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    醬油中風(fēng)味物質(zhì)形成的研究進(jìn)展

    2021-06-07 13:36:06何一龍劉曉艷白衛(wèi)東趙文紅
    農(nóng)產(chǎn)品加工 2021年9期
    關(guān)鍵詞:有機(jī)酸醬油乳酸

    陳 杰,趙 瑩,何一龍,劉曉艷,白衛(wèi)東,錢 敏,趙文紅

    (1.廣東粵師傅調(diào)味食品有限公司,廣東開平 529341;2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院,廣東廣州 510225;3.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程創(chuàng)新研究院,廣東廣州 510225)

    醬油俗稱豉油,主要以大豆、餅粕等為原材料,輔以小麥、面粉或麥麩等,經(jīng)微生物發(fā)酵得到的液態(tài)調(diào)味品,距今已有3 000多年的歷史[1-3]。低鹽固態(tài)型、淋澆型、高鹽稀態(tài)型和傳統(tǒng)發(fā)酵型是釀造醬油中常見的四類,低鹽固態(tài)型發(fā)酵時(shí)間短、醬香濃、色澤深且價(jià)格低,淋澆型色澤光亮,高鹽稀態(tài)型香氣種類較多且風(fēng)味較好,而傳統(tǒng)發(fā)酵型具有獨(dú)特且不可復(fù)制的風(fēng)味[4]。傳統(tǒng)發(fā)酵型醬油的發(fā)酵周期長,生產(chǎn)效率不高,且發(fā)酵過程中自然污染難以控制,這對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量和安全構(gòu)成了較大的威脅。因此,在工業(yè)化生產(chǎn)的前提下,釀造醬油的傳統(tǒng)式發(fā)酵逐漸被高鹽稀態(tài)式發(fā)酵所取代,但高鹽稀態(tài)式發(fā)酵罐的罐體較為封閉,得到的醬油風(fēng)味不足,原因在于傳統(tǒng)發(fā)酵方式的發(fā)酵制劑很難被復(fù)制[5]。以醬油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)、滋味物質(zhì)及微生物對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的影響為中心,近年來國內(nèi)外學(xué)者對(duì)醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)、滋味物質(zhì)及微生物的種類、數(shù)量和檢測手段的報(bào)道進(jìn)行歸納,總結(jié)了醬油風(fēng)味形成的機(jī)理及其與微生物的關(guān)系研究,力求為后續(xù)醬油風(fēng)味的研究提供理論依據(jù)。

    1 醬油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

    1.1 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

    揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在醬油中以醇、酸、酚、酯、醛、酮、含硫含氮和呋喃類為主。這些物質(zhì)共同給予醬油特征性。

    醬油中的醇類來自原料成分的降解或產(chǎn)生于發(fā)酵過程,主要為苯乙醇和乙醇。苯乙醇帶有玫瑰樣香氣,乙醇自身的香氣強(qiáng)度較弱,一般作為香氣物質(zhì)的合成底物,間接對(duì)醬油的香氣提供作用。在生抽與老抽的對(duì)比中,生抽的乙醇含量較高[6]。在日式醬油中,高級(jí)醇類物質(zhì)的含量較高,而廣式醬油中高級(jí)醇種類更加豐富,并且含有較多的脂肪醇[7]。醇類物質(zhì)往往使人產(chǎn)生愉悅感并且間接地影響著醬油的風(fēng)味,如帶有玫瑰樣香氣的苯乙醇和在醬油中扮演香味物質(zhì)合成底物角色的乙醇[8]。乳酸菌的發(fā)酵作用是醬油中酸類物質(zhì)的主要來源,酸類物質(zhì)呈味的同時(shí)可與醇反應(yīng)形成酯,形成醬油中特有的酯香。具有煙熏風(fēng)味的酚類物質(zhì),能夠?yàn)獒u油提供烘烤香氣,烘托點(diǎn)綴醬香,其中主要包括麥芽酚(Maltol)、愈創(chuàng)木酚(Guaiacol)、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚(4-Vinylguaiacol)、4-乙基愈創(chuàng)木酚(2-Methoxy-4-ethylphenol)等成分,由原料中的木質(zhì)素、糖類等為前體經(jīng)霉菌、酵母菌的發(fā)酵生成[9]。酯類物質(zhì)因其自身的甜香和果香味成為了醬油獨(dú)特的主體風(fēng)味,并且能夠調(diào)和咸味。

