超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法快速辨識芪玉三龍湯化學(xué)成分

黃夢文, 吳 歡,2,3*, 于 偉, 王 影, 汪逢燦,張純純, 周龍生, 李澤庚,4

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心, 安徽 合肥 230038; 2. 中藥研究與開發(fā)安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012; 3. 中藥復(fù)方安徽省重點實驗室, 安徽 合肥 230012; 4. 安徽省教育廳中醫(yī)藥防治肺系重大疾病重點實驗室, 安徽 合肥 230038)

芪玉三龍湯(Qi-Yu-San-Long decoction, QYSLD)是由黃芪、玉竹、天龍、地龍、龍葵、白花蛇舌草、薏苡仁、澤漆、莪術(shù)、川貝母十味中藥組方而成,是臨床用于治療非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的名老中醫(yī)驗方[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[2-4]表明,QYSLD抑制NSCLC的作用可能與其調(diào)控PI3K/Akt/mTOR和Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子表達(dá)有關(guān)。雖然QYSLD能有效治療NSCLC,但其發(fā)揮抑制NSCLC作用的物質(zhì)基礎(chǔ)尚未明確。中藥(復(fù)方)中的復(fù)雜化學(xué)組分具有多靶點和協(xié)同效應(yīng)的治療作用特點,對這些復(fù)雜化學(xué)組分進(jìn)行解析是揭示中藥(復(fù)方)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)并對其進(jìn)行質(zhì)量控制的關(guān)鍵步驟。因此,有必要建立一種快速、可靠的分析方法全面表征QYSLD中的復(fù)雜化學(xué)成分。

近年來,具有高靈敏度、高分辨率的超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(UPLC-QTOF-MS)已廣泛用于中藥(復(fù)方)化學(xué)成分的分離和結(jié)構(gòu)表征中[5,6]。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集主要分為數(shù)據(jù)依賴性采集和數(shù)據(jù)非依賴性采集(DIA),其中DIA技術(shù)無需對樣品中的化合物作預(yù)選擇,而是直接采集經(jīng)色譜柱分離的所有化合物的質(zhì)譜信息[7,8]。作為典型的DIA技術(shù)之一,全信息串聯(lián)質(zhì)譜(MSE)是一種能夠?qū)崿F(xiàn)“低碰撞能”和“高碰撞能”交替掃描以獲得高精確的母離子及碎片離子信息,并能夠依據(jù)母離子和碎片離子的色譜行為進(jìn)行關(guān)聯(lián)歸屬的數(shù)據(jù)采集方法[9]。由于中藥(復(fù)方)眾多成分之間含量差異大、結(jié)構(gòu)類型和理化性質(zhì)多樣,傳統(tǒng)人工解譜費時耗力;在存在基質(zhì)背景信號干擾的情況下,質(zhì)譜響應(yīng)信號低或含量很少的成分在MSE模式中的信號貢獻(xiàn)較小,這些成分在分析鑒定過程中,常易產(chǎn)生漏判。因此,依托于天然產(chǎn)物后處理篩查(UNIFI)平臺的靶向篩查方法便成了很好的補(bǔ)充。UNIFI平臺可極大減輕以往質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析的工作量,能對MSE低能量下采集的數(shù)據(jù)自動進(jìn)行離子流提取和分子式確定,并與自建庫中成分作靶向篩查,然后根據(jù)MSE高能量下的碎片信息推導(dǎo)化合物裂解途徑[10,11]，最后在預(yù)設(shè)的過濾條件下輸出識別成分的結(jié)構(gòu)信息,對中藥及復(fù)方中的化學(xué)成分進(jìn)行快速識別。

本研究在前人研究的基礎(chǔ)上構(gòu)建了QYSLD化學(xué)成分庫,并將其導(dǎo)入UNIFI平臺;然后利用UPLC-QTOF-MS的DIA技術(shù)采集樣品信息,再結(jié)合靶向篩查方法快速辨識QYSLD的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，共辨識出166種化合物，并通過對照品對其中16種主要化學(xué)成分予以確認(rèn)。該研究將為下一步研究QYSLD中發(fā)揮抑制NSCLC的藥效成分奠定基礎(chǔ),同時也為其他中藥(復(fù)方)成分分析提供方法參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Acquity I Class型UPLC-Xevo G2-XS型QTOF-MS,配有UNIFI平臺(美國Waters公司), KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司), RE-3000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠), Milli-Q超純水凈化系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

