鉤藤UHPLC指紋圖譜及化學(xué)模式識別研究

黃雯雯，王曉明，郭亞卿，韓立峰，黃宇虹，潘桂湘*

1天津中醫(yī)藥大學(xué) 天津市中藥化學(xué)與分析重點實驗室，天津 301617；2天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300250

2020版《中國藥典》收載的鉤藤，為茜草科植物鉤藤Uncariarhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil.、大葉鉤藤UncariamacrophyllaWall.、毛鉤藤UncariahirsutaHavil.、華鉤藤Uncariasinensis(Oliv.)Havil.或無柄果鉤藤UncariasessilifructusRoxb.的干燥帶鉤莖枝[1]。目前醫(yī)藥市場上流通的藥用鉤藤，主要為Uncariarhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil.鉤藤。鉤藤具有清熱平肝，息風(fēng)定驚的功效，可用于肝風(fēng)內(nèi)動、驚癇抽搐、高熱驚厥、感冒夾驚、小兒驚啼、妊娠子癇、頭痛眩暈等，臨床上常用于治療高血壓、心律失常、焦慮、癲癇等疾病[2-4]。鉤藤所含化學(xué)成分眾多，主要含有生物堿類、黃酮類、三萜類等成分[5-7]，其中生物堿被認(rèn)為是鉤藤降壓的主要藥效組分[8]。

中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化提供化學(xué)成分特征的色譜圖。就鉤藤藥材而言，不少學(xué)者已開展了一些有關(guān)鉤藤指紋圖譜的研究。例如Huang等[9-11]以鉤藤堿和異鉤藤堿為指標(biāo)成分，建立了不同產(chǎn)地鉤藤的HPLC色譜指紋圖譜，Tan等[12]針對鉤藤生物堿部位，建立了鉤藤的HPLC指紋圖譜。這些研究為深入評價鉤藤的質(zhì)量做出了有益的探索，但囿于研究的關(guān)注點主要集中于鉤藤堿、異鉤藤堿等少數(shù)生物堿成分，且只采用了單一的相似度評價，未對指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行更深層次的挖掘與探討，在準(zhǔn)確全面反映鉤藤內(nèi)在質(zhì)量方面尚有所不足。

為了更客觀、全面、高效地評價鉤藤藥材質(zhì)量，本實驗通過UHPLC建立了30批不同來源鉤藤的指紋圖譜研究，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件”標(biāo)定了15個共有峰，經(jīng)對照品比對，鑒定出了綠原酸、異帽柱木菲堿、異鉤藤堿、鉤藤堿、縫籽嗪甲醚、去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿7個共有峰。在指紋圖譜相似度評價基礎(chǔ)上，將指紋圖譜數(shù)據(jù)與化學(xué)計量學(xué)方法相結(jié)合，應(yīng)用基于化學(xué)計量學(xué)的聚類分析(cluster analysis，CA)、主成分分析(principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘-判別分析(orthogonal partial least squares analysis，OPLS-DA)等多元統(tǒng)計方法對鉤藤藥材質(zhì)量進(jìn)行分析評價，以篩選和識別鉤藤質(zhì)量差異的標(biāo)志性化合物，便于為有效控制鉤藤的質(zhì)量提供參考。

1 儀器和材料

1.1 儀器

Thermo Fisher UHPLC 3000超高效液相色譜儀；AX205型十萬分之一天平(Mettler Toledo，Switzerland)；KQ-300B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；3K15型高速離心機(jī)(美國Sigma公司)；XW-80A型渦旋混合器(上海滬西分析儀器廠)；Milli-Q超純水制備儀；粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司，天津，中國)。

1.2 試劑

乙腈、甲醇(色譜純，購于Fisher公司)；甲酸(色譜級，ROE公司)；超純水由Milli-Q超純水儀制備。對照品異帽柱木菲堿(批號：B33640)、異鉤藤堿(批號：B21526)、鉤藤堿(批號：B20453)、去氫毛鉤藤堿(批號：B21025)(上海源葉生物科技有限公司)；縫籽嗪甲醚(批號：DST190705)、毛鉤藤堿(批號：DST190617-009)、綠原酸(批號：DST181201-021)(成都德思特生物技術(shù)有限公司)；以上對照品純度均 ≥ 98%。

1.3 材料

30批不同來源的市售鉤藤收集于湖南、江西、貴州、廣西等地，所有樣品經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥教授鑒定，表1為不同來源鉤藤的具體信息。

表1 鉤藤樣品信息Table 1 Information of Uncariae Ramulus Cum Uncis

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱采用ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm × 100 mm，1.8 μm)，流動相：A相為0.1%甲酸-水，B相為乙腈，梯度洗脫，梯度程序為：0～22 min，5% B→18% B；22～37 min，18% B→25% B；37～47 min，25% B→35% B；47～50 min，35% B→55% B，流速為0.3 mL/min，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量為2 μL，檢測波長為254 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液制備

