高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定賀蘭山東麓干紅葡萄酒中的七種酚類物質(zhì)

王燕，李德美*，孫智文，王宗義

1(北京農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京，102206)2(農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，102206)

葡萄酒中酚類物質(zhì)主要分為類黃酮類和非類黃酮類。類黃酮類主要包括黃酮醇類、黃烷醇類、花青素及其衍生物等；非類黃酮類主要是酚酸類化合物，包括羥基肉桂酸衍生物、羥基苯甲酸衍生物、芪類和一些揮發(fā)性酚等[1]。葡萄酒中酚類物質(zhì)主要來(lái)源于果實(shí)和果梗[2]，還來(lái)源于發(fā)酵或陳年過(guò)程中使用或添加的橡木制品[3]，以及發(fā)酵過(guò)程中微生物的代謝產(chǎn)物[4]。酚類物質(zhì)影響葡萄酒的顏色、香氣和口感[5-6]，是紅葡萄酒風(fēng)格和品質(zhì)的重要指標(biāo)。黃烷-3-醇類單體[7]是黃烷醇類的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，葡萄酒的苦味主要與黃烷-3-醇單體的含量有關(guān)，單體的收斂性比寡聚物低[8]。原花青素屬于原花色素類化合物，由黃烷-3-醇和黃烷-3,4-二醇聚合形成的縮合單寧[9](原花色素)是葡萄酒收斂性(澀感)的主要原因[10]，對(duì)葡萄酒的苦味也有影響[11]，天然形成的原花青素主要以B型為主，葡萄果皮中原花青素二聚體B1的濃度最高。大分子縮合單寧對(duì)口味幾乎沒(méi)有什么影響[12]。氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[13]、液相色譜[14]以及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[15-19]能定性分析葡萄酒中酚類物質(zhì)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)用色譜法分析酚類物質(zhì)的研究已經(jīng)比較廣泛，但是對(duì)與葡萄酒苦澀感相關(guān)的黃烷-3-醇類單體和二聚體酚類物質(zhì)的定性定量研究較少。故本實(shí)驗(yàn)探討了對(duì)葡萄酒苦澀味貢獻(xiàn)比較大的5種黃烷-3-醇單體和原花青素B1、原花青素B2兩種二聚體的定性定量方法。

本研究以寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)的5個(gè)子產(chǎn)區(qū)(石嘴山市、銀川市賀蘭縣、銀川市西夏區(qū)、銀川市永寧縣、吳忠市)赤霞珠干紅葡萄酒為研究對(duì)象，采用液-液萃取對(duì)酒樣進(jìn)行前處理，保留被檢組分的同時(shí)盡量消除其他物質(zhì)的干擾，減小基質(zhì)效應(yīng)，通過(guò)HPLC分析研究了影響葡萄酒苦澀感的7種酚類物質(zhì)，所建立的方法成本低、檢測(cè)時(shí)間短且各物質(zhì)分離度好，為深入研究寧夏賀蘭山東麓葡萄酒的風(fēng)味物質(zhì)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒樣：2016年寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)17款赤霞珠干紅葡萄酒，酒樣取自5個(gè)葡萄酒產(chǎn)區(qū)的17個(gè)葡萄酒莊。

試劑：乙酸(色譜純)、乙腈(色譜純)、乙酸乙酯(分析純)。

標(biāo)準(zhǔn)品：兒茶素(catechin，C)、表兒茶素(epicatechin，EC)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(epicatechin gallate，EcG)、表沒(méi)食子兒茶素(epigallocatechin，EgC)、沒(méi)食子兒茶素(gallocatechin，GC)、原花青素B1(procyanidin B1，PC B1)、原花青素B2(procyanidin B2，PC B2)，純度HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2XZ(S)-2型旋片式真空泵，上海德英真空照明設(shè)備有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Shimadzu LC-20AD液相色譜儀(LC-20AD色譜泵、SPD-M20A紫外檢測(cè)器、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器)，島津儀器有限公司；platisil ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，迪馬科技公司；BT125D分析天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵，上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

采用乙酸乙酯液-液萃取法。取10 mL酒樣，用30 mL乙酸乙酯，萃取3次，收集有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(25 ℃)濃縮至干，用10 mL色譜級(jí)甲醇溶解，-18 ℃避光保存，待液相分析。樣品測(cè)定前經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。

1.3.2 色譜條件

platisil ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速1 mL/min。因所檢測(cè)的7種酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，為了實(shí)現(xiàn)有效分離，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，如表1所示擬定3種不同的色譜條件。

表1 三種不同的色譜分析條件Table 1 Three different chromatographic conditions

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別稱取各酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品5 mg于10 mL棕色容量瓶中，色譜級(jí)甲醇定容，得到500 mg/L單標(biāo)溶液；精確稱取7種酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，于10 mL棕色容量瓶中，色譜級(jí)甲醇定容，得到500 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，稀釋成不同濃度梯度，-18 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC色譜條件選擇

分別對(duì)7種物質(zhì)單標(biāo)和混標(biāo)進(jìn)樣分析，3種分析方法的色譜圖如圖1所示。方法1洗脫流程最長(zhǎng)，并且各標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間過(guò)于集中，表兒茶素沒(méi)有得到較好的分離；方法2中沒(méi)食子兒茶素和原花青素B1沒(méi)有得到穩(wěn)定分離，表沒(méi)食子兒茶素和兒茶素沒(méi)有得到穩(wěn)定分離；方法3分離酚類物質(zhì)所用時(shí)間最短，并且7種物質(zhì)能得到有效分離且出峰時(shí)間穩(wěn)定。所以確定方法3的分析方法用于測(cè)定葡萄酒中的酚類物質(zhì)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將混合標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同梯度，按照優(yōu)化好的色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，各物質(zhì)的含量與峰面積呈良好的線性關(guān)系，以信噪比3∶1時(shí)的相應(yīng)濃度確定為檢測(cè)限，見(jiàn)表2。

