基于GC-MS和感官評(píng)價(jià)篩選蛋腐乳的最適菌種

李瑞英，吉艷莉，王澤琳，仝其根

（1 北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院 北京102206 2 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室 北京100022 3 蛋品安全生產(chǎn)與加工北京市工程研究中心 北京100094）

雞蛋富含多種營養(yǎng)物質(zhì)[1]。現(xiàn)有的深加工蛋制品包括再制蛋類、干蛋類和冰蛋[2]。再制蛋類包括皮蛋[3-4]、糟蛋[5-7]等，干蛋類包括蛋黃粉[8-9]、全蛋粉[9]等。此外，還有發(fā)酵類蛋制品，比如發(fā)酵蛋乳飲料[10]、發(fā)酵蛋乳酸奶[11]、豆?jié){雞蛋發(fā)酵飲品[12]、臭蛋制品[13]等。李雙峰[14]發(fā)明了一種雞蛋發(fā)酵食品及其制備方法。沙菲等[15]研發(fā)了一種新型發(fā)酵蛋制品，將雞蛋制成雞蛋干后經(jīng)霉菌發(fā)酵，再進(jìn)行腌制和后酵，制成雞蛋腐乳。國內(nèi)蛋類產(chǎn)品的研究較多，然而在發(fā)酵制品方面的研究相對較少，并且風(fēng)味不被大眾接受。本試驗(yàn)通過單一菌種和復(fù)配菌種分別發(fā)酵的方式，并結(jié)合不同菌種蛋腐乳質(zhì)構(gòu)情況篩選出使蛋腐乳風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)都好的發(fā)酵菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

德清源A＋鮮雞蛋，北京德清源農(nóng)業(yè)科技股份有限公司；亞硫酸氫鈉，北京世紀(jì)紅星化工有限責(zé)任公司；五通橋毛霉（W4）、米根霉（M4）、藤黃微球菌（M.luteus），魯氏酵母菌（S 酵母）均保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；后酵湯汁（主要成分為紅曲米膏、黃酒、面曲），北京市昌平區(qū)永旺超市。

MT50 嵌入式蒸汽烤箱，佛山市雷哲電器有限公司；HDGDSJ-500 型恒溫恒濕試驗(yàn)箱，上海衡鼎儀器設(shè)備廠；57328-U 頂空固相微萃取頭（Gray，50/30 μm DVB/CAR/PDMS），美國Supelco 公司；7890A-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent 公司；CT3 質(zhì)構(gòu)分析儀，美國Brookfield 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蛋腐乳的制作 用攪拌機(jī)將全蛋液均勻打散，將蛋液用不銹鋼超細(xì)過濾網(wǎng)漏勺過濾以濾去卵黃系帶。加入0.05%的亞硫酸氫鈉保持蛋液的顏色，攪拌均勻，45℃水浴30 min 后在45℃條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸10 min，濾除氣泡。85℃蒸汽烤箱蒸40 min，晾涼后高壓蒸汽滅菌（105℃，15 min）制成蛋坯備用。將蛋坯切成2.5 cm×2.5 cm×1.6 cm 的小塊，將試驗(yàn)菌制成菌液，蛋坯表面均勻噴灑菌液，28℃前酵40 h 后搓毛，搓毛后裝瓶（每瓶裝4 小塊），灌入100 mL 后酵湯汁，于25℃條件下在密封瓶中后酵。

1.2.2 紅方湯汁的制作將4.5 g 紅曲和2.8 g 面曲用粉碎機(jī)研磨成粉狀。將一定量的黃酒與紅曲、面曲混合均勻，酒精度控制在15～16%vol，再加入8%的食鹽。將混合均勻的湯汁用高壓鍋煮制微沸狀態(tài)，保持15 min，自然條件下晾涼，即為紅方湯汁。