QYSLD(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑)。對照品：黃芪甲苷(批號:MUST-19091308,純度99.8%)、黃芪皂苷I(批號:MUST-20042906,純度99.1%)、黃芪皂苷II(批號:MUST-20051008,純度99.8%)、毛蕊異黃酮(批號:MUST-19120901,純度99.8%)、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷(批號:MUST-200920,純度99.8%)、澳洲茄堿(批號:MUST-20042004,純度99.6%)、澳洲茄邊堿(批號:MUST-19102621,純度99.4%)、對香豆酸(批號:MUST-20050603,純度99.9%)購于成都曼思特生物科技有限公司,貝母辛(批號:B20082,純度98%)、亞油酸(批號:B21421,純度98%)、鳥嘌呤(批號:B20906,純度98%)、次黃嘌呤(批號:B20211,純度98%)購于上海源葉生物科技有限公司,蘆丁(批號:100080-201409,純度99.9%)、精氨酸(批號:140685-201707,純度99.9%)、脯氨酸(批號:140677-201507,純度99.9%)、硬脂酸(批號:190032-201001,純度99.9%)購于中國食品藥品檢定研究院。甲酸(美國Sigma-Aldrich公司),甲醇和乙腈(德國Merck公司)。

1.2 混合對照品溶液的制備

精密稱取16種對照品適量,用甲醇溶解定容,配制成對照品儲備液。取各對照品儲備液10 μL,用甲醇稀釋定容，配制成各成分質(zhì)量濃度約為10 μg/mL的混合對照品溶液,過0.22 μm的微孔濾膜。

1.3 樣品前處理

QYSLD樣品溶液的制備:稱取黃芪30 g、玉竹10 g、天龍6 g、地龍6 g、龍葵20 g、白花蛇舌草20 g、薏苡仁20 g、澤漆6 g、莪術(shù)10 g、川貝母6 g。加入1 340 mL水,浸泡1 h,武火煮沸后文火煎1.5 h,濾過;殘渣加入1 072 mL水,武火煮沸,文火煎40 min,濾過;合并兩次煎煮液濃縮至1 g/mL。取2.5 mL濃縮液與7.5 mL 95%乙醇混合,渦旋混勻,避光放置12 h,取上清液減壓離心揮干,殘渣加甲醇振搖溶解,定容至50 mL,搖勻,用0.22 μm微孔濾膜過濾后裝入進(jìn)樣小瓶。

空白溶液的制備:除不加藥物外,其他步驟與QYSLD樣品溶液相同。

1.4 液相條件

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm),柱溫:35 ℃,流動相:A為0.1%(v/v)甲酸水溶液、B為乙腈,流速:0.2 mL/min。梯度洗脫程序:0～7 min, 3%B～15%B; 7～11 min, 15%B; 11～21 min, 15%B～25%B; 21～26 min, 25%B～35%B; 26～36 min, 35%B～55%B; 36～45 min, 55%B～73%B; 45～51 min, 73%B～85%B; 51～56 min, 85%B～95%B; 56～61 min, 95%B; 61～62 min, 95%B～3%B; 62～65 min, 3%B。進(jìn)樣量:2 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離(ESI)源,分別采用正、負(fù)離子模式檢測,實時校正液為亮氨酸腦啡肽。離子源溫度120 ℃;掃描范圍為m/z50～1 200,毛細(xì)管電壓3.0 kV(正離子模式)、2.5 kV(負(fù)離子模式);錐孔電壓40 kV;脫溶劑溫度350 ℃;脫溶劑氣體流速:600 L/h。MSE低碰撞能量為6 eV, MSE高碰撞能量為20～35 eV。

1.6 QYSLD化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的建立

通過檢索CNKI、Medline、PubMed、Chemicalbook和ChemSpider等數(shù)據(jù)庫,收集、整理QYSLD中十味中藥所含化學(xué)成分的信息(包括351種化學(xué)成分名稱,分子式及結(jié)構(gòu)式),結(jié)構(gòu)式使用ChemDraw繪制,文件格式保存為mol格式。

