高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定發(fā)酵液中噴司他丁和2′-氨基-2′-脫氧腺苷

趙敏敏, 張宏宇*, 婁婷婷, 趙孔祥, 王素英

(1. 天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院, 天津市食品生物技術(shù)重點實驗室,天津 300134; 2. 天津海關(guān)動植物與食品檢測中心, 天津 300461)

噴司他丁(pentostatin)是一種嘌呤核苷類抗生素,在臨床上主要治療急性T細胞型淋巴細胞白血病[1,2]、毛細胞白血病[3,4]及慢性淋巴細胞白血病[5,6]。噴司他丁在人體中主要作為腺苷脫氨酶抑制劑[7-9],可明顯抑制腺苷脫氨酶的活性,使癌變細胞中的脫氧腺苷大量積累,抑制癌細胞的核酸合成,從而起到治療作用。1974年,Peter等[10,11]從鏈霉菌(Streptomycesantiboticus)的發(fā)酵液中首次分離到噴司他丁,美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)于1991年正式批準其作為注射劑上市,藥品名為Nipent[12]。目前,主要通過微生物發(fā)酵法獲得噴司他丁,而針對發(fā)酵液中噴司他丁的檢測方法主要包括高效液相色譜法(HPLC)[13-15]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[16-19]。李曉輝[15]采用HPLC的方法,以乙酸銨-甲醇作為流動相,使用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)對發(fā)酵液中噴司他丁的檢測條件進行了優(yōu)化,但整個洗脫程序耗時較長(25 min),噴司他丁保留時間為10.1 min,不利于快速檢測,而且檢測過程伴隨著雜質(zhì)的干擾,分離度低,需要進一步優(yōu)化。楊鵬等[16]采用HPLC-MS/MS,以乙酸銨-甲醇-乙腈為流動相,使用Hypersil ODS2色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm),使得噴司他丁保留時間縮短到6 min,但使用該方法連續(xù)大量測樣后,噴司他丁保留時間出現(xiàn)偏移,峰形變形,色譜柱柱效嚴重降低。巫攀等[17-19]應(yīng)用HPLC-MS/MS對噴司他丁進行檢測,選擇含0.15%三氟乙酸的甲醇為流動相，采用Shimadzu Inertsil ODS-3反相色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)進行分離,但分析時間仍需30 min以上。以上方法均沒有實現(xiàn)噴司他丁的高效檢測。隨著HPLC-MS/MS技術(shù)的愈加成熟,近年來在食品[20,21]、藥品[22,23]等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用,相較HPLC技術(shù),其分離速度、靈敏度等各方面都有顯著提升?；诖?本研究主要通過優(yōu)化色譜柱、流動相及洗脫程序,充分發(fā)揮HPLC-MS/MS的檢測優(yōu)勢,以縮短噴司他丁的檢測時間,增強其分離度和檢測精確度,同時實現(xiàn)了噴司他丁伴生產(chǎn)物2′-氨基-2′-脫氧腺苷含量的準確檢測。該方法快速、靈敏,準確度高,重復(fù)性好,為從微生物發(fā)酵液中檢測噴司他丁和2′-氨基-2′-脫氧腺苷提供了方法學基礎(chǔ)和借鑒。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Transcend高效液相色譜-串聯(lián)TSQ Quantum Ultra質(zhì)譜裝置(美國Thermo Fisher公司); Milli-Q超純水制備儀(美國Millipore公司);分析天平(瑞士Precisa公司); H1850R高速冷凍離心機(長沙湘儀儀器公司);漩渦振蕩器(海門儀器制造公司)。

噴司他丁標準品(純度≥98%)、2′-氨基-2′-脫氧腺苷標準品(純度≥98%)、甲酸銨(純度≥99%)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);甲醇(色譜純,瑞典Oceanpak公司);本實驗所有用水均為Milli-Q超純水。

1.2 標準溶液的配制

分別精確稱取0.251 0 mg噴司他丁和0.253 0 mg 2′-氨基-2′-脫氧腺苷標準品,用超純水溶解并定容至50 mL,配制成5 mg/L的標準儲備液,分裝至1.5 mL離心管中,于-80 ℃保存。準確吸取適量噴司他丁和2′-氨基-2′-脫氧腺標準儲備液,配制成500 μg/L的混合標準溶液,于-80 ℃保存,備用。

1.3 樣品前處理

取5 mL發(fā)酵液,于4 ℃以10 000 r/min離心10 min,取100 μL上清液,用水稀釋500倍,經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾后,進行HPLC-MS/MS檢測。

1.4 色譜條件

色譜柱:保護柱(5 mm×2.1 mm, 5 μm,美國Waters公司), Atlantis?T3液相色譜柱(100 mm×2.1 mm, 5 μm,美國Waters公司);柱溫:25 ℃;流動相A: 10 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸),流動相B:甲醇(含0.02%甲酸);流速:0.3 mL/min;進樣體積:10 μL。梯度洗脫程序見表1。