表2 各酚類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)限和保留時(shí)間Table 2 Standard curve, detection limits and remain time of 7 phenols

a-方法1；b-方法2；c-方法3圖1 七種酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 Chromatogram of 7 phenols standards注：1-GC；2-PC B1；3-EgC；4-C；5-PC B2；6-EC；7-EcG(下同)

2.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

向已知各酚類物質(zhì)濃度的酒樣中定量添加標(biāo)準(zhǔn)品，按上述方法液相分析，根據(jù)檢測(cè)含量計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 酚類物質(zhì)加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 3 Results of recovery experiment for several phenols(n=3)

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

在上述色譜條件下，將同一標(biāo)樣和樣品分別連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄其保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果見(jiàn)表4，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在1%以內(nèi)，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在4%以內(nèi)，表明色譜工作穩(wěn)定、重復(fù)性好。

表4 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 4 Results of repeatability for standards and sample determination(n=6)

2.5 酒樣的測(cè)定

根據(jù)上述色譜條件，對(duì)采集的酒樣進(jìn)行測(cè)定，以賀東莊園(賀蘭山東麓石嘴山產(chǎn)區(qū))赤霞珠干紅葡萄酒為例的色譜圖見(jiàn)圖2，各個(gè)酒樣酚類物質(zhì)含量見(jiàn)表5。由表5可知，酚類物質(zhì)總量最高的是美御酒莊2016年開(kāi)莊珍藏干紅葡萄酒(237.528 mg/L)，總量最少的是寶源大地酒莊鼎品紅赤霞珠藍(lán)鉆干紅葡萄酒(127.237 mg/L)；圓潤(rùn)酒莊2015年珍藏赤霞珠干紅葡萄酒、類人首2016年R1干紅葡萄酒、匯達(dá)陽(yáng)光2016年千紅裕鉆石級(jí)赤霞珠干紅葡萄酒，酚類物質(zhì)含量最高的是沒(méi)食子兒茶素，其他酒樣酚類物質(zhì)含量最高的均為表兒茶素；除2016年嘉地酒園風(fēng)信子干紅葡萄酒、迦南美地干紅葡萄酒、賀玉酒莊秘密花園赤霞珠干紅葡萄酒、匯達(dá)陽(yáng)光2016年千紅裕鉆石級(jí)赤霞珠干紅葡萄酒、紫尚酒莊輪回蛇龍珠干紅葡萄酒未檢出表兒茶素沒(méi)食子酸酯外，其他酒樣均檢出了7種酚類物質(zhì)。經(jīng)方差分析，寧夏賀蘭山東麓不同子產(chǎn)區(qū)間葡萄酒的各種酚類物質(zhì)的含量差異不顯著(P>0.05)。

表5 寧夏賀蘭山東麓不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒酚類物質(zhì)含量(n=3) 單位：mg/L

圖2 葡萄酒樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of wine sample

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用乙酸乙酯液-液萃取對(duì)酒樣前處理，通過(guò)對(duì)流動(dòng)相和洗脫程序的優(yōu)化，確定了最佳檢測(cè)條件，采用platisil ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相A為V(水)∶V(乙酸)=98∶2，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，建立了1種同時(shí)分離5種黃烷-3-醇單體和2種原花青素二聚體的HPLC方法。

葡萄酒成分復(fù)雜，通過(guò)液-液萃取對(duì)酒樣進(jìn)行前處理，相比直接進(jìn)樣，可以有效分離和提取待測(cè)組分；相比固相萃取，操作簡(jiǎn)單，樣品處理步驟少且提取效率高[22]。采用乙酸和乙腈為流動(dòng)相，試劑容易獲得，降低了實(shí)驗(yàn)成本，通過(guò)對(duì)色譜條件的優(yōu)化，7種酚類物質(zhì)在30 min內(nèi)就能得到有效分離。

采用已建立的方法對(duì)寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)不同子產(chǎn)區(qū)赤霞珠干紅葡萄酒的酚類物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示黃烷-3-醇單體中，兒茶素和表兒茶素含量較高，并且有樣品中未檢出表兒茶素沒(méi)食子酸酯，這與溫鵬飛等[23]的研究結(jié)果相同。酒樣兒茶素含量在7.883～45.360 mg/L，這與孫海燕[24]用超高效液相色譜對(duì)賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)葡萄酒中兒茶素含量(9.01～29.49 mg/L)的檢測(cè)結(jié)果相似。此外，采用該方法還同時(shí)實(shí)現(xiàn)了對(duì)2種原花青素二聚體的定量分析。結(jié)果表明，寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)2016年不同酒莊生產(chǎn)的赤霞珠干紅葡萄酒的酚類物質(zhì)含量不同，但每種酚類物質(zhì)在不同產(chǎn)區(qū)間的含量差異性不顯著。

葡萄酒中酚類物質(zhì)對(duì)于酒的品質(zhì)至關(guān)重要，葡萄品種、產(chǎn)區(qū)因素、栽培管理方式、釀造工藝和陳年方法等都會(huì)影響葡萄酒中酚類物質(zhì)的種類和含量。本研究只檢測(cè)了產(chǎn)區(qū)內(nèi)赤霞珠干紅葡萄酒中部分酚類物質(zhì)的含量，在今后的研究中，可考慮結(jié)合產(chǎn)區(qū)風(fēng)土、葡萄栽培和釀造工藝，探究酚類物質(zhì)的種類和含量的差異，以及對(duì)葡萄酒品質(zhì)和口感的影響。