    醬油的釀造過程體系復(fù)雜,由氨基酸代謝和油脂氧化代謝能夠同時(shí)產(chǎn)生醛類物質(zhì)和酮類物質(zhì),前者本身不呈味,但能夠與其他物質(zhì)作用并生成特殊香氣成分[7],后者具有的花香和果香味能夠賦予醬油醇厚的醬香風(fēng)味[10]。含硫氨基酸和硫胺素代謝產(chǎn)生的含硫類化合物低含量時(shí)就能夠顯現(xiàn)其獨(dú)特的呈味特性。趙國忠等人[11]對(duì)比滬釀3.042與100-8這2種米曲霉發(fā)酵的醬油,其中米曲霉100-8變化最明顯的是吡嗪類物質(zhì)的增多。該類化合物主要是由美拉德反應(yīng)生成的含氮化合物,其香氣特征可隨濃度含量變化,低濃度時(shí),具有豌豆、堅(jiān)果、水果、胡椒、花生等香味[12],能夠賦予醬油獨(dú)特的焙烤和堅(jiān)果風(fēng)味[13]。呋喃(酮)類是醬油中香氣貢獻(xiàn)較大的一類,可由魯式接合酵母產(chǎn)生。高獻(xiàn)禮等人[14]使用3種萃取方法分離鑒定醬油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),發(fā)現(xiàn)大部分呋喃和呋喃酮均在直接溶劑萃取法中被檢出。特別是其中的4-羥基-2(5)-乙基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮(HEMF)具有減弱咸味、增強(qiáng)甜味的效果,給醬油帶來焦糖香氣[15]。

    1.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測方法

    已發(fā)現(xiàn)的醬油香氣成分超過1 000種,其種類繁多,較為復(fù)雜。挑選適當(dāng)?shù)那疤幚矸绞剑瑢?duì)揭示醬油風(fēng)味組成的真實(shí)性和準(zhǔn)確性至關(guān)重要,并且揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在較為單獨(dú)的前處理?xiàng)l件下難以得到充分的萃取,通常都是結(jié)合不同的萃取方法,對(duì)醬油的香氣成分進(jìn)行前處理。

    風(fēng)味物質(zhì)提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)見表1[16-21]。

    揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測第一步是對(duì)樣品進(jìn)行提取處理,第二步是對(duì)提取物中的成分進(jìn)行分析(定性、定量),目前常用的香氣物質(zhì)檢測技術(shù)有氣相色譜法(GC)、液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、氣相色譜嗅聞技術(shù)和電子鼻檢測技術(shù)(GC-O)、全二維氣相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(GC×GC-TOF MS)等。其中,GC-MS法具有靈敏度高、分離效果好、鑒定能力強(qiáng)等特點(diǎn),被廣泛運(yùn)用于醬油風(fēng)味物質(zhì)的研究中。

    表1 風(fēng)味物質(zhì)提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)

    2 醬油的滋味物質(zhì)

    2.1 滋味物質(zhì)

    咸、甜、酸、鮮、苦五味共同組成了醬油獨(dú)有的滋味[22]。其中,氨基酸和有機(jī)酸是醬油中重要的滋味物質(zhì)。

    根據(jù)呈味特點(diǎn)的不同,醬油中的氨基酸被分為3類,即苦、甜與鮮味。近年來,對(duì)其的研究主要運(yùn)用于醬油品質(zhì)的評(píng)價(jià)、呈味特性的研究和種類的區(qū)分[23-25]。有學(xué)者運(yùn)用全自動(dòng)茚三酮顯色法對(duì)不同種類醬油中的8種游離氨基酸進(jìn)行了檢測,發(fā)現(xiàn)醬油的風(fēng)味是由各種游離氨基酸分子共同影響的結(jié)果,并不是由谷氨酸單純提供[26]。還有學(xué)者對(duì)比了中式與日式醬油非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的區(qū)別,發(fā)現(xiàn)中式醬油中的鮮味氨基酸含量顯著高于日式醬油,然而日式醬油中的甜味和苦味氨基酸均高于中式醬油[27]。