表 1 噴司他丁和2′-氨基-2′-脫氧腺苷的梯度洗脫程序

1.5 質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧離子(ESI)源;離子源溫度:350 ℃;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)、正離子掃描模式;噴霧電壓:3.5 kV;輔助氣壓力:103.4 kPa;鞘氣壓力:310.3 kPa;毛細管溫度:300 ℃。母離子、定量離子、離子聚焦透鏡電壓(tube lens offset)及碰撞能(CE)見表2。

表 2 噴司他丁和2′-氨基-2′-脫氧腺苷的監(jiān)測離子對、離子聚焦透鏡電壓和碰撞能

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實驗采用注射泵直接進樣的方式將5 mg/L的2種標準品依次注入質(zhì)譜儀器中,分別在ESI+和ESI-模式下,進行全掃描,從而確定合適的電離方式,并選擇響應(yīng)較高的離子作為母離子。結(jié)果顯示,2種標準品均在ESI+模式下響應(yīng)值較高。然后對其離子聚焦透鏡電壓進行優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上,對各母離子進行子離子掃描,選擇質(zhì)譜豐度響應(yīng)值高且信號穩(wěn)定的碎片離子作為定量離子,隨后對其碰撞能進行優(yōu)化,以獲得更具特異性的質(zhì)譜方法。優(yōu)化后得到的噴司他丁和2′-氨基-2′-脫氧腺苷的質(zhì)譜參數(shù)見表2。儀器自動優(yōu)化功能得到的其他質(zhì)譜參數(shù)詳見1.5節(jié)。

2.2 色譜柱的選擇

本實驗比較了Waters公司的Atlantis?dC18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 5 μm)、Atlantis?C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)和Atlantis?T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 5 μm)。在相同的流動相洗脫條件下,觀察標準品的峰形和出峰時間。結(jié)果顯示,當選擇Atlantis?C18色譜柱檢測時,噴司他丁保留時間在6 min左右,半峰寬略寬,而且隨著長時間連續(xù)測樣后,保留時間出現(xiàn)一定偏移,有嚴重的拖尾現(xiàn)象,柱效明顯降低;當選擇Atlantis?dC18色譜柱和Atlantis?T3色譜柱時,噴司他丁在保留時間上相差不大,均在2 min左右,但Atlantis?T3色譜柱在保留和分離強極性化合物上較Atlantis?dC18色譜柱更加優(yōu)越,而且pH值耐受范圍更寬?？紤]到發(fā)酵液中基質(zhì)的復(fù)雜性,以及實現(xiàn)快速檢測的目的,實驗最終選用Atlantis?T3色譜柱,并且添加了Waters公司對應(yīng)的保護柱(5 mm×2.1 mm, 5 μm)以更好地維護色譜柱柱效及壽命。

2.3 流動相的選擇

本研究在選用Atlantis dC18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 5 μm)的條件下,分別考察了以10 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)-甲醇(含0.02%甲酸)、10 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)-乙腈-甲醇(含0.02%甲酸)作為流動相時,噴司他丁和2′-氨基-2′-脫氧腺苷的保留時間、峰形和響應(yīng)強度。結(jié)果顯示,當選擇10 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)-乙腈-甲醇(含0.02%甲酸)為流動相時,噴司他丁和2′-氨基-2′-脫氧腺苷的峰形不對稱,分離度差,均有嚴重的拖尾現(xiàn)象(見圖1a)。當選擇10 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)-甲醇(含0.02%甲酸)為流動相時,噴司他丁和2′-氨基-2′-脫氧腺可與干擾峰分開,峰寬較小,峰形更好(見圖1b)。因此,實驗選擇10 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)-甲醇(含0.02%甲酸)作為流動相。

圖 1 不同色譜條件下噴司他丁和2′-氨基-2′-脫氧腺苷混合標準溶液的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the pentostatin and 2′-amino- 2′-deoxyadenosine in mixed standard solutions using the different chromatographic conditions Mobile phase: (a) 10 mmol/L ammonium formate (0.1% formic acid)-acetonitrile-methanol (0.02% formic acid); (b, c) 10 mmol/L ammonium formate (0.1% formic acid)-methanol (0.02% formic acid). Column: (a, b) Atlantis? dC18 column (150 mm×2.1 mm, 5 μm); (c) Atlantis? T3 column (100 mm×2.1 mm, 5 μm).