1.7 數(shù)據(jù)分析

將MSE低碰撞能量(獲得準(zhǔn)分子離子或加合離子精確質(zhì)量數(shù))、高碰撞能量(設(shè)置碰撞能量區(qū)間,獲得特征碎片離子、中性丟失等二級質(zhì)譜信息)所采集到的QYSLD樣品溶液、空白溶液質(zhì)譜信息和1.6節(jié)下建立的QYSLD化學(xué)成分庫均導(dǎo)入UNIFI平臺。UNIFI閾值設(shè)定:二維檢測最小峰面積為200; 三維檢測的低、高碰撞能量下峰強(qiáng)度分別設(shè)置為500和150;保留時間偏差為±0.1 min;精確質(zhì)量數(shù)偏差為±5×10-6;正離子模式下,選擇[M+H]+和[M+Na]+為準(zhǔn)分子離子或加合離子;負(fù)離子模式下,選擇[M-H]-和[M+HCOO]-。在上述閾值的過濾條件下對待測成分的離子峰進(jìn)行自動辨識、校正并輸出結(jié)構(gòu)信息。然后結(jié)合準(zhǔn)分子離子、碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)及部分對照品對化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn)(具體結(jié)果見表1)。

2 結(jié)果與討論

2.1 QYSLD化學(xué)成分分析

利用UPLC-QTOF-MS中的MSE模式采集空白溶液、QYSLD樣品溶液及混合對照品溶液在正、負(fù)離子模式下的質(zhì)譜信息,得到各自的總離子流色譜圖(見圖1)。根據(jù)1.7節(jié)下的數(shù)據(jù)分析方法對QYSLD中的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析,共識別出166種化合物。其中皂苷類22種,生物堿類13種,黃酮類27種,萜類32種,氨基酸類20種,苯丙素類16種,有機(jī)酸類9種,甾醇類6種,蒽醌類6種,其他類15種。通過對照品確認(rèn)了其中16種成分,具體結(jié)果見表1。

2.2 各類化合物的鑒定與分析

2.2.1皂苷類

多數(shù)皂苷類成分至少含有1個糖鏈,在高碰撞能量下,其主要的裂解模式為糖基連續(xù)性丟失[33]。檢測到的化合物中有15種甾體皂苷類成分和7種三萜皂苷類成分,主要分布于黃芪和玉竹中。以化合物125(表1中序號,下同)為例進(jìn)行解析,低碰撞能量下,檢測到化合物125(tR=29.11 min)加合離子m/z829.462 8 [M+HCOO]-,高碰撞能量下接連損失葡萄糖基(Glc, 162 Da)和木糖基(Xyl, 132 Da),產(chǎn)生m/z621.402 7 [M-H-Glc]-和m/z489.356 4 [M-H-Glc-Xyl]-碎片離子,隨后C-17支鏈斷裂,再脫去H2O(18 Da)產(chǎn)生m/z329.233 9 [M-H-Glc-Xyl-C8H16O3]-碎片離子,m/z329.233 9的碎片離子繼續(xù)丟失CH3(15 Da)、O(16 Da),產(chǎn)生m/z283.134 5 [M-H-Glc-Xyl-C8H16O3-C2H6O]-碎片離子。經(jīng)UNIFI平臺靶向篩查,結(jié)合對照品驗證,確定該化合物為黃芪甲苷,裂解途徑如圖2所示。其他皂苷類成分以類似方式進(jìn)行解析。

2.2.2生物堿類

生物堿類化合物主要來源于QYSLD中龍葵和川貝母。龍葵中的生物堿大多數(shù)為糖苷生物堿。以圖1中化合物82(tR=22.29 min)為例,在正離子模式、低碰撞能量下,檢測到準(zhǔn)分子離子m/z884.501 5 [M+H]+,在高碰撞能量下連續(xù)脫去鼠李糖基(Rha, 146 Da)、葡萄糖基(Glc, 162 Da)、半乳糖基(Gal, 162 Da),形成m/z為738.446 4、576.391 5和414.337 3的碎片離子;通過N規(guī)則,可判斷m/z414.337 3的苷元離子為含1個N原子的生物堿[34],推測該苷元為澳洲茄胺;此外,澳洲茄胺E環(huán)斷裂產(chǎn)生m/z271.205 9和m/z253.194 9的特征碎片離子。由此推測化合物82是以澳洲茄胺為苷元,以Rha、Glc、Gal為糖基的澳洲茄堿,這一結(jié)果經(jīng)對照品的tR和MSE數(shù)據(jù)予以驗證,具體裂解信息見圖3。

