肌肥大。為ECH的形成機(jī)制提供了依據(jù)，也為建立健全運(yùn)動(dòng)員心臟的保護(hù)機(jī)制和心血管疾病人群運(yùn)動(dòng)處方的制定提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

主要試劑：ECL發(fā)光液購于美國Thermo公司，TRⅠzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-qPCR擴(kuò)增試劑盒均購自TAKARA公司，兔抗單克隆抗體LC3B、Beclin1、Atg4B、Atg5、Atg7、Atg12、ULK1和SQSTM1等購自美國Cell Signaling Technology（CST）公司，二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔和FⅠTC標(biāo)記的山羊抗兔抗體）也均購自CST公司，PVDF膜購自美國Ⅰnvitrogen公司，DAPⅠ染色劑購自北京索萊寶生物公司，mRNA引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成，miRNAs引物由華大基因生物公司設(shè)計(jì)與合成。

主要儀器：BM-Ⅱ型病理組織包埋機(jī)、德國Leica切片機(jī)、DHG9000烘烤箱、德國Leica熒光顯微鏡、美國Bio-Rad電泳儀與轉(zhuǎn)膜槽、Tanon Multi凝膠成像系統(tǒng)、日本OlymPus光學(xué)顯微鏡、日本HⅠTACHⅠ透射電子顯微鏡、德國Eppendorf低溫高速離心機(jī)、天根高速組織勻漿機(jī)、美國ABⅠ7500 qPCR儀、One Drop*OD-1000超微量紫外分光光度計(jì)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及運(yùn)動(dòng)性心肌肥大動(dòng)物建模

健康6周齡雌性Sprague-Dawley大鼠40只，體重（150±20）g（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）。大鼠常規(guī)分籠飼養(yǎng)（4只/籠），輻照鼠用滅菌飼料（南通特洛菲實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料有限公司）飼養(yǎng)。室溫22～24℃，空氣濕度40%～70%，光照時(shí)間為12 h/天。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成對(duì)照組（control group，CON組）和運(yùn)動(dòng)性心肌肥大模型組（exercise group，EX組），每組20只。分組后再適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)1周至雌性大鼠性成熟期（一般為8周齡），此時(shí)大鼠情緒較為穩(wěn)定，之后開始正式建模運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。

依據(jù)T.G.BEDFORD動(dòng)物運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練負(fù)荷標(biāo)準(zhǔn)[14]，通過參照T.FERNANDES等[15-16]的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案，建立ECH動(dòng)物模型。EX組大鼠進(jìn)行10周無負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)，游泳運(yùn)動(dòng)方案詳見下表（見表1）。大鼠游泳運(yùn)動(dòng)在150 cm×60 cm×70 cm規(guī)格的游泳缸內(nèi)進(jìn)行，水溫控制在（31±1）℃。

表1 大鼠10周游泳運(yùn)動(dòng)方案Table1 A 10-Week Swimming Protocol

1.3 動(dòng)物取材與樣本制備

用10%水合氯醛（40 mg/100 g體重）對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉。迅速打開胸腔，摘取心臟，生理鹽水漂洗后、濾干，并稱量全心重量。分離左心室后，并稱量、記錄左心室重量。取心尖處1 mm×1 mm×1 mm大小心肌組織放入2%戊二醛固定液，用于透射電鏡檢測。切取左心室壁，經(jīng)多聚甲醛固定后，組織經(jīng)石蠟包埋、切片后，待用。剩余組織-80℃保存，用于心肌組織RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.4 心肌組織染色

心肌LC3B免疫熒光：常規(guī)石蠟切片制片，用檸檬酸鈉進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS洗滌3次，3 min/次。5%封閉液37℃孵育120 min后，每個(gè)待測樣品滴加LC3B（1：1 000，CST）40 uL，4℃過夜。次日復(fù)溫后PBST洗滌3次，10 min/次。熒光二抗Alexa55（51：800）于37℃避光孵育120 min，PBS避光洗滌3次，5 min/次。加入DAPⅠ（1：1 000，北京索萊寶）充分混勻、孵育。PBS洗滌后用抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡鏡下關(guān)觀察（綠色熒光為陽性顆粒）。