    乳酸、乙酸、丁二酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、焦谷氨酸與草酸等20多種有機(jī)酸是醬油中酸味的主要來源[28]。醬油的品質(zhì)受有機(jī)酸種類與含量的影響,適量的有機(jī)酸可以對(duì)風(fēng)味有重要的影響,其本身具有的酸味和特殊口感,可以獨(dú)自形成香氣,與醇類物質(zhì)酯化成酯可以增強(qiáng)酯香,但酸含量過高或分布不平衡會(huì)使醬油的口感粗糙且刺激不協(xié)調(diào)。張露等人[29]測定了3款醬油中的10種有機(jī)酸,結(jié)果顯示乳酸和乙酸之和占總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的35%以上,因此認(rèn)為醬油中主要的有機(jī)酸為乳酸和乙酸,并且特級(jí)醬油中有機(jī)酸種類和總含量均高于三級(jí)醬油。張怡潔[22]測定了12種不同地區(qū)醬油中的有機(jī)酸,發(fā)現(xiàn)乳酸和乙酸是醬油中的主要有機(jī)酸、琥珀酸和蘋果酸在醬油中少量存在,并且發(fā)現(xiàn)醬油中幾乎不含丙酸。

    2.2 滋味物質(zhì)的檢測方法

    2.2.1 氨基酸的檢測方法

    大部分氨基酸沒有熒光基團(tuán)或紫外吸收的小分子物質(zhì),因此其檢測方法相對(duì)較復(fù)雜,直接檢測法、柱前衍生法與柱后衍生法是氨基酸檢測中常用到的3種方法。

    氨基酸的直接檢測方法中高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法(HPAEC-IPAD)和高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法(HPLC-ELSD)較為常見[30]。HPAEC-IPAD法的原理是,在一定pH值條件下,氨基酸分子中的氨基和部分羥基發(fā)生氧化反應(yīng)引起微弱電流變化而被檢測[31]。ELSD是一種常用的檢測器,具有高通用性、使用簡單的特點(diǎn),結(jié)合HPLC使用往往不用考慮樣品的光學(xué)性質(zhì)和物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu),即使被測物質(zhì)無紫外吸收或熒光基團(tuán)也無太大影響,但缺點(diǎn)是其靈敏性不高,不適用于進(jìn)行定量分析[32]。直接檢測法具有操作簡便、無需衍生等優(yōu)點(diǎn),但也存在一些局限性,且所使用的儀器設(shè)備一般實(shí)驗(yàn)室不配備,不是常用的氨基酸檢測方法。

    柱前衍生法在運(yùn)用HPLC法和GC法檢測醬油中的氨基酸時(shí)往往被用到,一般結(jié)合UV或FLD使用。這2種方法都具有檢出限低、靈敏度高的特點(diǎn)。但由于需要進(jìn)行柱前衍生,各種衍生化試劑的差異性會(huì)導(dǎo)致其在對(duì)氨基酸的檢測中具有一定局限性。有學(xué)者提出了RP-HPLC法、C-GC法(毛細(xì)管氣相色譜法)等經(jīng)過優(yōu)化后的氨基酸檢測方法,同時(shí)結(jié)合相適宜的衍生試劑,以減少柱前衍生法的局限性[33]。柱后衍生法是指先將氨基酸進(jìn)行色譜柱分離,再對(duì)其進(jìn)行衍生處理最后檢測。相比較于柱前衍生,柱后衍生法的可重復(fù)性更高,除特定分離柱之外,還需要泵和反應(yīng)器使洗脫液和衍生試劑混合均勻。氨基酸自動(dòng)分析儀就是根據(jù)該方法原理研發(fā)得來的。氨基酸的自動(dòng)分析儀所需樣品衍生化時(shí)間短、衍生條件對(duì)檢測結(jié)果精確度影響較小,而且還具有樣本的耐受性較高、所需的樣品量較少的特點(diǎn)。由于衍生化試劑并沒有直接注入到色譜柱內(nèi)部。因此,該法中色譜柱的使用壽命能夠得到有效的延長[34]。

    2.2.2 有機(jī)酸的檢測方法

    醬油中有機(jī)酸的檢測方法相對(duì)氨基酸的較單一,主要有GC法、HPLC法和IC(離子色譜)法。其中,醬油中有機(jī)酸的檢測HPLC法的使用頻率較高。

    有機(jī)酸屬于極性小分子弱酸,易溶于水,在水系流動(dòng)相中以離子形式存在而不能在非極性的鍵合相色譜柱固定相上保留。有機(jī)酸的離解常數(shù)不是很大(pKa>2),在pH值2~3時(shí),有機(jī)酸的解離反應(yīng)向逆反應(yīng)方向進(jìn)行,解離受到抑制[35]。

