山藥茯苓復(fù)合酵素的發(fā)酵工藝優(yōu)化及其發(fā)酵前后總多糖含量對(duì)比分析

劉 斌，饒 智，李俊明，吳 鈺，謝夢(mèng)洲

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南省藥食同源功能性食品工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410208）

酵素是指選取一種或多種新鮮水果、蔬菜、食用菌、中草藥為基礎(chǔ)原料，經(jīng)乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等多種有益菌發(fā)酵而使原材料生物活性增強(qiáng)或產(chǎn)生新的生物活性的物質(zhì)[1]。關(guān)于酵素的研究最早在20世紀(jì)初起源于日本，后來(lái)發(fā)展到歐美和我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)，成為了相當(dāng)成熟的產(chǎn)業(yè)，有上千萬(wàn)消費(fèi)者每天服用酵素產(chǎn)品[2]。近30年來(lái)，中國(guó)人的血脂水平逐步升高，血脂異常患病率明顯增加。2012年全國(guó)調(diào)查結(jié)果顯示[3]，中國(guó)成人血脂異?？傮w患病率高達(dá)40.40%，較2002年呈大幅度上升[4]。高脂血癥是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)而形成心腦血管事件的主要因素之一，有效防治血脂異常是預(yù)防心腦血管疾病的重要途徑[5]。目前，市面上流通的治療藥物對(duì)肝臟有一定損害及副作用，故不適合長(zhǎng)期服用，患者順應(yīng)性差。因此，選取藥食同源中藥，開(kāi)發(fā)具有防治高脂血癥的保健食品具有廣闊的市場(chǎng)前景和重要的社會(huì)科學(xué)意義。

山藥甘、平，歸脾、肺、腎經(jīng)，有益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)脾肺腎、固精止帶的功效。藥理試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，山藥多糖具有有效調(diào)節(jié)糖尿病小鼠糖脂代謝紊亂的作用[6]，可降低糖尿病小鼠體內(nèi)血糖（GLU）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的濃度，緩解體重減輕的狀況。茯苓甘、淡、平，歸心、脾、腎經(jīng)，有利水滲濕、健脾、寧心的功效。茯苓有很好的利尿作用，健康人服用茯苓水煎劑，有明顯的利水效果；對(duì)心源性水腫患者的利水效果非常好，日劑量100 g時(shí)效果最好[7]。目前，關(guān)于具有降血脂功能的藥食同源中藥酵素的研究鮮有報(bào)道。試驗(yàn)以山藥[8]、茯苓[9]等5味藥食同源中藥為主要原料[10]，植物乳酸桿菌為發(fā)酵菌種，通過(guò)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化水提工藝及發(fā)酵工藝，總多糖含量和干浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用紫外分光光度法、苯酚-硫酸顯色測(cè)定總多糖的百分含量，從而為山藥茯苓復(fù)合酵素飲料開(kāi)發(fā)成降血脂的功能性食品提供科學(xué)依據(jù)[11]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山藥飲片，產(chǎn)地河南；茯苓飲片，產(chǎn)地湖南；植物乳酸桿菌CICC21790，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供；MRS肉湯培養(yǎng)基BS1137，杭州百思生物技術(shù)有限公司提供；無(wú)水葡萄糖對(duì)照品，上海沃凱生物技術(shù)有限公司提供（批號(hào)：20080415）；苯酚，廣東光華科技股份有限公司提供（批號(hào)：20160701）；硫酸，株洲市星空化玻有限責(zé)任公司有限公司提供（批號(hào)：20171120）；乙醇，上海沃凱生物技術(shù)有限公司提供（批號(hào)：20180413）；實(shí)驗(yàn)室用水為純化水，試劑均為分析醇。