心肌蘇木素-伊紅（HE）染色：所取心肌組織在酒精梯度脫水和常規(guī)梯度酒精脫水后，依次進(jìn)行二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，切片（5μm厚），HE染色，在中性樹膠封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察，并進(jìn)行圖像采集。

1.5 透射電鏡觀察大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)

取大鼠左心室心尖部約1 mm×1 mm×1 mm大小組織塊，于4℃戊二醛磷酸緩沖液固定液中，固定24 h。常規(guī)脫水、浸透、包埋、染色后制成50 nm左右的超薄切片，透射電鏡下觀察心肌組織自噬小體及心肌超微結(jié)構(gòu)。

1.6 大鼠心功能檢測

游泳運(yùn)動(dòng)結(jié)束后24 h，大鼠吸入異氟醚麻醉。待大鼠穩(wěn)定后將其固定，取仰臥位，左心區(qū)脫毛。通過使用高分辨率動(dòng)物超聲系統(tǒng)（Visual Sonics Vevo770）對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測，采集兩維超聲圖像，進(jìn)行心臟M型超聲檢測，心臟功能分析檢測等。記錄：二尖瓣口血流E峰與A峰比值（MV E/A）、室間隔厚度-舒張期（ⅠVS-d）、室間隔厚度-收縮期（ⅠVS-s）、左室舒張末內(nèi)徑（LVⅠD-d）、左室收縮末內(nèi)徑（LVⅠD-s）、左室后壁厚度-舒張期（LVPW-d）、左室后壁厚度-收縮期（LVPW-s）、左室質(zhì)量（LV mass）、全心指數(shù)（HMⅠ）、左室指數(shù)（LVMⅠ）、射血分?jǐn)?shù)（EF）、左室縮短分?jǐn)?shù)（FS）、左室容量-舒張期（LV Vol-d）、左室容量-收縮期（LV Vol-s）等指標(biāo)后，綜合評(píng)定大鼠心功能。

1.7 Western blot

采用RⅠPA強(qiáng)裂解液提取大鼠心肌組織總蛋白，使用BCA法對(duì)心肌組織進(jìn)行蛋白定量。在10%或12%SDS-PAGE電泳分離后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，而后在TBST洗膜后依次加入1：1 000兔抗大鼠LC3B、Beclin1、Atg4B、Atg5、Atg7、Atg12、ULK1和SQSTM1一抗，室溫孵育60 min后置于4℃過夜。次日加入HRP標(biāo)記的羊抗兔ⅠgG二抗抗體（1：5 000）孵育90 min，再次用TBST洗膜后，進(jìn)行ECL發(fā)光。GAPDH設(shè)定為內(nèi)參。

1.8 RT-qPCR

用TRⅠzol試劑提取心肌總RNA，測定總RNA的濃度與純度。嚴(yán)格按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作步驟合成cDNA，RT-qPCR法測定心肌ANP、α-actin、α-MHC、β-MHC、SERCA-2α及自噬相關(guān)基因LC3和Beclin1的mRNA表達(dá)量，內(nèi)參為GAPDH。RT-qPCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：95℃10 min，1個(gè)循環(huán)；95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃10 min。利用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量。引物由上海生工生物技術(shù)公司合成，各基因上下游引物序列見表2。

用TRⅠzol試劑提取心肌總RNA，按microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）說明書進(jìn)行加尾反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以此cDNA為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。引物由華大基因生物工程有限公司合成，U6為內(nèi)參。反應(yīng)條件如下：95℃30 s，1個(gè)循環(huán)；95℃5 s，60℃20 s，39個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)檢測3次。利用2-△△Ct法計(jì)算mi RNAs的相對(duì)表達(dá)量。

表2 基因上下游引物序列Table2 Gene Forward and Reverse Primer Sequences

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。顯著性差異選擇P＜0.05和P＜0.01水平。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)性心肌肥大動(dòng)物模型評(píng)價(jià)