1.2.3 感官評(píng)價(jià)選取10 位感官評(píng)價(jià)員進(jìn)行感官評(píng)定，參考SB/T 10170-2007《腐乳》中的腐乳感官要求，并結(jié)合雞蛋腐乳的特性，分別從色澤、塊型、香氣、滋味、口感5 個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分。評(píng)定的最終得分以平均值計(jì)算，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 雞蛋腐乳感官評(píng)價(jià)表Table 1 Sensory evaluation table of egg fermented bean curd

1.2.4 GC-MS 檢測

1.2.4.1 頂空固相微萃取條件[16]準(zhǔn)確稱量5.0 g樣品，放置于15 mL 的螺口樣品瓶中，將螺口樣品瓶密封，放在80℃的恒溫水浴鍋中水浴平衡10 min。將SPME 萃取頭插入瓶中，使之處于樣品上方一定距離處，避免萃取頭接觸到樣品。推出纖維頭在選定的溫度條件下頂空吸附40 min，然后將萃取頭插入氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，在250℃溫度條件下解吸5 min。

1.2.4.2 色譜-質(zhì)譜條件[16]色譜條件：色譜柱HP-5MS（0.25 mm×30 m，0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱；升溫程序的起始柱溫50℃，保持2 min，以4℃/min 上升至160℃，不保留，以6℃/min 上升至270℃，保持12 min；載氣為He 氣，載氣流量1.2 mL/min；恒壓40 kPa，不分流；進(jìn)樣口溫度與接口溫度均為250℃，檢測溫度200℃。

質(zhì)譜條件：電子轟擊為EI 離子源；離子源溫度200℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍（m/z）50～500 u。

1.2.4.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析[16]試驗(yàn)數(shù)據(jù)由計(jì)算機(jī)譜庫NIST、Wiley 進(jìn)行檢索與分析，確定雞蛋腐乳中各個(gè)揮發(fā)性物質(zhì)。半定量分析：采用峰面積歸一化法計(jì)算樣品中各個(gè)組分的相對百分含量。

式中，M——單組份風(fēng)味成分的峰面積；N——總峰面積。

1.2.5 理化指標(biāo)測定

1）總酸含量 采用SB/T 10170-2007《腐乳》中總酸的檢測方法。使用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，以酸度計(jì)測定終點(diǎn)，結(jié)果以乳酸表示[17]。

2）氨基酸態(tài)氮含量 采用SB/T 10170-2007《腐乳》的氨基酸態(tài)氮含量的檢測方法。依據(jù)氨基酸的兩性作用的原理，加入甲醛固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，以酸度計(jì)測定終點(diǎn)[17]。

1.2.6 質(zhì)構(gòu)測定[18]選取塊型整齊、均勻的雞蛋腐乳，除去湯汁和蛋腐乳的外表皮，從中心部位切取1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm 的樣品，放置于質(zhì)構(gòu)儀操作臺(tái)的中央部位，采用二次下壓法測定雞蛋腐乳的質(zhì)構(gòu)曲線。測定前速度0.5 mm/s，測試速度1.0 mm/s，兩次下壓停留間隔時(shí)間5 s，形變50%，每組樣品測定5 次，去除1 個(gè)最低值和1 個(gè)最高值，取剩余值的平均值。

1.2.7 氨基甲酸乙酯（EC）含量測定 根據(jù)趙依芃等[19]的方法檢測腐乳中EC 的含量。

1.2.8 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)GC-MS、感官評(píng)價(jià)、總酸含量、氨基酸肽氮含量、質(zhì)構(gòu)和EC 含量的測定結(jié)果，篩選出最適合蛋腐乳發(fā)酵的菌種，再用該菌種發(fā)酵的蛋腐乳根據(jù)1.2.4 節(jié)的檢測方法進(jìn)行GCMS 的驗(yàn)證試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵菌組合對蛋腐乳風(fēng)味的影響

分別用五通橋毛霉、五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配、藤黃微球菌、藤黃微球菌+魯氏酵母菌復(fù)配、米根霉、米根霉+魯氏酵母菌復(fù)配6 組前酵菌種發(fā)酵40 h 后進(jìn)行后酵。分別在后酵3，23，38，53，63，73，100 d 進(jìn)行感官評(píng)價(jià)和GC-MS 測定。

