ALK融合基因陽(yáng)性肺腺癌患者耐藥核心基因鑒定及藥物靶點(diǎn)分析

祁春艷，吳濤，齊曉光

0 引言

目前肺腺癌的治療已經(jīng)是基于基因分型的個(gè)體化治療，間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）融合基因陽(yáng)性雖然比例低（1%～4%），但對(duì)于伴有ALK融合基因陽(yáng)性肺腺癌患者，應(yīng)用ALK抑制劑后生存期延長(zhǎng)[1]，所以ALK融合基因陽(yáng)性被稱(chēng)為“鉆石突變”，但轉(zhuǎn)移灶進(jìn)展或耐藥問(wèn)題是困擾ALK抑制劑應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題，相關(guān)探索及藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)一直備受臨床醫(yī)師關(guān)注。

隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，同一患者不同部位的基因表達(dá)譜的測(cè)序研究為進(jìn)一步探索靶向藥物的耐藥提供了新的方法學(xué)支持，本研究利用GEO公共數(shù)據(jù)庫(kù)二代測(cè)序的ALK陽(yáng)性肺腺癌原始數(shù)據(jù)，分析并比較ALK陽(yáng)性肺腺癌中原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶之間的基因表達(dá)譜及富集通路的差異，從而對(duì)理解腫瘤轉(zhuǎn)移灶的異質(zhì)性及其耐藥機(jī)制具有重要意義，也將更好地回答轉(zhuǎn)移灶靶向藥物耐藥問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 肺腺癌基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集篩選

在NCBI中檢索ALK融合基因陽(yáng)性的肺腺癌患者，選取GEO GSE125864進(jìn)行研究，納入ALK融合基因陽(yáng)性的原發(fā)腫瘤及其轉(zhuǎn)移病變?yōu)檠芯繉?duì)象；同時(shí)下載該數(shù)據(jù)集的RNA表達(dá)譜矩陣進(jìn)行后續(xù)研究，根據(jù)人類(lèi)基因探針數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用R語(yǔ)言進(jìn)行基因探針與基因名稱(chēng)的轉(zhuǎn)化，并對(duì)每個(gè)基因表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)對(duì)數(shù)化處理，以備后續(xù)研究；根據(jù)取材部位的不同，分為原發(fā)灶組和轉(zhuǎn)移灶組。下載原始基因表達(dá)譜原始數(shù)據(jù)CSV文件進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2 差異基因分析

應(yīng)用R語(yǔ)言DEseq2軟件包進(jìn)行分析，參數(shù)設(shè)置log FoldChange=1,P＜0.05，篩選兩組之間的差異表達(dá)基因，并利用R軟件繪制熱圖及火山圖。

1.3 GO功能注釋及KEGG富集通路分析

基于在線(xiàn)生物信息學(xué)在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)D AV I D（https://david.ncifcrf.gov/），將兩組之間顯著差異表達(dá)基因納入研究，進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology,GO）及京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集信號(hào)通路分析，觀(guān)察兩組在生物學(xué)行為及富集信號(hào)通路之間的差異。應(yīng)用R軟件Hmisc、ggplot2軟件包繪制排名前10的GO及KEGG通路氣泡圖。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)及Cytoscape軟件分析關(guān)鍵Hub基因

對(duì)兩組之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白-蛋白互作表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（PPI）研究，首先，采用String在線(xiàn)軟件分析兩組患者中差異基因的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；其次，將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的TSV文件在Cytoscape軟件（3.7.1版本）中作進(jìn)一步功能分析；剔除網(wǎng)絡(luò)中的孤立節(jié)點(diǎn)，在原發(fā)灶中的差異基因表達(dá)顯示為紅色，而對(duì)轉(zhuǎn)移灶中的差異基因顯示為藍(lán)色；最后，運(yùn)用Cytoscape中的MCODE和Cytohubba軟件，對(duì)這些蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)行重要模塊及關(guān)鍵Hub基因分析。

1.5 關(guān)鍵核心基因與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系

通過(guò)GEPIA在線(xiàn)生存分析工具（廣泛應(yīng)用的腫瘤TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的挖掘網(wǎng)站），對(duì)關(guān)鍵Hub基因進(jìn)行預(yù)后研究分析并繪制生存曲線(xiàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 關(guān)鍵基因分子通路預(yù)測(cè)與藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)分析