10周游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，從HE染色結(jié)果可觀察到，CON組大鼠心肌排列整齊、緊密，EX組大鼠心肌纖維明顯變粗，排列規(guī)律但有間隙，心肌細(xì)胞直徑顯著增加（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠心肌HE染色圖（×400）Figure1 HE Staining of Left Ventricle in Rats

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞直徑比較Figure2 Cooperate with the Myocyte Diameter in Rats in Various Groups

本研究通過心動(dòng)超聲綜合評(píng)定了運(yùn)動(dòng)組大鼠的心功能，表3結(jié)果顯示，與CON組大鼠比較，EX組大鼠MV E/A比值、LVⅠD-d/s、LVPW-d、HMⅠ和LVⅠM均極顯著性提高（P＜0.01），LV mass、LV Vol-d、EF和FS均顯著上升（P＜0.05），提示10周運(yùn)動(dòng)后，運(yùn)動(dòng)組大鼠心功能顯著增強(qiáng)。

表3 大鼠超聲心動(dòng)指標(biāo)比較Table3 Comparison of Echocardiography Indicators of Rats

為了排除病理性心臟形成，本研究檢測了心肌病理標(biāo)志物的表達(dá)水平。如圖3結(jié)果所示，10周游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，CON組與EX組大鼠心肌ANP、α-actin、SERCA-2αmRNA的表達(dá)量以及α-MHC/β-MHC比值均無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 心肌病理性標(biāo)志物的mRNA表達(dá)量Figure3 mRNA Expression of PathologicalMarker in Rats'Left Ventricle

2.2 運(yùn)動(dòng)性心肌肥大大鼠心肌自噬變化

透射電鏡結(jié)果顯示，EX組大鼠心肌組織出現(xiàn)典型的雙層膜結(jié)構(gòu)，而CON組大鼠心肌排列規(guī)律整齊，未觀察到有典型的雙層結(jié)構(gòu)出現(xiàn)（見圖4）。心肌LC3B免疫熒光結(jié)果表明，LC3B陽性顆粒呈綠色熒光，DAPⅠ為細(xì)胞核標(biāo)記物，呈藍(lán)色熒光（見圖5）。與CON組比較，EX組心肌細(xì)胞LC3B陽性顆粒數(shù)量顯著增加（P＜0.01）。RT-qPCR結(jié)果所示（見圖6、圖7），10周游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練促進(jìn)了大鼠左心室LC3ⅡmRNA的表達(dá)水平，且與CON組相比EX組大鼠心肌LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高（P＜0.01）。同時(shí)，10周游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練也顯著提高了大鼠左心室Beclin1 mRNA的表達(dá)量（P＜0.01）。由Western blot結(jié)果可知，10周游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，與CON組相比，EX組大鼠左心室LC3、Beclin1、Atg4B、Atg5、Atg7、Atg12、ULK1蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)（P＜0.01或P＜0.05），左心室SQSTM1蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.01）。表明ECH大鼠心肌自噬水平增強(qiáng)。

圖4 各組大鼠心肌透射電鏡圖（×15 000）Figure4 Transmission electron microscope of Left Ventricle in Rats to Observe Autophagosome

圖5 大鼠心肌LC3B免疫熒光Figure5 LC3B Immunofluorescence in Rats

圖6 各組大鼠左心室LC3和Beclin1 mRNA表達(dá)水平比較Figure6 mRNA Expression of LC3 and Beclin1 of Rat Left Ventricle in Various Groups

2.3 運(yùn)動(dòng)性心肌肥大大鼠左心室miRNAs表達(dá)量變化

圖8顯示了ECH動(dòng)物模型中具有差異表達(dá)的miRNAs，通過生物信息學(xué)在線預(yù)測軟件Targetscan（http：//www.targetscan.org）和miRDB（http：//mirdb.org/）預(yù)測，我們靶定了與自噬相關(guān)的miRNAs。結(jié)果表明10周游泳訓(xùn)練后，與CON組相比，EX組大鼠左心 室miR-26b-5p（靶 向ULK1）、miR-204-5p（靶 向LC3B）、miR-497-3p（靶 向Atg7）和let-7a-5p（靶 向Atg4B）表達(dá)水平均顯著下調(diào)（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），而預(yù)測靶向作用于自噬受損蛋白SQSTM1的miR-181a-5p表達(dá)量發(fā)生顯著上調(diào)（P＜0.01）。