其他糖苷生物堿的裂解方式多與澳洲茄堿類似,在正離子模式下產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+或[M+Na]+,糖鏈中的糖基連續(xù)性丟失形成苷元,苷元環(huán)在高碰撞能量下斷裂產(chǎn)生特征碎片離子[34,35]。根據(jù)此裂解規(guī)律,結(jié)合UNIFI靶向篩查結(jié)果,推測化合物88、89和95分別為α-茄堿、澳洲茄邊堿和澳茄新堿。

川貝母生物堿在正離子模式下有準(zhǔn)分子離子[M+H]+,在高碰撞能量下常脫去一分子H2O(18 Da)產(chǎn)生碎片離子。以化合物62(tR=15.83 min)為例,[M+H]+為m/z428.318 1的準(zhǔn)分子離子,脫H2O產(chǎn)生m/z410.303 1的碎片離子,經(jīng)對照品比對后,鑒定該化合物為貝母辛。另推測化合物55、68和75分別為貝母素甲、貝母素乙和西貝母堿[36]。

圖 1 (a)空白溶液、(b)QYSLD樣品及(c)16種混合對照品的總離子流色譜圖Fig. 1 TIC chromatograms of (a) blank solution, (b) QYSLD sample and (c) 16 mixed references

圖 2 ESI-模式下黃芪甲苷的(a)質(zhì)譜圖及(b)裂解途徑Fig. 2 (a) Mass spectrum and (b) fragmentation pathway of astragaloside IV in ESI- mode

圖 3 ESI+模式下澳洲茄堿的(a)質(zhì)譜圖及(b)裂解途徑Fig. 3 (a) Mass spectrum and (b) fragmentation pathway of solasonine in ESI+mode

2.2.3黃酮類

黃芪、玉竹、白花蛇舌草和澤漆均含有黃酮類化合物。以化合物52為例,在負(fù)離子模式下產(chǎn)生加合離子峰[M+HCOO]-,m/z為491.118 9,高碰撞能量下產(chǎn)生m/z283.058 8 [M-H-Glc]-、m/z268.036 5 [M-H-Glc-CH3]-、m/z239.030 8 [M-H-Glc-CH3-CHO]-、m/z211.037 1 [M-H-Glc-CH3-CHO-CO]-、m/z195.041 5 [M-H-Glc-CH3-CHO-CO-O]-、m/z135.005 3 [M-H-Glc-CH3-CHO-CO-C6H4]-的碎片離子,推測其為毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷[17],具體裂解信息見圖4。由文獻(xiàn)[37]可知,黃酮苷在負(fù)離子模式下信號較強(qiáng),在高碰撞能量下易脫去糖基,其苷元進(jìn)一步丟失H2O(18 Da)、CH3(15 Da)產(chǎn)生特征碎片離子。依據(jù)上述裂解規(guī)律,結(jié)合UNIFI平臺靶向篩查結(jié)果,推測化合物48、79、118分別為蘆丁、毛蕊異黃酮、芒柄花素[23](具體質(zhì)譜信息見表1),其中化合物48和79經(jīng)對照品予以確認(rèn)。

圖 4 ESI-模式下毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷的(a)質(zhì)譜圖及(b)裂解途徑Fig. 4 (a) Mass spectrum and (b) fragmentation pathway of calycosin 7-O-β-D-glucopyranoside in ESI-mode

2.2.4萜類

萜類化合物共識別出32種,其中17種屬于倍半萜類(來源于莪術(shù)), 15種屬于環(huán)烯醚萜類(來源于白花蛇舌草)。環(huán)烯醚萜類C-1位常為羥基,且多與糖基結(jié)合成苷。環(huán)烯醚萜苷類成分裂解所需碰撞能量較小,易產(chǎn)生碎片離子[22],典型特征是吡喃環(huán)上易發(fā)生Glc(162 Da)的中性丟失,苷元母核結(jié)構(gòu)上常見H2O(18 Da)、CO(28 Da)和CO2(44 Da)的后續(xù)丟失。如化合物65,在低、高碰撞能量下均可觀察到準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-,m/z為549.160 8,以及特征碎片離子m/z369.094 2 [M-H-Glc-H2O]-、m/z225.110 7 [M-H-Glc-H2O-coumaroyl]-、m/z206.969 6 [M-H-Glc-H2O-coumaroyl-H2O]-、m/z178.974 7 [M-H-Glc-H2O-coumaroyl-H2O-CO]-、m/z134.865 0 [M-H-Glc-H2O-coumaroyl-H2O-CO-CO2]-,推測該化合物為反式-6-O-對香豆酰雞屎藤苷甲酯?；衔?37屬于倍半萜類,在低碰撞能量下觀察到準(zhǔn)分子離子是m/z247.133 6 [M+H]+,計算分子式為C15H18O3,在高碰撞能量下產(chǎn)生m/z229.122 3 [M+H-H2O]+、m/z214.098 4 [M+H-H2O-CH3]+、m/z199.075 2 [M+H-H2O-2CH3]+的碎片離子,推測該化合物為姜黃醇酮[38]。