    3 醬油的相關(guān)微生物

    3.1 微生物的種類

    醬油是利用微生物豐富的酶系作用于原料得到的發(fā)酵產(chǎn)品。發(fā)酵過程中的微生物除了自身可代謝生成不同的代謝產(chǎn)物,還可通過自溶作用釋放出許多營養(yǎng)物質(zhì),這些物質(zhì)經(jīng)過復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)過程,最終影響醬油風(fēng)味的形成。米曲霉是醬油釀造中使用最廣泛的一種微生物,能夠分泌許多種酶類分解醬油原料[36]。其中,蛋白水解酶可作用于肽鍵,將蛋白質(zhì)水解為小分子肽鏈和氨基酸;糖化酶可將糊化后的淀粉類原料轉(zhuǎn)換成麥芽糖或葡萄糖。另外,菌體自溶后,谷氨酰胺酶可催化降解谷氨酰胺,將其水解成谷氨酸。黑曲霉多與米曲霉混合制曲發(fā)酵醬油,黑曲霉所含的植物組織溶解酶(纖維素酶、果膠酶)能破壞植物細(xì)胞壁,使胞內(nèi)蛋白質(zhì)和淀粉暴露出來,然后與米曲霉的蛋白酶共同作用,使暴露出來的胞內(nèi)蛋白和淀粉得到充分降解[37]。

    魯氏酵母耐滲透壓能力強(qiáng),可在高鹽高糖環(huán)境下生長,是一種主發(fā)酵酵母,在發(fā)酵前期加入,可產(chǎn)生乙醇、高級(jí)醇及芳香雜醇類物質(zhì),還能轉(zhuǎn)化糖類物質(zhì)生成多元醇(如甘油)及糖醇類風(fēng)味物質(zhì)[38-39]。此外,也產(chǎn)生呋喃酮類物質(zhì)、琥珀酸等有機(jī)酸[40]。在發(fā)酵中后期,醬醪糖濃度與pH值均降低,魯式酵母開始自溶,此時(shí)球擬酵母代謝活躍,參與醬醪成熟及風(fēng)味物質(zhì)的生成,將前期生成的醇類物質(zhì)和有機(jī)酸等合成酯類物質(zhì),提升了醬油的呈香水平[41]。在醬油釀造環(huán)境中,球擬酵母可直接從釀造原料獲得營養(yǎng)源,不需要特別添加營養(yǎng)源[42]。球擬酵母可代謝產(chǎn)生酚類化合物(如4-乙基愈創(chuàng)木酚、乙基酚等),同一時(shí)期,球擬酵母生成的酸性蛋白酶也可對(duì)短肽進(jìn)一步水解,給醬油提香增鮮[43]。在發(fā)酵中后期,同樣活躍的假絲酵母(Candida versatilis),可將炒小麥在微生物作用下生成的阿魏酸和香豆酸轉(zhuǎn)換成4-乙基愈創(chuàng)木酚和4-乙基酚[37]。乳酸菌是一類能代謝各種糖類物質(zhì)產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌總稱[42],其中主要起作用的是嗜鹽片球菌屬(Pediococcus halophilus)、四鏈球菌(Tetracoccus)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)等,乳酸菌可與耐鹽酵母在厭氧條件下發(fā)酵,消耗剩余的糖和氨基酸,增添醬油的風(fēng)味。醬油發(fā)酵初期產(chǎn)生的乳酸會(huì)對(duì)酵母菌產(chǎn)生拮抗作用。后期成熟階段,醬醪中乳酸的積累會(huì)導(dǎo)致pH值降低,這使得乳酸菌的生長受到抑制,但在酸性環(huán)境下酵母菌卻能夠生長繁殖并且進(jìn)行酒精發(fā)酵,給醬油增添了柔和的酸味和香氣[44]。

    3.2 微生物與風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)系

    制曲微生物能夠代謝產(chǎn)生豐富酶系,同時(shí)也為香氣成分的產(chǎn)生提供前體物質(zhì),對(duì)醬油風(fēng)味的產(chǎn)生具有顯著影響[45]。許多研究表明,混菌制曲發(fā)酵的醬油風(fēng)味更佳。近年來,較多學(xué)者的研究方向偏向于研究菌株特性、菌種間的相互作用及通過微生物有目的性地提高某類香氣物質(zhì)等。