精密稱定異帽柱木菲堿、異鉤藤堿、鉤藤堿、縫籽嗪甲醚、去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿、綠原酸適量，分別加入甲醇制成濃度為1 mg/mL的對照品儲備液。精密移取各化合物儲備液適量，配制成混合對照品溶液，并置于4 ℃冰箱冷藏備用。

2.2.2 供試品溶液制備

取鉤藤藥材粉末(過三號篩)0.3 g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，精密加入75%甲醇定容至刻度線，超聲提取(功率250 W，頻率50 kHz)40 min，靜置至室溫后，加75%甲醇補足至刻度線，搖勻后濾過。濾液減壓濃縮至干，加入3 mL 75%甲醇復(fù)溶，14 000 rpm高速離心20 min，吸取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，并置于4 ℃冰箱冷藏備用。

2.3 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實驗

取同一批次樣品(S5)，按照“2.2.2”項制備供試品溶液，按照上文所述的色譜條件連續(xù)6次進(jìn)樣，以3號色譜峰為參照峰，可測得各個共有色譜峰的峰面積和相對保留時間，計算得到各共有峰相對保留時間的RSD均<0.28%，相對峰面積的RSD均<4.73%，結(jié)果表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜的要求。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗

取同一批次樣品(S5)，按照“2.2.2”項制備供試品溶液，按照上文所述的色譜條件分別在時間點0、2、4、8、12、24、48 h下分別進(jìn)樣，以3號色譜峰為參照峰，可測得各個共有色譜峰的峰面積和相對保留時間，計算得到各共有峰相對保留時間的RSD均< 0.37%，相對峰面積的RSD均< 3.96%，結(jié)果表明樣品放置于室溫48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗

取同一批次樣品(S5)6份，每份稱取0.3 g，按照“2.2.2”項制備供試品溶液，按照上文所述的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣，以3號色譜峰為參照峰，可測得各個共有色譜峰的峰面積和相對保留時間，計算得到各共有峰相對保留時間的RSD均<0.26%，相對峰面積的RSD均<4.97%，結(jié)果表明供試品制備方法重復(fù)性良好。

2.4 不同來源鉤藤UHPLC指紋圖譜建立

2.4.1 指紋圖譜的建立及相似度評價

分別稱定30批不同來源的鉤藤藥材，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，同時按照“2.1”項的色譜條件進(jìn)行測定，得到30批鉤藤藥材的UHPLC色譜指紋圖譜。采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2012版)”對所得數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析，將時間窗寬度設(shè)置為0.2 min以避免一些極端數(shù)據(jù)對于大部分?jǐn)?shù)據(jù)造成影響，選取中位數(shù)法作為色譜指紋圖譜的共有模式圖的生成方式，運用多點校正的方法進(jìn)行了校正，選取S5作為參照色譜圖，得到了相應(yīng)的鉤藤特征圖譜，和指紋圖譜共有模式對照圖見圖1，相似度評價結(jié)果見表2。30批不同來源鉤藤樣品中有29批樣品與對照指紋圖譜的相似度在0.919～0.995之間，僅S10樣品相似度為0.850，可見大部分藥材質(zhì)量比較接近。

表2 30批樣品與對照指紋圖譜相似度結(jié)果Table 2 Similarity results of 30 batches of Uncariae Ramulus Cum Uncis and control fingerprint

圖1 30批樣品指紋圖譜擬合及共有模式對照圖譜Fig.1 UHPLC fingerprints and reference fingerprint of 30 batches of Uncariae Ramulus Cum Uncis

2.4.2 特征峰的標(biāo)定

根據(jù)保留時間標(biāo)定特征指紋峰，對30批鉤藤UHPLC指紋圖譜測定結(jié)果進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)15個特征峰是30批鉤藤共有的，因此確定這15個峰為特征指紋峰。通過對照品比對，確定3號峰為綠原酸、7號峰為異帽柱木菲堿、8號峰為異鉤藤堿、10號峰為鉤藤堿、12號峰為縫籽嗪甲醚、13號峰為去氫毛鉤藤堿、14號峰為毛鉤藤堿。鉤藤藥材(S5為例)樣品和混合對照品的UHPLC圖譜見圖2。

圖2 鉤藤樣品(A)和混合對照品(B)的UHPLC圖譜Fig.2 UHPLC chromatograms of Uncariae Ramulus Cum Uncis (A) and mixed standards (B)注：3：綠原酸；7：異帽柱木菲堿；8：異鉤藤堿；10：鉤藤堿；12：縫籽嗪甲醚；13：去氫毛鉤藤堿；14：毛鉤藤堿。Note:3:Chlorogenic acid;7:Isomitraphylline;8:Isorhynchophylline;10:Rhynchophylline;12:Geissoschizine methylether;13:Hirsuteine;14:Hirsutine.

