維吾爾藥材菠菜子的ＤＮＡ條形碼鑒定及質(zhì)量控制研究

沙拉麥提·艾力 汪波 陳亞飛

【摘 要】 目的：基于DNA條形碼分子鑒定法建立維吾爾藥材菠菜子的鑒定方法，并構(gòu)建菠菜子HPLC指紋圖譜和其指標性成分β-蛻皮甾酮的HPLC含量測定方法，為菠菜子的質(zhì)量控制提供參考。方法：以核糖體DNA第二內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS2）為主體條形碼序列對菠菜子進行DNA條形碼鑒定;采用Agilent ZORBAX SB-Aq C18 色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），以甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B）為流動相梯度洗脫（0～10min，10% A;10～20min，10%→30% A;20～40min，30%→40% A;40～65min，40%→80% A），檢測波長240nm，建立菠菜子的HPLC指紋圖譜方法;采用Agilent ZORBAX SB-Aq C18 色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），以甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B）為流動相梯度洗脫（0～15min，45%→40%A;15～25min，40%→80%A;25～30min，80%→45%A;30～45min，45%A），檢測波長248 nm，建立指標性成分β-蛻皮甾酮的HPLC含量測定方法。結(jié)果：DNA條形碼鑒定系統(tǒng)進化樹顯示，ITS2序列可將菠菜子與其近緣物種很好區(qū)分，且分支支持率達100%;HPLC指紋圖譜標定7個共有峰，10批菠菜子藥材與對照圖譜的相似度均大于0.95;指標性成分β-蛻皮甾酮在6.115～122.304μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好（r=0.9997），重復性試驗 RSD<2.0%，加樣回收率為 97.43%～103.59%，10批樣品中β-蛻皮甾酮的含量為 0.099%～0.241%。結(jié)論：DNA條形碼可準確鑒定菠菜子的基原，HPLC指紋圖譜專屬性強，結(jié)合指標性成分β-蛻皮甾酮的含量測定可以控制菠菜子藥材的質(zhì)量。

【關鍵詞】 菠菜子;DNA條形碼;β-蛻皮甾酮;含量測定：指紋圖譜

Abstract：Objective Using DNA barcodes to identify Uygur medicine fruits of Spinacia oleracea L， establishing its HPLC fingerprint and measuring its content of β-ecdysterone， which provides a reference for the quality control of the Uygur medicine. Methods The second inside transcription silent region （ITS2） of S. oleracea as the main barcodes sequence was amplified with polymerase chain reaction （PCR）. Agilent ZORBAX SB-Aq C18 chromatographic column （4.6mm× 250mm， 5μm） was used and the mobile phase consisted of methanol （A）-0.2% phosphoric acid solution （B） with gradient elution （0～10min，10% A; 10～20min， 10%→30% A; 20～40min，30%→40% A; 40～65min， 40%→80% A）at a flow rate of 1.0mL/min.The column temperature was 30℃ and the injection volume was 10μL， the detection wavelength was set at 240 nm. Besides， the analytical method of β-ecdysterone was validated usingthesimilar method besides the following gradient elution （0～15min， 45%→40% A; 15～25min， 40%→80% A; 25～30min， 80%→45% A; 30～45min， 45% A） and the wavelength of 240nm.Results The system evolutionary tree shows that ITS2 sequence can make it easy to distinguish the fruits of S. oleracea from the relate species， and the branch support rate is up to 100%. The HPLC method was developed for fingerprint and 7 common peaks were confirmed in 10 batch samples， the similarity is up to 0.95. In quality determination，the good separation and linearity （r=0.9997）was obtained for the β-ecdysterone in the range of 6.115～122.304μg/mL.The average recovery rates were 97.43%～103.59%（RSD<2.0%）.Conclusion DNA barcode can identify fruits of S. accurately， and the fingerprint combination of the content of β-ecdysterone determination can be used to control and evaluate the quality of the fruits of S. oleracea.