2.1.1 不同發(fā)酵時(shí)間GC-MS 分析根據(jù)6 組前酵菌種發(fā)酵蛋腐乳中風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS 分析結(jié)果，以五通橋毛霉、五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配作為前酵菌種的蛋腐乳，在后酵不同階段共檢出93 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中烴類20 種、醛類13 種、醇類6 種、酸類12 種、酯類28 種、酮酚類7 種、其它類7 種。

由圖1～2 可知，不同后酵階段的各類揮發(fā)性成分含量有明顯變化。以五通橋毛霉作為前酵菌種發(fā)酵的蛋腐乳具有烴類物質(zhì)減少，脂類和醇類物質(zhì)增加的特點(diǎn)，并且其酯類和醇類化合物占總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的比例較高，是主要揮發(fā)性成分；以五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配作為前酵菌種發(fā)酵的蛋腐乳的主要揮發(fā)性成分除酯類和醇類化合物外，酸類物質(zhì)也占了一定的比例。

圖1 五通橋毛霉發(fā)酵蛋腐乳不同階段揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對百分含量Fig.1 Relative percentage of volatile flavor components in different stages of Mucor wutongqiao egg fermented bean curd

結(jié)合表2感官評(píng)價(jià)結(jié)果可以看出，五通橋毛霉蛋腐乳風(fēng)味變化較為平緩，在后酵23 d 時(shí)，感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)最高。在后酵23 d 的五通橋毛霉蛋腐乳中，相對含量由高到低依次為醇類（59.09%）、酯類（28.31%）、醛類（5.16%）、其它類（5%）及酮酚類（1.13%），烴類（0.24%）和酸類（0.14%）所占比例較少。五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳的感官評(píng)價(jià)總分比五通橋毛霉蛋腐乳稍低，香氣評(píng)分也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于五通橋毛霉蛋腐乳，然而滋味評(píng)分跟五通橋毛霉蛋腐乳相差不多。后酵73 d，五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配的蛋腐乳感官評(píng)價(jià)總分最高，其相對含量由高到低依次為酯類（92.75%）、醇類（3.09%）、酸類（1.33%）及醛類（1.33%），酮酚類（0.15%）、其它類（0.14%）和烴類（0.06%）占比較少。

圖2 五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配發(fā)酵蛋腐乳不同階段揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對百分含量Fig.2 Relative percentage of volatile flavor components in different stages of Mucor wutongqiao and Saccharomyces rouxii mixed egg fermented bean curd

發(fā)酵菌種是藤黃微球菌、藤黃微球菌+魯氏酵母菌復(fù)配的蛋腐乳，在后酵不同階段共檢出88 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中烴類19 種、醛類12 種、醇類7種、酸類13 種、酯類25 種、酮酚類8 種、其它類4 種。

由圖3可知，與五通橋毛霉蛋腐乳、五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳相比，藤黃微球菌發(fā)酵的蛋腐乳在后酵不同階段醇類物質(zhì)相對含量有明顯增加，酯類物質(zhì)有所減少。結(jié)合表2感官評(píng)價(jià)結(jié)果可以看出，藤黃微球菌發(fā)酵的蛋腐乳、藤黃微球菌+魯氏酵母菌復(fù)配的蛋腐乳在后酵100 d 過程中感官評(píng)分變化很大。從香氣評(píng)分來看，藤黃微球菌+魯氏酵母菌復(fù)配發(fā)酵的蛋腐乳香氣評(píng)分越來越高，而藤黃微球菌發(fā)酵的蛋腐乳卻有逐漸降低的趨勢。后酵53 d，藤黃微球菌發(fā)酵的蛋腐乳綜合評(píng)分最高，相對含量由高到低依次為醇類（57.22%）、酯類（34.9%）、酸類（2.9%）、醛類（1.88%）、酮酚類（1.24%）、其它類（1.22%）和烴類（0.45%）；后酵23 d，藤黃微球菌+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳的綜合評(píng)分和香氣評(píng)分最高，其揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量由高到低依次為酯類（43.16%）、醇類（39.16%）、酸類（15.06%）、醛類（1.53%）、其它類（1.02%）和烴類（0.07%）。