2.2.5苯丙素類

共鑒別出16種苯丙素類化合物。以化合物42為例,其在低碰撞能量下準(zhǔn)分子離子為m/z163.038 8 [M-H]-,在高碰撞能量下脫去CO2(44 Da)、C2H6(30 Da)產(chǎn)生m/z119.049 2和m/z89.038 5的碎片離子,經(jīng)對照品確認(rèn)該化合物為對香豆酸。依據(jù)此裂解規(guī)律推導(dǎo)化合物36、43、66和101可能是咖啡酸、4-羥基香豆素、香豆素和肉桂酸。

2.2.6氨基酸類

此類化合物主要存在于天龍和地龍中。由文獻(xiàn)[12]可知,在正離子模式下,氨基酸類化合物的裂解規(guī)律主要是脫去NH3(17 Da)和CO2(44 Da)。以化合物2(tR=1.10 min)為例,低碰撞能量下產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+,m/z為175.119 2,通過Masslynx軟件推導(dǎo)其化學(xué)式為C6H14N4O2,高碰撞能量下接連丟失NH3和CO2,形成特征碎片離子m/z158.090 4 [M+H-NH3]+和m/z114.105 1 [M+H-NH3-CO2]+,經(jīng)對照品確認(rèn)該化合物為精氨酸。根據(jù)裂解方式及對照品的質(zhì)譜信息指認(rèn)化合物4、5和15分別為脯氨酸、次黃嘌呤和鳥嘌呤。

2.2.7有機(jī)酸類

有機(jī)酸類化合物裂解規(guī)律一般是脫去H2O(18 Da)、CO2(44 Da)和CH3(15 Da)等小分子基團(tuán)。化合物162準(zhǔn)分子離子為m/z283.261 9 [M-H]-,高碰撞能量下產(chǎn)生m/z253.218 6 [M-H-2CH3]-、m/z239.294 8 [M-H-CO2]-的碎片離子,符合上述裂解規(guī)律,該化合物為硬脂酸并經(jīng)對照品驗證。依據(jù)上述有機(jī)酸裂解規(guī)律,結(jié)合UNIFI平臺靶向篩查結(jié)果,化合物159、160和161依次推測為亞油酸、油酸和棕櫚酸。

2.2.8其他類

其他類主要是QYSLD中含量種類較少、響應(yīng)值較小的化合物。通過UNIFI靶向篩查,并結(jié)合文獻(xiàn)報道[13,15,18-21],共推測出15種化合物(依次為化合物18、25、27、37、38、54、107、120、140、143、147～151),具體質(zhì)譜信息見表1。

3 結(jié)論

本研究運用UPLC-QTOF-MS的DIA技術(shù)(MSE模式)結(jié)合靶向篩查方法對QYSLD中復(fù)雜的化學(xué)成分進(jìn)行快速、全面的分析,結(jié)果從QYSLD中共識別出166個化學(xué)成分,其中16個成分經(jīng)過對照品驗證。本研究所建立的方法能夠快速、可靠的表征QYSLD中的化學(xué)成分,為該復(fù)方的藥效物質(zhì)及質(zhì)量控制研究奠定了基礎(chǔ),同時也為其他中藥(復(fù)方)所含化學(xué)成分的快速解析提供方法參考。但UNIFI平臺靶向篩查方法也有不足,如無法區(qū)分準(zhǔn)分子離子和二級碎片離子均相似的同分異構(gòu)體。因此,需通過tR、精確準(zhǔn)分子離子質(zhì)量、碎片離子質(zhì)量、文獻(xiàn)信息及對照品的色譜、質(zhì)譜信息等對UNIFI平臺靶向篩查的可疑化合物進(jìn)行復(fù)核,以排除假陽性結(jié)果。