1.2 儀器與設(shè)備

UV900B型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京萊伯泰科產(chǎn)品；ATX124型電子天平，東京島津儀器有限公司產(chǎn)品；HY-4型調(diào)速多用振蕩器，常州榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品；DIKW-S-6型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器產(chǎn)品；KM5200DE型超聲波清洗器，昆山美美超聲儀器產(chǎn)品；N-301010L型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，日本東京理化產(chǎn)品；SCIENTZ-10N型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份產(chǎn)品；SFY-20BL型水分測(cè)定儀，深圳市冠亞水分儀科技產(chǎn)品；HNYC-203T型智能恒溫培養(yǎng)振蕩器，天津歐諾儀器股份有限公司產(chǎn)品；TGL18W型高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果分析

2.1 總多糖百分含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒質(zhì)量的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品20.4 mg，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.204 mg/mL無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

取各正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到的水提物和發(fā)酵制得的干浸膏約0.5 g，加入80%乙醇100 mL先研磨，使之分散成混懸水溶液，再轉(zhuǎn)移至三角瓶中，加熱回流1.0 h，趁熱濾過(guò)，濾渣與濾器用熱80%乙醇30 mL分次洗滌，棄去濾液，濾渣連同濾紙置燒瓶中，加水150 mL，加熱回流1.0 h，趁熱濾過(guò)，同上操作，再重復(fù)提取1次[12]。用少量熱水洗滌濾器，合并濾液與洗液，放冷，轉(zhuǎn)移至500 mL量瓶中，用純化水稀釋至刻度，搖勻[13]。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取對(duì)照品溶液0，0.1，0.2，0.4，0.7，1.0 mL，分別置于10 mL具塞刻度試管中，再分別加水補(bǔ)至2.0 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入硫酸7 mL，密封；用調(diào)速多用振蕩器混勻，放置10 min，置40℃水浴中保溫15 min，取出，迅速冷卻至室溫，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程Y=0.037 8X+0.024 7，線性相關(guān)系數(shù)R=0.999 5，結(jié)果表明葡萄糖質(zhì)量濃度在0～20.4μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 供試品溶液的測(cè)定方法

精密移取制備的供試品溶液1 mL，置于10 mL具塞刻度試管中，加水補(bǔ)至2.0 mL；精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸7 mL，密封；用調(diào)速多用振蕩器混勻，放置10 min，置于40℃水浴中保溫15 min，取出，迅速冷卻至室溫，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計(jì)算總多糖百分含量[14]。

2.2 山藥、茯苓水提取物制備工藝優(yōu)化

2.2.1 山藥、茯苓水提取物制備的基本工藝

按處方比例稱取山藥、茯苓等5味中藥飲片，加一定量純化水超聲浸泡一定時(shí)間，在一定的水浴溫度下加熱回流一定時(shí)間[15-16]，過(guò)濾；濾渣第二次加一定量純化水，在一定的水浴溫度下加熱回流一定時(shí)間，過(guò)濾；合并2次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃，30 r/min，30 kPa的條件下減壓濃縮至藥材：濃縮液=1∶1左右，再冷凍干燥成干浸膏粉（含水量＜5.0%）。

2.2.2 山藥、茯苓水提取工藝正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

取山藥、茯苓共9份，每份按照正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平表（表1）進(jìn)行水提物（干浸膏）的制備，測(cè)定干浸膏得率[17]及總多糖含量。

水提取工藝因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，水提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖百分含量及干浸膏得率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，水提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖及干浸膏得率因素間方差分析見(jiàn)表3，水提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖百分含量及干浸膏得率各因素的水平間方差分析見(jiàn)表4。

表1 水提取工藝因素與水平設(shè)計(jì)

表2 水提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖百分含量及干浸膏得率測(cè)定結(jié)果

表3 水提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖百分含量及干浸膏得率因素間方差分析

表4 水提正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖百分含量及干浸膏得率各因素的水平間方差分析

以總多糖百分含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)：A因素水平間差別皆具有統(tǒng)計(jì)意義，取A因素的1水平，即水提溫度95℃，B、C、D因素可任意取值；以干浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)：A因素水平間差別皆具有統(tǒng)計(jì)意義，取A因素的1水平，即水提溫度95℃，B因素水平間差別皆具有統(tǒng)計(jì)意義，取2水平或3水平，因2水平加水量少于3水平，故B因素取2水平，即加水量第1次為12倍，第2次為10倍。C因素水平間差別皆具有統(tǒng)計(jì)意義，取2水平或3水平，因2水平提取時(shí)間短于3水平，故C因素取2水平，即提取時(shí)間第1次為2.0 h，第2次為1.5 h。D因素可取任意值，因1水平超聲浸泡時(shí)間最短，故D因素取1水平，即超聲浸泡時(shí)間為0.5 h。