圖3 藤黃微球菌發(fā)酵蛋腐乳不同階段揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對含量Fig.3 Relative percentage of volatile flavor components in different stages of Micrococcus luteus egg fermented bean curd

圖4 藤黃微球菌+魯氏酵母菌復(fù)配發(fā)酵蛋腐乳不同階段揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對含量Fig.4 Relative percentage of volatile flavor components in different stages of Micrococcus luteus and Saccharomyces rouxii mixed egg fermented bean curd

用米根霉、米根霉+魯氏酵母菌復(fù)配作為前酵菌種的蛋腐乳，在后酵不同階段共檢出56 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中烴類5 種、醛類6 種、醇類2 種、酸類7 種、酯類28 種、酮酚類6 種、其它類2 種。與之前4 種腐乳相比，米根霉、米根霉+魯氏酵母菌復(fù)配的腐乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類大大減少，結(jié)合圖5～6 發(fā)現(xiàn)，酯類物質(zhì)占比最高達(dá)90%以上?？傮w來說，米根霉發(fā)酵的蛋腐乳香氣評(píng)分比米根霉+魯氏酵母菌復(fù)配的蛋腐乳要高，但兩者的滋味評(píng)分都不高，這是由于2 種蛋腐乳都發(fā)澀所致。

圖5 米根霉發(fā)酵蛋腐乳不同階段揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對含量Fig.5 Relative percentage of volatile flavor components in different stages of Rhizopus oryzae egg fermented bean curd

2.1.2 不同發(fā)酵時(shí)間的樣品風(fēng)味感觀評(píng)價(jià)分析 由表2感官評(píng)價(jià)表可知，不同發(fā)酵菌種相同發(fā)酵階段下五通橋毛霉蛋腐乳的評(píng)分最高，風(fēng)味最好，其次是五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳。同一發(fā)酵菌種，五通橋毛霉蛋腐乳發(fā)酵100 d 時(shí)評(píng)分最高；五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳發(fā)酵73 d 時(shí)評(píng)分最高；藤黃微球菌蛋腐乳發(fā)酵53 d 時(shí)評(píng)分最高；藤黃微球菌+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳發(fā)酵23 d 時(shí)評(píng)分最高；米根霉蛋腐乳發(fā)酵73 d 時(shí)評(píng)分最高；米根霉+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳發(fā)酵38 d 時(shí)評(píng)分最高。五通橋毛霉蛋腐乳與藤黃微球菌蛋腐乳、藤黃微球菌+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳、米根霉蛋腐乳、米根霉+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳的感官評(píng)分都具有顯著性差異。藤黃微球菌蛋腐乳是感官評(píng)分最差的蛋腐乳，可能是由于在蛋腐乳發(fā)酵過程中產(chǎn)生了2-甲基丁酸和癸酸這2 種與腐臭味相關(guān)的化合物，而五通橋毛霉蛋腐乳、米根霉蛋腐乳和米根霉+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳沒有產(chǎn)生這2 種物質(zhì)。五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳只在發(fā)酵第3 天產(chǎn)生癸酸且含量非常低（僅0.04%），故對風(fēng)味沒有產(chǎn)生太大影響。米根霉蛋腐乳和米根霉+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中酯類物質(zhì)太多（酯類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)占90%以上，醇類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中愉悅風(fēng)味物質(zhì)只產(chǎn)生了苯乙醇、對羥基苯乙醇2 種，且它們的含量極低），2 種蛋腐乳產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類較少，而且感官評(píng)價(jià)過程中米根霉蛋腐乳和米根霉+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳會(huì)發(fā)澀，這是2 種腐乳感官評(píng)價(jià)低的主要原因。