為進(jìn)一步明確這些關(guān)鍵基因參與的分子通路及其與藥物治療靶點(diǎn)的關(guān)系，本研究應(yīng)用GSCALite（http://bioinfo.life.hust.edu.cn/web/GSCALite/）及其癌癥治療反應(yīng)門(mén)戶(hù)（The Cancer Therapeutics Response Portal,CTRP）進(jìn)行藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)分析，CTRP數(shù)據(jù)庫(kù)是將癌癥細(xì)胞系的遺傳、細(xì)胞特征與小分子敏感度綜合在一起進(jìn)行分析，目的是發(fā)現(xiàn)與潛在靶點(diǎn)匹配藥物的方法。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者差異基因表達(dá)譜分析

結(jié)果顯示，篩選出227個(gè)差異基因，以肺腺癌原發(fā)灶為對(duì)照組，轉(zhuǎn)移灶中共發(fā)現(xiàn)134個(gè)上調(diào)基因，93個(gè)下調(diào)的差異基因，見(jiàn)圖1。

圖1 原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶組患者顯著差異基因表達(dá)譜比較Figure 1 Comparison of differential genes expression profile between primary and metastatic sites

2.2 差異表達(dá)基因的GO功能注釋和KEGG富集通路分析

GO功能注釋結(jié)果顯示，這些差異基因主要參與了異型生物質(zhì)的代謝、類(lèi)固醇代謝、細(xì)胞色素P450酶代謝等生物學(xué)過(guò)程，還參與了血液微粒、細(xì)胞外空間、外泌體等細(xì)胞組分以及氧氣結(jié)合、鐵離子結(jié)合、血紅素結(jié)合等分子功能，見(jiàn)圖2A～C。

圖2 氣泡圖展示差異表達(dá)基因排名前10的GO功能和KEGG通路分析Figure 2 Bubble plots of top 10 GO terms and KEGG pathway enrichment of DEGs

KEGG富集通路分析結(jié)果顯示，這些差異表達(dá)基因主要參與了補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、化學(xué)致癌作用、視黃醇的新陳代謝等信號(hào)通路，見(jiàn)圖2D。

2.3 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及Hub基因分析

通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，構(gòu)建的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖3A，其中紅色代表在原發(fā)灶中高表達(dá)，藍(lán)色代表在轉(zhuǎn)移灶組中高表達(dá)；為進(jìn)一步分析蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中重要的功能區(qū)域，采用MCODE軟件對(duì)蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的重要模型進(jìn)行分析，選取最重要的兩個(gè)模型進(jìn)行展示，結(jié)果顯示，這兩個(gè)模塊在蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中具有重要的功能區(qū)域，見(jiàn)圖3B～C；為尋找蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵的Hub基因，利用cytohubba軟件，基于MNC算法，計(jì)算排名前10的重要的Hub基因：SERPINC1、TTR、NR1H4、FGA、FGG、APOB、HRG、APOA1、AHSG、FGB；對(duì)這些潛在重要的Hub基因進(jìn)行后續(xù)研究，結(jié)果見(jiàn)圖3D。

圖3 構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及Hub基因分析Figure 3 Construction of protein-protein interaction networks and analysis of Hub genes

2.4 Hub基因與肺腺癌的預(yù)后關(guān)系

結(jié)果顯示，HRG、AHSG等高表達(dá)組的中位總生存時(shí)間明顯短于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.018,P=0.015），而其他關(guān)鍵核心基因SERPINC1、TTR、NR1H4、FGA、FGG、APOB、APOA1、FGB與肺腺癌預(yù)后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4。

圖4 Hub基因表達(dá)水平與肺腺癌的生存分析Figure 4 Survival analysis of lung adenocarcinoma patients in relation to expression of hub genes

2.5 關(guān)鍵Hub分子通路分析及藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

結(jié)果顯示，這些關(guān)鍵基因參與的信號(hào)通路有所不同，激活關(guān)鍵基因的通路，主要集中在DNA損傷修復(fù)反應(yīng)、RAS/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RTK信號(hào)通路；而抑制這些關(guān)鍵基因后，主要是凋亡和細(xì)胞周期信號(hào)通路。在治療藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)方面，SERPINC1、HRG、APOA1、FGA、FGG等與多種潛在小分子抑制劑具有一定相關(guān)性，見(jiàn)圖5。

圖5 Hub基因參與通路富集(A)及潛在藥物靶點(diǎn)(B)分析Figure 5 Hub genes involved in pathways enrichment(A) and potential drug targets(B)