圖7 各組大鼠左心室自噬相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平的變化Figure7 Protein Expression Changes of Autophagy-related Genes of Rat Left Ventricle in Various Groups

圖8 各組大鼠左心室miRNAs表達(dá)水平的變化Figure8 miRNAs Expression Changes of Rat Left Ventricle in Various Groups

3 分析與討論

通過對(duì)運(yùn)動(dòng)組大鼠左心室壁進(jìn)行HE染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10周游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，運(yùn)動(dòng)組大鼠心肌細(xì)胞排列較整齊，大小、分布均勻，心肌細(xì)胞核有所增大，肌纖維雖出現(xiàn)少許斷裂，但總體結(jié)構(gòu)仍很規(guī)律、正常。本研究在設(shè)定運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度時(shí)參照了前人[14]研制的動(dòng)物運(yùn)動(dòng)負(fù)荷標(biāo)準(zhǔn)，因此大鼠進(jìn)行60 min游泳運(yùn)動(dòng)屬于中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)。有學(xué)者[15]通過對(duì)比與評(píng)價(jià)2種游泳方案建立的運(yùn)動(dòng)性心肌肥大模型，發(fā)現(xiàn)本研究中所參考的運(yùn)動(dòng)方案比每天一次60 min為期10周的方案所建立的心肌肥大模型表型更明顯。且從本研究中運(yùn)動(dòng)性心肌肥大組大鼠心肌病理學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果來看，運(yùn)動(dòng)組大鼠心肌并未顯示有病理學(xué)改變，由此可見，10周中等強(qiáng)度游泳運(yùn)動(dòng)可使心肌細(xì)胞增大增粗，發(fā)生生理性改變，形成運(yùn)動(dòng)性心肌肥大。相關(guān)研究[17]認(rèn)為，在一定范圍內(nèi)心肌細(xì)胞體積增加的程度與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間等呈正相關(guān)。雖然病理性心肌肥大與生理性心肌肥大的外部表型特征相差甚微，但是病理狀態(tài)下，心肌細(xì)胞內(nèi)的收縮蛋白α-MHC呈現(xiàn)向β-MHC轉(zhuǎn)化的顯著趨勢，提示心肌細(xì)胞受損。而ECH心肌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化則是相反的[18]。本研究通過此種方案建立模型，排除了10周游泳運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的病理性心肌肥大，提示10周游泳訓(xùn)練成功建立了運(yùn)動(dòng)性心肌肥大動(dòng)物模型。