2.2.3 水提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)水提工藝所得到的優(yōu)化工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，取3批山藥及茯苓飲片，每批總量1.0 kg，加純化水量為藥材量的12，10倍，超聲浸泡時(shí)間為0.5 h，水提溫度95℃，水提取時(shí)間為2.0，1.5 h，測(cè)得總多糖含量為8.796%，RSD=1.957%（n=3），干浸膏得率為7.514%，RSD=1.745%，驗(yàn)證結(jié)果略高于正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)中的最高值，表明該工藝科學(xué)、合理、穩(wěn)定、可行。

2.3 山藥、茯苓復(fù)合酵素的發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.3.1 山藥、茯苓復(fù)合酵素的發(fā)酵基本工藝

2.3.2 菌種的培養(yǎng)與分離

培養(yǎng)植物乳酸桿菌（MRS肉湯培養(yǎng)基，接種量0.1%，37℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)）至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期，然后4℃條件下以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心10 min棄上清液取菌體，無(wú)菌生理鹽水洗滌菌體2次（重懸菌體后離心棄上清液），再加純化水制成混懸液以備接種[18]。

2.3.3 山藥、茯苓復(fù)合酵素的發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）山藥、茯苓復(fù)合酵素的發(fā)酵工藝正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。選取對(duì)發(fā)酵工藝影響較大的接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行考查，按干浸膏混懸水溶液體積的5%，10%，15%加入菌液進(jìn)行發(fā)酵[19]，發(fā)酵液靜置澄清2 h后，取上清液以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心10 min，將上清液用0.45μm濾膜過(guò)濾，即得山藥茯苓復(fù)合酵素水溶液，再冷凍干燥得山藥茯苓復(fù)合酵素的干浸膏，計(jì)算干浸膏得率，測(cè)定總多糖百分含量[20]。

山藥、茯苓復(fù)合酵素的發(fā)酵工藝因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表5，發(fā)酵工藝正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖及干浸膏得率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6，發(fā)酵工藝正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖含量及干浸膏得率因素間方差分析見(jiàn)表7，發(fā)酵工藝正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖各因素的水平間方差分析見(jiàn)表8。

表5 山藥、茯苓復(fù)合酵素的發(fā)酵工藝因素與水平設(shè)計(jì)

表6 發(fā)酵工藝正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖含量及干浸膏得率測(cè)定結(jié)果

干浸膏得率因素間方差分析皆無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故不必進(jìn)行水平間方差分析。

表7 發(fā)酵工藝正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖及干浸膏得率因素間方差分析

表8 發(fā)酵工藝正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)總多糖含量各因素的水平間方差分析

以總多糖百分含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)：A'、B'、C'因素水平間皆有統(tǒng)計(jì)意義，A'因素取2水平或3水平，即接種量10%或15%，考慮經(jīng)濟(jì)效益，取2水平為佳，即接種量10%；B'因素取2水平或1水平，即發(fā)酵溫度31℃或34℃，考慮經(jīng)濟(jì)效益，取1水平為佳，即發(fā)酵溫度31℃；C'因素取3水平，即發(fā)酵時(shí)間為72 h。以干浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)：A'、B'、C'、D'因素可任意取值，即同總多糖百分含量分析結(jié)果。

所謂的信息化人力資源管理主要指的是，組織中利用網(wǎng)絡(luò)化的技術(shù)手段，在意識(shí)與戰(zhàn)略性人力資源的支持下，展現(xiàn)較強(qiáng)的實(shí)踐性實(shí)施。