    Zhong Y等人[46]研究2株米曲霉的基因組和轉(zhuǎn)錄體,發(fā)現(xiàn)一株發(fā)酵性能下降的米曲霉能有效地利用葡萄糖,燃燒多余的氨基酸,為菌絲體生長提供糖酵解和TCA循環(huán)的燃料,從而成為生存競爭中的優(yōu)勢菌株;另一株工業(yè)菌株則為了提高水解酶的產(chǎn)量而犧牲菌絲體的生長,促進(jìn)風(fēng)味前體物質(zhì)形成的代謝途徑,使其成為有利于曲發(fā)酵的菌株。

    趙謀明等人[47]對(duì)5株高鹽稀態(tài)醬油中具有代表性菌株進(jìn)行理化性質(zhì)分析,并探究其與酵母相互作用對(duì)菌株繁殖及風(fēng)味形成的影響。研究發(fā)現(xiàn),克氏庫克菌的單菌與混菌培養(yǎng)體系都具有較好的風(fēng)味特性,提升了乙酸、乙酸乙酯、苯乙醛、3-甲硫基丙醛和3-甲硫基-1-丙醇等香氣物質(zhì)。趙國忠等人[11]對(duì)比普通釀造醬油與添加植物乳桿菌釀造醬油的無鹽固形物含量區(qū)別,發(fā)現(xiàn)添加植物乳桿菌的醬油有助于淀粉質(zhì)原料向氨基酸、多肽類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化而對(duì)糖類沒有太大影響。Harada R等人[48]運(yùn)用乙醇替代酵母、乳酸和乙酸替代乳酸菌的影響,研究了微生物及其產(chǎn)物對(duì)醬油香氣影響發(fā)現(xiàn),添加乙醇與添加酵母菌發(fā)酵的醬油風(fēng)味差異明顯,說明醬油香氣成分并非乙醇轉(zhuǎn)化,而是通過酵母代謝產(chǎn)生,在乳酸和乙酸替代乳酸菌的試驗(yàn)中,風(fēng)味沒有出現(xiàn)顯著的變化,說明乳酸菌所產(chǎn)生的作用主要來自乳酸和乙酸。

    張麗杰等人[49]篩選出可合成多種吡嗪化合物的枯草芽孢桿菌Nr.5,并基于此菌株研究提升醬油中吡嗪化合物種類及質(zhì)量濃度的方法,對(duì)比發(fā)現(xiàn)只添加枯草芽孢桿菌Nr.5的醬油樣品中只有2,5-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪的濃度有增加。而同時(shí)添加枯草芽孢桿菌Nr.5與發(fā)酵底物L(fēng)-蘇氨酸及D-葡萄糖的樣品中,有7種吡嗪的濃度得到提升且總濃度提高了12.5倍。

    4 結(jié)語

    醬油風(fēng)味主要分為揮發(fā)性與非揮發(fā)性(滋味)2種,揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)往往能給消費(fèi)者帶來直觀的第一感覺,滋味物質(zhì)則是判斷醬油風(fēng)味好壞的最后關(guān)鍵因素,同時(shí)其也間接影響著揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的存在。醬油風(fēng)味的影響因素主要有原料、生產(chǎn)工藝及微生物的菌種和數(shù)量,其中微生物菌種和數(shù)量最為關(guān)鍵。迄今為止,醬油發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生作用的微生物對(duì)應(yīng)的某種或某幾種風(fēng)味物質(zhì)(揮發(fā)性和非揮發(fā)性)尚不完全明確,單獨(dú)使用前體物如乳酸、乙酸和乙醇進(jìn)行發(fā)酵對(duì)比添加產(chǎn)生乳酸、乙酸或乙醇的微生物發(fā)酵,將有助于進(jìn)一步分析微生物參與每種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生。因此,在今后醬油風(fēng)味的研究中,不但要著重對(duì)微生物的特性進(jìn)行研究,在風(fēng)味提取的技術(shù)上也需多做對(duì)比,如在揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的提取上,幾種方法各具優(yōu)缺點(diǎn),可適當(dāng)結(jié)合一兩種提取方法對(duì)醬油的風(fēng)味進(jìn)行檢測。

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