Keywords：Fruits of Spinacia oleracea L; DNA Barcode; β-ecdysterone;Content Determination; Fingerprint

菠菜子為藜科菠菜屬植物菠菜Spinacia oleracea L的干燥成熟果實，原產(chǎn)伊朗，在我國各地普遍栽培，其標準收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準維吾爾藥分冊》1998年版。在新疆，菠菜子作為傳統(tǒng)的維吾爾醫(yī)用藥材，有調(diào)節(jié)異常膽液質(zhì)，退熱利尿，通便止痛之功效，常用于異常膽液質(zhì)過盛，發(fā)燒不退，體弱，便秘，小便不利等病癥[1-4]。《中華本草》記載，菠菜子含小龍骨素（polypodine），β-蛻皮甾酮（20-hydroxyecdysone），α-菠菜甾醇（α-spinasterol），豆甾烯醇（stigmastenol）和豆甾烷醇（stigmastanol）等成分[5]。

菠菜子的文獻研究資料相對較少，其藥材基原鑒定和質(zhì)量控制的相關研究未見報道，目前菠菜子的鑒別主要依靠人用經(jīng)驗以及顯微鑒別等基礎鑒別手段鑒定，這些方法雖然操作簡單，但具有較大的主觀性，鑒定人員也需要有豐富的經(jīng)驗，因此，急需一個能夠整體評價菠菜子藥材質(zhì)量并對其進行有效控制的科學分析方法。隨著分子生物學的發(fā)展，DNA條形碼已成為近年來國際上生物多樣性研究的熱點，能有效彌補傳統(tǒng)鑒定方法的不足，區(qū)分親緣關系較近的物種[6]。指紋圖譜可以整體、宏觀的表征被測樣品主要化學成分的特征，經(jīng)過多年的發(fā)展和應用，目前是公認的最適合中藥及天然藥物物質(zhì)群質(zhì)量控制的手段之一[7]。為了更好的控制菠菜子藥材的質(zhì)量，本研究對收集到的10批菠菜子藥材進行了初步的DNA條形碼分子鑒定研究，并結(jié)合HPLC指紋圖譜研究和指標性成分β-蛻皮甾酮的HPLC含量測定研究，以期建立菠菜子的快速鑒定和質(zhì)量控制方法，為更好的控制維吾爾族藥材菠菜子的質(zhì)量提供參考。

1 儀器、試藥及樣品

1.1 儀器 Bio-Rad T100型PCR儀（Bio-Rad公司），DYY-6C型凝膠電泳儀（北京六一生物科技有限公司），JX-FSTPRP-24型全自動樣品快速研磨儀（天津市泰斯特儀器有限公司），Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司，DAD檢測器），Agilent ZORBAX SB-Aq C18 色譜柱（4.6mm×250mm，5μm;美國Agilent公司），SYZ F 10L型超純水制造系統(tǒng)（成都滲源科技有限公司）;CP214電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）;KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料 快捷型植物基因組提取試劑盒（DP321，天根生化科技有限公司）;鑒別引物委托由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。甲醇（美國TEDIA，批號：20171017，色譜純），磷酸（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20181019，分析純），超純水（實驗室自制）。β-蛻皮甾酮對照品（批號：wkq19011007，四川省維克奇生物科技有限公司）。

1.3 樣品 菠菜子樣品于2016～2018年在新疆全區(qū)共收集，經(jīng)中南民族大學藥學院劉新橋副教授鑒定，為藜科菠菜屬植物菠菜S. oleracea的干燥果實。

2.1 模板 DNA提取、PCR擴增反應及PCR產(chǎn)物檢測參照“中藥材DNA條形碼分子鑒定法”（《中國藥典》2015年版四部通則9107）。本研究利用新型廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA，采用NanoDrop 2000（Thermo Scientific，USA）測定OD260/OD280比值及DNA濃度。PCR擴增及測序的正向引物為5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物為5′-GACGCTTCTCCAGA CTACAAT-3′。30 μLPCR反應體系包括10×PCR緩沖液3μL，二氯化鎂（25mM） 2.4μL，dNTP（10mm）0.6μL，鑒別引物（30μmol/L）各0.5μL，高保真Taq DAN聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板1μL，無菌超純水21.8μL。將離心管置PCR儀，PCR反應參數(shù)：95℃預變性4min，循環(huán)反應30次（95℃ 30s，55～58℃ 30s，72℃ 30s），72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物純化后使用ABI3730XL測序儀雙向測序，測序峰圖利用CodonCode Aligner V3.7.1（CodonCode Co.， USA）校對拼接，將所有序列用軟件MEGA 6.05分析比對，并用鄰接（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，采用bootstrap（1000次重復）檢驗各分支支持率。