3 討論

目前肺腺癌的治療是基于基因分析指導(dǎo)下個(gè)體化治療時(shí)代，需要針對(duì)EGFR、ALK等不同的突變位點(diǎn)，針對(duì)性選擇相應(yīng)的靶向藥物。然而靶向藥物的耐藥，尤其是轉(zhuǎn)移灶出現(xiàn)進(jìn)展或耐藥問(wèn)題仍是不可忽視的重要醫(yī)學(xué)問(wèn)題，一個(gè)很重要的原因在于肺腺癌是高度異質(zhì)性的腫瘤[2-4]，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的異質(zhì)性中，時(shí)間-空間的異質(zhì)性成為靶向耐藥的新的重要機(jī)制。因此，針對(duì)肺腺癌患者進(jìn)行時(shí)間-空間的異質(zhì)性的研究具有重要意義，本課題正是基于此臨床問(wèn)題出發(fā)，探索ALK融合基因陽(yáng)性的肺腺癌患者的空間異質(zhì)性。這將有助于進(jìn)一步明確應(yīng)用ALK靶向藥物后轉(zhuǎn)移灶耐藥的分子機(jī)制，從而可以更加精準(zhǔn)化治療肺腺癌患者。

本研究的重要結(jié)果之一在于，在肺腺癌ALK融合基因陽(yáng)性這一亞型中，原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶組基因表達(dá)譜及富集通路之間存在差異，這些差異基因更多富集在代謝相關(guān)通路，而富集通路的差異或許可以解釋臨床中應(yīng)用ALK融合抑制劑后出現(xiàn)原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶組反應(yīng)不一致的情況。

本研究篩選了兩個(gè)重要的模塊區(qū)域和潛在的關(guān)鍵核心基因，提示這些功能模塊和潛在的關(guān)鍵基因可能在ALK融合基因陽(yáng)性的肺腺癌中具有重要的生物學(xué)意義，后續(xù)針對(duì)這些潛在關(guān)鍵基因進(jìn)行深入研究，有望發(fā)現(xiàn)肺腺癌新的藥物治療靶點(diǎn)。

HRG（富含組氨酸糖蛋白）是一種蛋白編碼基因。Chen等[5]分析在良性胰腺病變和惡性胰腺腫瘤中的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HRG參與了胰腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展等惡性轉(zhuǎn)換機(jī)制，Bogoevska等[6]在結(jié)腸癌研究中發(fā)現(xiàn)，HRG參與了Her2介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲等；其導(dǎo)致腫瘤惡性轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制在于，HRG-1在質(zhì)膜上的表達(dá)增強(qiáng)了空泡-(H(+)) ATP酶的活性，參與了糖酵解通路，促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲[7]。而HRG與肺腺癌的研究未見(jiàn)報(bào)道，本研究結(jié)果顯示，HRG不僅為肺腺癌預(yù)后不良的預(yù)測(cè)分子，而且也在一定程度上提示該基因可能在肺腺癌空間異質(zhì)性惡性轉(zhuǎn)化中扮演了重要的分子功能。

AHSG編碼蛋白參與包括內(nèi)吞作用、大腦發(fā)育和骨組織的形成，Niu等[8]研究發(fā)現(xiàn)，AHSG作為血清中腫瘤來(lái)源的外泌體生物標(biāo)志物，檢測(cè)血清外泌體中AHSG的表達(dá)水平，有助于早期篩查非小細(xì)胞肺癌患者。AHSG基因在肺癌惡性轉(zhuǎn)化及耐藥等機(jī)制方面亦未見(jiàn)報(bào)道，本研究提示其不僅參與了ALK融合基因陽(yáng)性肺腺癌異質(zhì)性等惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程，且該基因?yàn)榉蜗侔╊A(yù)后不良的標(biāo)志物之一，有待進(jìn)一步對(duì)該基因進(jìn)行功能研究，以揭示其參與肺腺癌時(shí)空異質(zhì)性惡性轉(zhuǎn)化的具體機(jī)制。

在關(guān)鍵基因靶點(diǎn)與其匹配的藥物治療分析方面，篩選出了5個(gè)潛在的藥物治療靶點(diǎn)，而且與目前已有的一些小分子藥物具有一定的相關(guān)性，提示，針對(duì)這些潛在的藥物治療靶點(diǎn)深入研究，有望研發(fā)新的靶向藥物，從而對(duì)更加精準(zhǔn)化地治療肺腺癌ALK陽(yáng)性患者具有重要意義。

本研究在一定程度上揭示了ALK融合基因陽(yáng)性肺腺癌患者在空間異質(zhì)性的潛在機(jī)制，對(duì)探索ALK融合基因陽(yáng)性肺腺癌患者靶向治療的耐藥新機(jī)制有重要意義。