圖6 米根霉+魯氏酵母菌復(fù)配發(fā)酵蛋腐乳不同階段揮發(fā)性風(fēng)味成分的相對含量Fig.6 Relative percentage of volatile flavor components in different stages of Rhizopus oryzae and Saccharomyces rouxii mixed egg fermented bean curd

表2 不同菌種發(fā)酵不同階段感官評(píng)價(jià)分值Table 2 Sensory evaluation scores of different strains at different stages of fermentation

2.2 腐乳后酵不同階段的風(fēng)味物質(zhì)成分分析

2.2.1 烴類化合物 在蛋腐乳后酵過程中檢出的烴類化合物共25 種，分別是十二烷、環(huán)十二烷、正十三烷、正十四烷、正十五烷、正十六烷、正十七烷、正十八烷、正二十烷、二十五烷、1，2-環(huán)氧十八烷、二十七烷、正二十八烷、正三十四烷、三癸基環(huán)氧乙烷、正癸烯、環(huán)十二烯、2-十四（碳）烯、1-十四烯、7-十四碳烯、1-石竹烯、十五烯、十七烯、1-十九烯和氧化石竹烯。不同前酵菌種蛋腐乳的烴類化合物相對含量差異較大，米根霉發(fā)酵的蛋腐乳只有5 種烴類物質(zhì)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它菌種發(fā)酵的蛋腐乳。烴類物質(zhì)的閾值都非常高，因此對風(fēng)味的貢獻(xiàn)并不明顯[20]。

2.2.2 醛類化合物 醛類物質(zhì)閾值較低[21]，相對含量不同會(huì)使產(chǎn)品風(fēng)味差異較大。醛類物質(zhì)主要呈青草、脂肪臭，有的呈花香、水果香。蛋腐乳后酵過程中共檢出15 種醛類化合物，分別是5-甲基呋喃醛、苯甲醛、苯乙醛、對甲氧基苯甲醛、壬醛、阿托醛、反，反-2，4-壬二烯醛、2-苯基巴豆醛、2，4-癸二烯醛、反式-2，4-癸二烯醛、癸醛、反式-2-癸烯醛、2-十一烯醛、4-N-戊（烷）基苯甲醛和肉豆蔻醛。苯甲醛產(chǎn)生苦杏仁味[21]，苯乙醛具有風(fēng)信子香味。辛醛具有臘香、蘋果皮香、橙柑香氣，明顯的脂肪和水果氣味[22]。壬醛有強(qiáng)烈的脂肪氣息，類似牛脂，稀釋時(shí)具有橙子及玫瑰香氣[22]。本試驗(yàn)中醛類相對含量較高的是五通橋毛霉蛋腐乳（18.18%）、藤黃微球菌+魯氏酵母菌復(fù)配發(fā)酵的蛋腐乳（17.88%）和藤黃微球菌發(fā)酵的蛋腐乳（16.91%）。

2.2.3 醇類化合物 醇類物質(zhì)被認(rèn)為是脂肪酸氧化的產(chǎn)物[23]，可能是在發(fā)酵過程中，豐富的脂肪酸氧化分解為醇類物質(zhì)，使其風(fēng)味增加。揮發(fā)性較高的不飽和醇均有特殊香氣，而其它醇類閾值很高，對食品風(fēng)味的貢獻(xiàn)較小[24]。蛋腐乳后酵過程中共檢出9 種醇類化合物，分別是苯甲醇、苯乙醇、1-苯基-2-丙醇、1-甲基環(huán)己醇、對羥基苯乙醇、反式-2-癸烯醇、十二醇、色醇和十三醇。醇類物質(zhì)主要呈水果香，有的有花香，但烯醇的風(fēng)味與其它飽和醇并不相同，呈青草、塵土風(fēng)味[25]。