2.2 菠菜子及其近緣物種系統(tǒng)鄰接（NJ）樹鑒別 菠菜ITS2序列數(shù)據(jù)來自收集樣品和NCBI數(shù)據(jù)庫;近緣物種ITS2序列來自NCBI數(shù)據(jù)庫。菠菜子ITS2實驗序列比對后長度均為214bp，所獲得的序列中沒有變異位點。基于ITS2序列構(gòu)建藜科菠菜屬菠菜子及同科濱藜屬植物Atriplex suberecta（Genbank No.GQ465766.1， HM005862.1）、A.rosea（Genbank No.：HM005858.1）、A.hortensis（Genbank No.：HM005854.1）、A.dioica（Genbank No.：MG235264.1）、A.australasica（Genbank No.：EU331095.1）、A.praecox（Genbank No.：KX16675.1）、A.halimus（Genbank No.：KU555433.1）、A.cinerea（Genbank No.：HM005864.1）、A.rusbyi（Genbank No.：HM005865.1）、A.peruviana（Genbank No.：HM005867.1）、A.canescens（Genbank No.：FJ601827.1）、A.torreyi（Genbank No.：FJ601839.1），甜菜屬植物Beta nana（Genbank No.：KP748063.1）、B.macrocarpa（Genbank No.：KP748157.1， KP748168.1）、B.vulgaris（Genbank No.：KP748111.1），鹽節(jié)木屬植物Halocnemun strobilaceum（Genbank No.：AY489241.1， KX282176.1），鹽千屈菜屬植物Halopeplis amplexicaulis（Genbank No.：AY489237.1）、H.perfoliata（Genbank No.：MH547482.1），棉藜屬植物Kirilowia eriantha（Genbank No.：AY489209.1），霧冰藜屬植物Bassia muricata（Genbank No.：AY489198.1）、B.prostrata（Genbank No.：AY489216.1，HM630029.1）、B.eriophora（Genbank No.：KX282036.1，KX282034.1）、B.indica（Genbank No.：HM630026.1）、B.scoparia（Genbank No.：AY489218.1， FJ599757.1），兜藜屬植物Panderia pilosa（Genbank No.：AY489227.1， DQ499335.1），絨藜屬植物Londesia eriantha（Genbank No.：AY489220.1）的NJ樹。結(jié)果表明濱藜屬、波菜屬、甜菜屬、鹽節(jié)木屬、鹽千屈菜屬、棉藜屬分別聚為一支。菠菜子ITS2序列單獨聚為一支分支支持率達100%，表現(xiàn)出較好的單系性，能與同科近緣物種較好區(qū)分。ITS2序列可作為DNA條形碼用于菠菜子及其近緣物種的準確鑒定。如圖1所示。

3 指紋圖譜

3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq C18 4.6mm×250mm 5μm;流動相：甲醇（A）—0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～10min，10% A;10～20min，10%→30% A;20～40min，30%→40% A;40～65min，40%→80% A），流速：1.0mL/min;柱溫：30℃;檢測波長：240nm;進樣量：10μL。

3.2 供試品溶液的制備 取本品粉末（過三號篩）約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，密塞，稱定重量，加熱回流30min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.3 方法學考察

3.3.1 精密度試驗 取“3.2”項下供試品溶液（批號：S1）按“3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6針，記錄色譜圖。以5號色譜峰為參照，經(jīng)計算得到各共有峰的相對保留時間的RSD均小于0.9%，相對峰面積的RSD均小于2.1%，表明儀器的精密度良好。

3.3.2 重復性試驗 取同一批次菠菜子樣品（批號：S1）6份，按“3.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，按“3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣，記錄色譜圖。以5號色譜峰為參照，經(jīng)計算得到各共有峰的相對保留時間的RSD均小于1.0%，相對峰面積的RSD均小于3.5%，表明方法的重復性良好。

3.3.3 穩(wěn)定性 取菠菜子樣品（批號：S1）按“3.2”項下方法制備供試品溶液，按“3.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24h進樣，記錄色譜圖。以5號色譜峰為參照，經(jīng)計算得到各共有峰的相對保留時間的RSD均小于1.2%，相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4 不同產(chǎn)地菠菜子指紋圖譜的建立 取10批菠菜子樣品，按“3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“3.1”項下色譜條件依次進樣檢測，記錄色譜圖。采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng) 2012.130723 版本”軟件進行分析，以S1為參照圖譜，對照圖譜生成方法選擇中位數(shù)法，選擇時間寬度0.5，生成對照指紋圖譜R，確定了7個共有峰，10批不同來源菠菜子指紋圖譜如圖2所示。各批樣品與對照圖譜的相似度分別為 0.969、0.982、0.958、0.997、0.983、0.983、0.994、0.996、0.996、0.976，相似度計算結(jié)果均大于0.950，表明相似度良好。