（2）山藥、茯苓復(fù)合酵素的發(fā)酵工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)山藥、茯苓復(fù)合酵素的發(fā)酵工藝所得到的優(yōu)化工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證：取3批山藥、茯苓等5味藥食同源中藥的水提干浸膏（即2.2.3項(xiàng)下的干浸膏），加30倍純化水研磨分散成混懸水溶液，加入混懸水溶液體積10%的菌液，在溫度31℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min的條件下發(fā)酵72 h，將發(fā)酵液除菌后再冷凍干燥成干浸膏，測(cè)得總多糖百分含量為23.97%，RSD=1.843%（n=3），干浸膏得率為22.41%，RSD=1.972%，發(fā)酵工藝驗(yàn)證結(jié)果略高于正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)中的最高值，表明該工藝科學(xué)、合理、穩(wěn)定、可行。

2.4 山藥、茯苓復(fù)合酵素發(fā)酵前后總多糖百分含量對(duì)比分析

將山藥、茯苓復(fù)合酵素水提最優(yōu)工藝與發(fā)酵最優(yōu)工藝進(jìn)行總多糖含量對(duì)比分析。

山藥、茯苓復(fù)合酵素發(fā)酵前后總多糖百分含量對(duì)比分析見(jiàn)表9。

由表9可知，山藥、茯苓等5味藥食同源中藥，經(jīng)發(fā)酵后總多糖百分含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未經(jīng)發(fā)酵的水提物中的總多糖百分含量，是發(fā)酵前水提物中總多糖百分含量的2.725倍。

表9 山藥、茯苓復(fù)合酵素發(fā)酵前后總多糖百分含量對(duì)比分析

3 結(jié)論

（1）以總多糖百分含量和干浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化后的山藥茯苓復(fù)合酵素發(fā)酵工藝為發(fā)酵菌種植物乳酸桿菌，接種量10%，發(fā)酵溫度31℃，發(fā)酵時(shí)間72 h。山藥、茯苓水提液的最佳提取工藝為水提溫度95℃，加水量第1次為12倍，第2次為10倍，取時(shí)間第1次為2.0 h，第2次為1.5 h，超聲浸泡時(shí)間為0.5 h。在此工藝優(yōu)化條件下，山藥茯苓復(fù)合酵素的總多糖百分含量達(dá)23.97%是發(fā)酵前水提山藥、茯苓等5味藥食同源中藥最優(yōu)工藝總多糖百分含量（8.796%）的2.725倍。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)植物乳酸桿菌發(fā)酵制作的山藥茯苓復(fù)合酵素中降血脂活性成分總多糖百分含量比發(fā)酵前含量顯著增加，很可能增強(qiáng)了產(chǎn)品的降血脂功能，為后期降血脂功能試驗(yàn)提供理論依據(jù)，且同類研究未見(jiàn)報(bào)道。

（2）在預(yù)試驗(yàn)中，采用同一份樣品比較發(fā)酵前后總多糖百分含量測(cè)定結(jié)果就得知發(fā)酵后比發(fā)酵前總多糖含量高很多，但發(fā)酵前后的工藝皆未優(yōu)化，不能準(zhǔn)確闡述發(fā)酵前后總多糖百分含量的對(duì)比變化結(jié)果，故在正式試驗(yàn)時(shí)采用發(fā)酵前水提最優(yōu)工藝3批驗(yàn)證結(jié)果與發(fā)酵的最優(yōu)工藝3批驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行比較，即得到了最科學(xué)合理正確的總多糖百分含量對(duì)比結(jié)果。

（3）試驗(yàn)中僅采用了植物乳酸桿菌作為發(fā)酵菌種，未進(jìn)行多種菌種的比較是因?yàn)橹参锶樗釛U菌對(duì)植物性發(fā)酵原料具有較強(qiáng)的生物活性轉(zhuǎn)化能力、且安全無(wú)毒，發(fā)酵工藝成熟，便于掌握，故最初選用該菌種進(jìn)行預(yù)試，并且產(chǎn)生了預(yù)期的理想結(jié)果，故產(chǎn)品僅用植物乳酸桿菌作為發(fā)酵菌種。