基于Atlantis?T3色譜柱在保留和分離強極性化合物上的優(yōu)勢,采用Atlantis?T3色譜柱和優(yōu)化后的流動相10 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)-甲醇(含0.02%甲酸),對5.0 μg/L的混合標準溶液進行HPLC-MS/MS測定。結(jié)果顯示,噴司他丁和2′-氨基-2′-脫氧腺苷均被有效分離,出峰時間穩(wěn)定,且響應(yīng)值與峰形良好(見圖1c)。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(ME)是指樣品中除分析物以外的組分對分析過程存在一定的干擾,從而影響分析結(jié)果的準確性。本實驗首先采用1.3節(jié)樣品前處理方法制備空白基質(zhì)溶液,然后分別以超純水和空白基質(zhì)溶液為溶劑,配制質(zhì)量濃度為100 μg/L的噴司他丁和2-氨基-2-脫氧腺苷混合標準溶液,每個樣品各6份,進行HPLC-MS/MS檢測,以考察本方法的基質(zhì)效應(yīng)(基質(zhì)效應(yīng)=基質(zhì)標準溶液中目標物含量/溶劑標準溶液中目標物含量×100%)[24]。

研究表明,噴司他丁和2′-氨基-2′-脫氧腺苷的基質(zhì)效應(yīng)分別為103.65%(RSD為2.01%)和107.72%(RSD為2.14%),發(fā)酵液中的其他組分會引起一定的基質(zhì)增強現(xiàn)象,但總體上基質(zhì)影響較小,比值均接近100%,說明本方法可有效避免基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.5 方法學考察

2.5.1線性關(guān)系、檢出限和定量限

準確吸取500 μg/L噴司他丁和2′-氨基-2′-脫氧腺苷標準儲備液,將其配制成1.0、5.0、10、25、50、100、200和250 μg/L的混合標準溶液。在優(yōu)化后的色譜和質(zhì)譜條件下制作標準曲線,其中,縱坐標是噴司他丁和2′-氨基-2′-脫氧腺苷的峰面積(y),橫坐標是與之相對應(yīng)的質(zhì)量濃度(x, μg/L)。結(jié)果顯示,2種化合物在1.0～250 μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性,相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99。將10 μg/L的混合標準溶液重復(fù)進樣8次,得出峰面積的相對標準偏差(RSD)為6.51%～8.35%(見表3)。

表 3 噴司他丁和2′-氨基-2′-脫氧腺苷的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

本實驗分別以3倍和10倍信噪比(S/N)的響應(yīng)值作為噴司他丁和2′-氨基-2′-脫氧腺苷的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。檢測結(jié)果表明,噴司他丁和2′-氨基-2′-脫氧腺苷的檢出限為0.003～0.060 μg/L,定量限為0.010～0.200 μg/L。

2.5.2準確度及精密度

為了驗證該方法的準確度和精密度,綜合考慮標準曲線的線性范圍和實際檢測中噴司他丁和2′-氨基-2′-脫氧腺苷的含量范圍,向發(fā)酵液樣品中添加了3個水平(1.0、5.0和25 μg/L)的混合標準溶液,進行加標回收率試驗,每個加標水平做6次重復(fù)試驗,結(jié)果見表4。噴司他丁和2′-氨基-2′-脫氧腺苷的加標回收率分別為97.94%～104.46%和89.96%～107.21%。表明該方法重復(fù)性良好,準確度可達到分析要求。

表 4 發(fā)酵液樣品中噴司他丁和2′-氨基-2′-脫氧腺苷的加標回收率和相對標準偏差(n=6)

2.6 實際樣品檢測

從本實驗室中隨機抽取一株產(chǎn)噴司他丁的突變株,搖瓶發(fā)酵后,按照1.3節(jié)前處理方法處理發(fā)酵液,利用所建立的分析方法對發(fā)酵液進行檢測。得出該突變株噴司他丁的產(chǎn)量為71.32 mg/L, 2′-氨基-2′-脫氧腺苷的產(chǎn)量為168.60 mg/L(見圖2)。從實際樣品的色譜圖中可明顯看出,檢測的化合物得到了高效分離,響應(yīng)高,峰形較好。

圖 2 實際樣品中噴司他丁(71.32 mg/L)和2′-氨基-2′-脫氧腺苷(168.60 mg/L)的色譜圖Fig. 2 Chromatogram of the pentostatin (71.32 mg/L) and 2′-amino-2′-deoxyadenosine (168.60 mg/L) in actual sample

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測發(fā)酵液中噴司他丁和2′-氨基-2′-脫氧腺苷的分析方法,并進行了一系列的方法學驗證。該方法可操作性強，穩(wěn)定性高，檢測快速,極大地縮短了上機檢測時間,有效避免了基質(zhì)效應(yīng)對目標化合物的影響,并且為其他發(fā)酵液或相似基質(zhì)中噴司他丁和2′-氨基-2′-脫氧腺苷的定性和定量檢測提供了借鑒。