根據(jù)10批菠菜子的指紋圖譜匹配結(jié)果，共匹配成功7個共有指紋峰，經(jīng)過與β-蛻皮甾酮對照品比對定位，標定出1個色譜峰，為β-蛻皮甾酮（5號峰），如圖3所示。

4 菠菜子中β-蛻皮甾酮含量測定HPLC方法學研究

4.1 溶液的制備

4.1.1 對照品溶液 取β-蛻皮甾酮對照品適量，精密稱定，加50% 甲醇制成每1mL含β-蛻皮甾酮40μg的溶液，即得對照品溶液。

4.1.2 供試品溶液 取本品（批號：S1）粉末（過三號篩）約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，稱定重量，加熱回流30分鐘，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過（0.45μm濾膜過濾），取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

4.2 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq C18 4.6mm × 250mm 5μm;流動相：甲醇（A）—0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～15min，45%→40%A;15～25min，40%→80% A;25～30min，80%→45% A;30～45min，45% A），流速：1.0mL/min;柱溫：30℃;檢測波長：248nm;進樣量：10μL。理論板數(shù)按標準品計算應不低于5000。

4.3 系統(tǒng)適用性 取“4.1.1”項下的對照品溶液，按“4.2”項下色譜條件進樣檢測，重復測定6次，要求6次所得色譜圖中峰面積的相對標準偏差（RSD）符合規(guī)定要求（RSD不得大于2.0%）。試驗結(jié)果顯示：重復進樣6 針的系統(tǒng)適用性溶液中，理論塔板數(shù)按β-蛻皮甾酮峰計算平均值為6902;β-蛻皮甾酮峰面積的RSD為0.09%，結(jié)果符合系統(tǒng)適用性要求。

4.4 專屬性試驗

4.4.1 分離度考察 分別取“4.1.1”項下的對照品溶液，“4.1.2”項下的供試品溶液，按“4.2”項下色譜條件進樣，供試品中β-蛻皮甾酮峰與對照品色譜峰保留時間一致，且與相鄰峰的分離度大于1.5，色譜圖如圖4所示。

4.4.2 供試品 溶液配制方法的考察本研究參照《中國藥典》2015年一部及相關文獻資料中β-蛻皮甾酮HPLC檢測方法中的供試品提取方法，分別以甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇為提取溶劑，設計了超聲和回流兩種提取方法，考察不同的提取溶劑及不同提取方法對含量測定的影響。

取本品（批號：S6）粉末（過三號篩）約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按表2設計的提取溶劑和提取方法，分別配置供試品溶液。另取β-蛻皮甾酮對照品適量，按“4.1.1”項下的方法配置對照品溶液，按“4.2”項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖，計算各提取溶劑和提取方法中β-蛻皮甾酮的含量。實驗結(jié)果（見表2）顯示，以50%甲醇和50%乙醇作為提取溶劑效果最好，且回流的效果明顯要好于超聲的效果，為避免檢測時溶劑峰的干擾，最后選擇以50%甲醇回流提取30min作為本品的供試品溶液配制方法。

4.5 檢測限和定量 限取“4.1.1”項下的對照品溶液，倍比稀釋，按“4.2”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，當信噪比為3∶1時得檢測限;當信噪比為10∶1得定量限。檢測結(jié)果顯示，β-蛻皮甾酮的檢測限為1.4ng，定量限為4.1ng。

4.6 線性及范圍 取β-蛻皮甾酮對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1mL含β-蛻皮甾酮1mg的溶液，作為線性實驗對照品貯備液，備用。分別取線性實驗對照品貯備液0.15、0.25、0.50、1.0、1.5、2.5、3.0mL，分別置25mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得不同濃度的系列線性對照品溶液。取各不同濃度的線性對照品溶液，按“4.2”項下色譜條件進樣檢測。以各濃度對照品溶液峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，做標準曲線，得到回歸方程Y=14.078X+8.979（r=0.9997），在6.115～122.304μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好，試驗結(jié)果符合規(guī)定要求。

4.7 精密度試驗 取“4.1.1”項下的對照品溶液，按“4.2”項下色譜條件檢測，連續(xù)進樣 6 次，記錄色譜圖，測得β-蛻皮甾酮峰面積的RSD為0.10%，表明儀器精密度良好。