2.2.4 酸類化合物 酸類化合物可能來自脂肪的氧化和微生物發(fā)酵[26]，也可能是碳水化合物分解的產(chǎn)物[27]。蛋腐乳后酵過程中共檢出16 種酸類化合物，分別是異戊酸、2-甲基丁酸、2-甲基己酸、苯乙酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、γ-亞麻酸、棕櫚酸、油酸、亞油酸、反油酸、花生四烯酸、順-8，11，14-二十碳三烯酸、順-6-十八碳烯酸和順式-十八碳烯酸。在后酵過程中產(chǎn)生的最主要的酸類物質(zhì)就是棕櫚酸。2-甲基丁酸和癸酸與酸臭味有關(guān)[25]，五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配發(fā)酵的蛋腐乳中出現(xiàn)了癸酸（0.04%），而在藤黃微球菌蛋腐乳中2-甲基丁酸最高達(dá)1.02%，藤黃微球菌+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳癸酸最高達(dá)0.44%，其它3 種蛋腐乳沒有產(chǎn)生這2 種酸類物質(zhì)。

2.2.5 酯類化合物 在蛋腐乳后酵過程中檢出種類最多的化合物就是酯類物質(zhì)，共檢出37 種，其中棕櫚酸乙酯、十四酸乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯和丁二酸二乙酯含量較高。酯類物質(zhì)一般都能提供花香和水果香韻[28]。棕櫚酸乙酯呈微弱蠟香、果香和奶油香氣[29]；十四酸乙酯呈椰子和蜂蠟似風(fēng)味[30]；辛酸乙酯呈果香和脂肪香；丁二酸二乙酯呈酒香和果香。有研究表明酯類物質(zhì)主要是由酒中的酸類物質(zhì)與醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)生產(chǎn)的[31-32]。還有一部分是由魯氏酵母菌和其它微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的[33]。

2.2.6 酮酚類以及其它化合物 在蛋腐乳后酵過程中共檢出12 種酮酚類化合物。酮類化合物具有獨(dú)特的清香和果香風(fēng)味[21]。由于酚類閾值較低，故其具有相對較高的氣味活度值[34]。12 種酮酚類化合物中愉悅揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有2-甲氧基-4-烯丙基酚（又叫丁香酚），具有丁香和果香[25]。在蛋腐乳后酵過程中還檢出8 種其它類化合物，其中2-正戊基呋喃閾值較低，具有豆香和青草味[35]，只在五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配發(fā)酵的蛋腐乳中產(chǎn)生。6 組腐乳樣品中都檢測到了茴香腦，茴香腦帶有甜味，具有茴香的特殊香氣[36]。

2.3 發(fā)酵菌組合對總酸和氨基酸氮含量的影響

總酸含量是衡量蛋腐乳質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，蛋腐乳的酸度主要由發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸、游離氨基酸、游離脂肪酸等形成。從圖7和圖8可以看出，各個(gè)菌種發(fā)酵的蛋腐乳中，只有五通橋毛霉發(fā)酵的蛋腐乳總酸含量降低，由發(fā)酵38 d的0.5265 g/100 g 降到發(fā)酵73 d 的0.324 g/100 g，其余菌種發(fā)酵蛋腐乳的總酸均有所增加，但變化不大。相對于總酸含量而言，氨基酸態(tài)氮含量的變化很大，氨基酸態(tài)氮含量越高，氨基酸含量越高，蛋腐乳的鮮味越好[17，20]。與發(fā)酵38 d 相比，發(fā)酵73 d 時(shí)各個(gè)菌種發(fā)酵蛋腐乳的氨基酸態(tài)氮均有不同程度的增加，其中五通橋毛霉蛋腐乳的氨基酸態(tài)氮含量最高為1.002 g/100 g，說明五通橋毛霉蛋腐乳中氨基酸含量最高，五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳的氨基酸態(tài)氮含量次之（0.966 g/100 g），藤黃微球菌發(fā)酵蛋腐乳的氨基酸態(tài)氮含量最低（0.714 g/100 g）。蛋腐乳總酸含量均小于1.3 g/100 g，氨基酸態(tài)氮含量均大于0.42 g/100 g，符合中華人民共和國國內(nèi)貿(mào)易行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T10170-2007《腐乳》中腐乳成熟的理化要求。