細(xì)胞自噬，是物種在進(jìn)化過程中表現(xiàn)出的高度保守的代謝機(jī)制。已有研究表明，心肌細(xì)胞的自噬水平上調(diào)可以由適宜強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練來實(shí)現(xiàn)，不僅可以維持心肌細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，還可以減少心肌細(xì)胞凋亡。當(dāng)外界刺激（如低氧、機(jī)械力等）細(xì)胞或細(xì)胞處于饑餓條件下時(shí)，細(xì)胞自噬起始信號(hào)被觸發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)，ULK1是啟動(dòng)細(xì)胞自噬的重要門控開關(guān)。哺乳動(dòng)物同源物Beclin（l酵母Atg6）被磷酸化后從細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)解離、釋放，與ⅠⅠⅠ類磷酸肌醇3激酶（classⅢphosphatidylinositol-3-kinases，classⅢPⅠ3K）Vps34相結(jié)合，從而形成兩個(gè)泛素樣系統(tǒng)：即Atg12-Atg5和微管相關(guān)蛋白Ⅰ輕鏈3（microtubule-associated proteinⅠlight chain 3，LC3）-磷脂 酰 乙 醇 胺（phosphatidylethanolamine，PE）；通 過classⅠⅠⅠPⅠ3K的催化，Atg7與Atg10分別發(fā)揮El、E2泛素酶作用，而后促進(jìn)Atg12與Atg5共價(jià)結(jié)合，并在招募Atgl6后形成三聚體，結(jié)合到自噬前體上，參與自噬小體的擴(kuò)張；LC3的羧基端被Atg4切割，產(chǎn)生LC3-Ⅰ，在Atg3、Atg7及Atgl6復(fù)合體發(fā)揮E3泛素連接酶的作用下，LC3-Ⅰ與PE以酰胺鍵形式，結(jié)合形成LC3-PE/LC3-Ⅱ[19-21]，繼而與自噬小體膜緊密聯(lián)合，促進(jìn)形成自噬小體。已有研究[21]表明，LC3-Ⅱ是細(xì)胞自噬泡膜的標(biāo)記物，LC3-Ⅱ的表達(dá)水平可直接反映某一時(shí)刻自噬激活的程度。由此可見，自噬啟動(dòng)后，其整個(gè)過程有Beclin1、Atg4B、Atg5、Atg7、Atg12等這些關(guān)鍵蛋白的參與。

有學(xué)者[22]在Atg5-/-小鼠心肌及沉默Atg7-/-基因后發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞自噬水平均顯著降低，心肌產(chǎn)生肥大表型。由此可見，自噬異常導(dǎo)致心肌蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的異常聚積，可能是導(dǎo)致心肌肥大的重要機(jī)制。而運(yùn)動(dòng)作為一種機(jī)械性刺，可通過影響心肌細(xì)胞的自噬活性而平衡運(yùn)動(dòng)中或運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期心肌細(xì)胞的代謝。還有研究[23]發(fā)現(xiàn)，耐力運(yùn)動(dòng)可能會(huì)通過阻止小鼠心肌Beclin1-BCl2復(fù)合物解離，從而使自噬活性極度減弱。此外，有研究通過5周運(yùn)動(dòng)干預(yù)發(fā)現(xiàn)CHⅠP-/-小鼠由于自噬的代償性激活（表現(xiàn)為Atg5、Atg7表達(dá)水平顯著增加，LC3-ⅠⅠ顯著上調(diào)，自噬活性大幅度提高），使心肌蛋白質(zhì)質(zhì)量提高，最終參與抑制了小鼠心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。提示在ECH中心肌細(xì)胞自噬扮演著重要角色，其不僅可以控制正常水平的心肌蛋白質(zhì)質(zhì)量，還能夠保持心肌細(xì)胞正常的結(jié)構(gòu)與生理功能。自噬，能夠通過ALP途徑清除運(yùn)動(dòng)刺激下心肌產(chǎn)生與代謝后異常的蛋白質(zhì)、自由基等產(chǎn)物[24]，將其轉(zhuǎn)換成能源物質(zhì)（如ATP、氨基酸、游離脂肪酸、核苷酸等），平衡與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞能量代謝，保證心肌蛋白質(zhì)質(zhì)量；另一方面，還能夠逆轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)合成與降解的失衡，而抑制心肌過度肥大[25-26]。已有研究[27]認(rèn)為，心肌細(xì)胞分化與再生能力有限，自噬可以作為其促進(jìn)物質(zhì)循環(huán)及細(xì)胞自我更新的途徑之一。因此，心肌細(xì)胞自噬不僅可以維持心臟功能還可以維持心肌細(xì)胞活力[28-29]。