4.8 溶液穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（批號：S1），按“4.2”項下色譜條件分別在 0、2、4、8、12、24h 進樣，記錄色譜圖。β-蛻皮甾酮的峰面積相對標準偏差RSD為1.04%，符合規(guī)定要求，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

4.9 重復性試驗 取同一批次菠菜子樣品（批號：S1）6份，按“4.1.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，按“4.1”項下色譜條件連續(xù)進樣，記錄色譜圖，測得β-蛻皮甾酮平均含量為0.97%，RSD為0.22%，表明方法重復性良好。

4.10 加樣回收率試驗 取6份已知含量的同一批次（批號：S1）菠菜子樣品，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入適量的β-蛻皮甾酮對照品溶液，按“4.1.2”項下的方法制備供試品溶液，按“4.2”項下色譜條件進樣檢，記錄色譜圖，計算回收率。結(jié)果β-蛻皮甾酮平均回收率為98.92%，RSD為1.49%，表明本方法的回收率良好，見表3。

4.11 樣品含量測定 取10批菠菜子樣品，按“4.1.1”項的方法制備對照品溶液、按“4.1.2”項下的方法分別制備供試品溶液，按“4.2”項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖，計算10批樣品中的β-蛻皮甾酮的含量，檢測結(jié)果見表4。

5 討論

相比中藥材，維吾爾藥材來源更為復雜，在長期的用藥過程中藥材質(zhì)量標準還有待進一步提高，藥材監(jiān)管難度頗大[8]。DNA條形碼鑒定方法不依賴于專業(yè)人員的主觀經(jīng)驗以及植物的形態(tài)特征，不受時間、氣候等外界因素的影響，針對物種的遺傳信息進行鑒定，因其操作簡便、快捷，結(jié)果客觀、準確可靠在中藥材鑒定中廣泛應用[9]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，菠菜子ITS2序列單獨聚為一支分支，具有良好的單系性，能與同科近緣物種較好區(qū)分，使用 ITS2序列即能實現(xiàn)維吾爾藥材菠菜子及其同科近緣物種的鑒定，建立的DNA條形碼技術可以追溯藥材的基原，快速準確的鑒定維吾爾藥材菠菜子，在今后藥材來源、標準制定、藥材流通和市場管理等實際應用中具有重要的價值。

菠菜子在維醫(yī)理論中具有清利異常膽液質(zhì)、退熱利尿、通便止痛之功效[1]，現(xiàn)代藥理研究[11]發(fā)現(xiàn)菠菜子的水溶液能有效抑制二甲苯誘導的小鼠耳腫脹，緩解大鼠的棉球肉芽腫。β-蛻皮甾酮（蛻皮激素）作為是菠菜子藥材的主要化學成分，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其促進小鼠前成骨細胞體外增殖誘導成骨分化，并能通過介導β鏈蛋白信號轉(zhuǎn)導通路改善骨關節(jié)炎小鼠的關節(jié)軟骨損傷[12-14]，與菠菜子的傳統(tǒng)功效和現(xiàn)代抗炎作用相吻合。本研究首次建立10批不同來源菠菜子藥材的 HPLC 指紋圖譜，共標定出7個共有峰，并以主要化學成分β-蛻皮甾酮（5號峰）為參照峰，10批菠菜子藥材的相似度均在0.9以上，所得圖譜可以表征菠菜子藥材的特征屬性，可用于菠菜子藥材的鑒定，亦為對菠菜子更準確全面的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

在指標性成分β-蛻皮甾酮含量測定的方法學研究中，本實驗還進行了耐用性試驗：①在其他色譜條件不變的情況下，考察流速為0.9mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min時對-蛻皮甾酮分離效果的影響，試驗結(jié)果表明當流速為1.0mL/min時，β-蛻皮甾酮色譜峰的出峰時間適中，對稱性及分離度較最好。②在其他色譜條件不變的情況下，考察柱溫為 28℃、30℃、32℃時對β-蛻皮甾酮分離效果的影響，試驗結(jié)果顯示當柱溫為 28～32℃時，各主要色譜峰的峰型、分離度差異不大，結(jié)合實驗的實際情況，最終選擇常用的30℃作為色譜柱柱溫。結(jié)果表明該方法穩(wěn)定、專屬性強、靈敏度高，適合用于菠菜子中β-蛻皮甾酮的含量測定。

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