圖7 不同發(fā)酵菌種的總酸和氨基酸態(tài)氮含量（發(fā)酵38 d）Fig.7 Total acid and amino acid nitrogen contents of different fermentation strains（fermentation for 38 d）

圖8 不同發(fā)酵菌種總酸和氨基酸態(tài)氮含量（發(fā)酵73 d）Fig.8 Total acid and amino acid nitrogen contents of different fermentation strains（fermentation for 73 d）

由表3可以看出，這6 組菌的總酸和氨基酸態(tài)氮含量的誤差較小。發(fā)酵38 d，同一菌種的總酸和氨基酸態(tài)氮含量之間具有顯著性差異（P＜0.05）；酵母復(fù)配蛋腐乳和單一菌種發(fā)酵腐乳總酸含量之間和氨基態(tài)氮含量之間沒有顯著性差異（P＞0.05），說明魯氏酵母菌對總酸和氨基酸態(tài)氮含量影響不大。

表3 不同發(fā)酵菌種總酸和氨基酸態(tài)氮含量Table 3 Contents of total acid and amino acid nitrogen in different fermentation strains

2.4 發(fā)酵菌組合對蛋腐乳質(zhì)構(gòu)的影響

根據(jù)氣質(zhì)數(shù)據(jù)和感官評(píng)價(jià)結(jié)果選擇五通橋毛霉蛋腐乳及五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析。由圖9可知，發(fā)酵過程中五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳的硬度一直低于五通橋毛霉蛋腐乳，可能是由于魯氏酵母影響了五通橋毛霉的包被作用，使得菌絲體對豆腐坯體的包裹度下降，蛋腐乳變得松軟易散，導(dǎo)致其硬度降低。五通橋毛霉蛋腐乳黏性的增長多于五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳，然而五通橋毛霉蛋腐乳彈性要比五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳降低的快且多，并且五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳的誤差比五通橋毛霉蛋腐乳大。硬度的誤差較大，黏性和彈性誤差較小，指標(biāo)一致性較高。

圖9 五通橋毛霉腐乳及五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳發(fā)酵100 d 的硬度變化Fig.9 Hardness changes of egg fermented bean curd produced by Mucor wutongqiao，Mucor wutongqiao and Saccharomyces rouxii mixed fermentation during 100 d fermentation

圖10 五通橋毛霉腐乳及五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳發(fā)酵100 d 的黏性變化Fig.10 Viscosity changes of egg fermented bean curd produced by Mucor wutongqiao，Mucor wutongqiao and Saccharomyces rouxii mixed fermentation during 100 d fermentation

2.5 發(fā)酵菌種及發(fā)酵時(shí)間對EC 含量的影響

氨基甲酸乙酯（EC）是廣泛存在于發(fā)酵食品中的一種2A 類致癌物[37]，EC 普遍存在于酒精飲料、發(fā)酵調(diào)味品、發(fā)酵乳中，尤其在黃酒、清酒、腐乳、醬油等亞洲傳統(tǒng)食品中的含量相對較高[38-39]。

2.5.1 發(fā)酵菌種對EC 含量的影響由圖12可以看出，發(fā)酵菌種不同，蛋腐乳中EC 含量差異很大。在發(fā)酵63 d 時(shí)，米根霉發(fā)酵蛋腐乳的EC含量最低（61.3 ng/g），五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配發(fā)酵蛋腐乳的EC 含量最高（111.6 ng/g）。有魯氏酵母菌參與發(fā)酵的蛋腐乳EC 含量普遍高于單一菌種發(fā)酵的蛋腐乳。

2.5.2 發(fā)酵時(shí)間對EC 含量的影響從圖13可以看出，在發(fā)酵100 d 過程中EC 含量逐漸升高，在100 d 時(shí)達(dá)到了95.8 ng/g。聯(lián)合國糧農(nóng)組織規(guī)定氨基甲酸乙酯含量不得超過20 μg/L[40]。加拿大、美國、捷克等國家分別對葡萄酒中氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)做出的限定，分別為30，15，30 μg/L[41]。以酒類EC 國際安全限量為參照[42]，五通橋毛霉蛋腐乳仍然是十分安全的。