Beclin1是最早自定位在自噬前體結(jié)構(gòu)中的自噬相關(guān)基因，可調(diào)控自噬水平。同時(shí)，目前大多數(shù)自噬研究所采用的檢測是LC3，尤其是LC3Ⅱ表達(dá)水平。LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化成LC3Ⅱ后，其定位在自噬體膜上，是公認(rèn)的自噬發(fā)生的標(biāo)志，所以LC3Ⅱ表達(dá)水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值與自噬水平呈正相關(guān)。P62又稱為SQSTM1，在降解胞漿中錯(cuò)誤重疊的蛋白時(shí)，p62是自噬過程中底物識(shí)別的重要配體蛋白。有研究表明，SQSTM1作為自噬過程中的選擇性接頭蛋白，也在自噬中發(fā)揮了重要作用。SQSTM1在泛素化后可促進(jìn)自噬活性下降。在正常的自噬過程中，細(xì)胞質(zhì)中SQSTM1蛋白可不斷被降解。當(dāng)自噬活性減弱或在自噬功能缺陷時(shí)，SQSTM1蛋白會(huì)在細(xì)胞質(zhì)中不斷堆積，因此，SQSTM1/p62被認(rèn)為是自噬活性受損的標(biāo)記蛋白之一。本研究的結(jié)果也證明了：10周中等強(qiáng)度游泳訓(xùn)練使大鼠左心室自噬標(biāo)記基因Beclin1和LC3Ⅱ表達(dá)水平顯著上調(diào)。ECH模型大鼠左心室自噬相關(guān)蛋白ULK1、Atg4B、Atg5、Atg7和Atg12表達(dá)水平均顯著上調(diào)，左心室SQSTM1表達(dá)水平顯著下調(diào)。

微小RNA（microRNA，miRNA）的發(fā)現(xiàn)在近來的研究中為闡明和研究ECH的發(fā)生機(jī)制提供了新的視角。一些研究通過功能獲得和缺失的方法進(jìn)一步確認(rèn)了miRNA的調(diào)控路徑，在ECH和病理性心肌肥大心臟模型中，某些miRNA表現(xiàn)出不同的變化趨勢，這也為闡釋兩種不同的心臟肥大調(diào)節(jié)機(jī)制提供了新的證據(jù)。miRNA已成為心血管疾病治療潛在的靶點(diǎn)，應(yīng)用前景廣泛。前期，我們已通過建立ECH動(dòng)物模型，利用microarray生物芯片分析了運(yùn)動(dòng)組大鼠心肌具有表達(dá)差異的miRNAs[30]。

自噬過程需要非常精準(zhǔn)的調(diào)控。已有研究[20-21，31-32]表明，miRNA在不同組織細(xì)胞自噬通路調(diào)控中具有重要作用。我們通過Targetscan和miRDB在線生物信息學(xué)軟件預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)：ULK1、SQSTM1、Atg4B、LC3 B、Atg7的3’UTR區(qū)可能分別與rno-miR-26b-5p、rno-miR-181a-5p、rno-let-7a-5p、rno-miR-204-5p、rno-miR-497-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，這些miRNA可能通過作用于其預(yù)測靶基因，從而實(shí)現(xiàn)miRNA通過自噬調(diào)控運(yùn)動(dòng)性心肌肥大的功能。本研究結(jié)果表明，10周游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，ECH大鼠左心室miR-26b-5p表達(dá)量顯著下調(diào)，其預(yù)測靶基因ULK1蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)；miR-181a-5p表達(dá)量顯著增加，其預(yù)測靶基因SQSTM1表達(dá)水平顯著下降；miR-204-5p、miR-497-3p、let-7a-5p表達(dá)量均顯著減少，其預(yù)測靶基因LC3B、Atg7、Atg4B表達(dá)水平均顯著提高。該結(jié)果與前人在心肌組織的相關(guān)研究結(jié)果一致[33-34]。提示10周游泳運(yùn)動(dòng)可通過調(diào)控miRNAs的變化影響自噬而誘導(dǎo)生理性心肌肥大發(fā)生。

4 結(jié)論

10周耐力游泳運(yùn)動(dòng)可誘導(dǎo)生理性心肌肥大形成。運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的生理性心肌肥大使心肌細(xì)胞自噬水平顯著提高，心肌自噬軸發(fā)生顯著變化可能是通過miRNAs靶向作用于自噬軸相關(guān)基因，實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌細(xì)胞自噬水平的調(diào)控，從而促進(jìn)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的生理性心肌肥大形成。