圖11 五通橋毛霉腐乳及五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳發(fā)酵100 d 的彈性變化Fig.11 Elastic changes of egg fermented bean curd produced by Mucor wutongqiao，Mucor wutongqiao and Saccharomyces rouxii mixed fermentation during 100 d fermentation

圖12 不同菌種發(fā)酵蛋腐乳在發(fā)酵63 d 時(shí)EC 含量Fig.12 EC contents of egg fermented bean curd fermented by different strains on 63 d fermentation

圖13 不同發(fā)酵時(shí)間的五通橋毛霉蛋腐乳EC 含量的變化Fig.13 Changes of EC contents in egg fermented bean curd produced by Mucor wutongqiao at different fermentation times

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)1.2.4 節(jié)的方法對五通橋毛霉蛋腐乳發(fā)酵100 d 的樣品進(jìn)行GC-MS 檢測，與之前五通橋毛霉發(fā)酵100 d 樣品的GC-MS 結(jié)果進(jìn)行對比，分析兩者之間揮發(fā)性風(fēng)味成分的差別。

與五通橋毛霉蛋腐乳發(fā)酵100 d 的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相比，驗(yàn)證試驗(yàn)100 d 時(shí)，烴類物質(zhì)的種類和含量都有所降低，酯類物質(zhì)的種類和含量相差不大，都產(chǎn)生了棕櫚酸乙酯、丁二酸二乙酯、辛酸乙酯、十四酸乙酯這些風(fēng)味較好的酯類。驗(yàn)證試驗(yàn)100 d 樣品的感官評(píng)分為82.67 ±3.21，結(jié)合表2感官評(píng)價(jià)分析，A 與B 沒有顯著性差異且感官評(píng)價(jià)分值一致，仍然是所有蛋腐乳里分?jǐn)?shù)最高的。

表4 五通橋毛霉蛋腐乳發(fā)酵100 d 樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)百分含量對比Table 4 Comparison of percentage of volatile flavor compounds in egg fermented bean curd produced by Mucor wutongqiao after 100 d fermentation

（續(xù)表4）

3 結(jié)論

利用GC-MS 技術(shù)鑒定出不同發(fā)酵菌種和發(fā)酵不同階段的蛋腐乳樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類主要包括烴類、醛類、醇類、酸類、酯類、酮酚類和其它類化合物。其中苯甲醛、苯乙醛、辛醛、壬醛、苯乙醇、棕櫚酸乙酯、十四酸乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二乙酯和丁香酚是主要特征揮發(fā)性物質(zhì)。在蛋腐乳后酵過程中產(chǎn)生不愉悅風(fēng)味的物質(zhì)是苯甲醛、2-甲基丁酸和癸酸。通過GC-MS 分析和感官評(píng)價(jià)可以發(fā)現(xiàn)五通橋毛霉發(fā)酵蛋腐乳風(fēng)味最好，其次是五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配發(fā)酵蛋腐乳。對這6 種蛋腐乳進(jìn)行總酸和氨基酸態(tài)氮含量的測定，發(fā)現(xiàn)五通橋毛霉蛋腐乳的氨基酸態(tài)氮含量明顯高于其它蛋腐乳，品質(zhì)最好。根據(jù)質(zhì)構(gòu)測定結(jié)果，五通橋毛霉蛋腐乳及五通橋毛霉+魯氏酵母菌復(fù)配蛋腐乳之間的硬度、黏性和彈性相差不大。根據(jù)氨基甲酸乙酯含量的測定結(jié)果，五通橋毛霉蛋腐乳發(fā)酵100 d 過程中EC 含量逐漸升高，在100 d 時(shí)達(dá)到了95.8 ng/g，仍低于酒類EC 國際安全限量。綜合來看，選擇五通橋毛霉作為蛋腐乳前期發(fā)酵的菌種。