2.4.3 聚類分析

以鉤藤樣品中15個共有峰的相對峰面積為變量，得到30×15原始數(shù)據(jù)矩陣，運用SPSS 24.0分析軟件，采用組間聯(lián)接法結(jié)合歐式距離平方對樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。當(dāng)分類距離為20時，S10樣品為一類，其余樣品聚為一大類；當(dāng)分類距離為5時，S10樣品為一類，S20樣品為一類，S1、S6、S14、S15、S22、S29樣品聚為一類，S9、S12、S16、S17樣品聚為一類，其余樣品聚為一大類。

圖3 鉤藤樣品聚類分析樹狀圖Fig.3 Dendrogram of cluster analysis of 30 batches of Uncariae Ramulus Cum Uncis

2.4.4 主成分分析與正交偏最小二乘-判別分析

將指紋圖譜中所得到的30 批鉤藤樣品共有峰的峰面積導(dǎo)入SIMCA14.1軟件繪制主成分分析得分圖，Par作為標(biāo)度化方式(見圖4)。PCA結(jié)果與聚類分析基本一致。在載荷散點圖中(見圖5)，每一個點代表一個色譜峰，其在坐標(biāo)系中距離原點(0，0)距離的遠(yuǎn)近，表明該成分對樣品分類的貢獻(xiàn)的作用程度。其中1號、3(綠原酸)、6號、7(異帽柱木菲堿)、9號、12(縫籽嗪甲醚)、14號(毛鉤藤堿)號色譜峰在坐標(biāo)系中的絕對值較大，表明這幾個成分對樣品整體分布起主要影響。

圖4 30批樣品主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis plot of 30 batches of Uncariae Ramulus Cum Uncis

圖5 30批樣品主成分載荷圖Fig.5 Loading plot of 30 batches of Uncariae Ramulus Cum Uncis

為進(jìn)一步篩選出對上述樣品分類貢獻(xiàn)較大的成分，采用正交偏最小二乘判別分析結(jié)合變量投影重要度(variable importance for the projection，VIP)，以VIP > 1.0為篩選標(biāo)準(zhǔn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，共得到貢獻(xiàn)相對較大的5個變量色譜峰(見圖6)。按照變量投影重要度值大小依次為3號峰(綠原酸，VIP=2.172 3)> 12號峰(縫籽嗪甲醚，VIP=1.476 4)> 1號峰(VIP=1.227 9)> 9號峰(VIP=1.141 5)> 7號峰(異帽柱木菲堿，VIP=1.138 3)。該結(jié)果與主成分載荷圖分析結(jié)果大體一致，提示這幾個成分是樣品之間產(chǎn)生差異的主要原因，具有一定的標(biāo)志性作用。為了更加全面、高效地評價藥物質(zhì)量，在以后對鉤藤的研究中，應(yīng)對上述成分引起關(guān)注。

圖6 30批鉤藤樣品各成分VIP圖Fig.6 VIP diagram of various constituents of 30 batches of Uncariae Ramulus Cum Uncis

3 討論

3.1 供試品溶液制備方式和色譜條件優(yōu)化

本研究分別考察了藥材提取時間(超聲20、40、60 min)、提取溶劑(100%、75%、50%甲醇和100%、75%、50%乙醇)、色譜柱(ACQUITY UPLC HSS T3、Cortecs UPLC T3、Cortecs UPLC C18和ACQUITY UPLC BEH C18)、不同的流動相體系(甲醇-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液)對色譜峰數(shù)量及分離情況的影響，最終確定75%甲醇超聲提取40 min作為供試品制備方法，色譜柱選用ACQUITY UPLC HSS T3，以乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫。同時考察了254、274、366 nm等不同的檢測波長，發(fā)現(xiàn)254 nm處的色譜圖峰較多且分離度良好。

3.2 市售鉤藤的指紋圖譜一致性比較

2020版中國藥典對鉤藤藥材的質(zhì)量控制，以異鉤藤堿為指標(biāo)成分采用TLC法進(jìn)行定性鑒別。該法操作較為繁瑣、靈敏度較低，要對鉤藤的質(zhì)量進(jìn)行較全面的控制較為困難。本研究首先對30批不同市售來源的鉤藤建立指紋圖譜進(jìn)行相似度評價，隨后對其進(jìn)行化學(xué)模式識別研究。經(jīng)相似度評價軟件計算，結(jié)果顯示30批鉤藤藥材相似度在0.850～0.995之間；指紋圖譜共確定15個共有峰，經(jīng)過對照品的比對指認(rèn)了7個化學(xué)成分，分別為綠原酸、異帽柱木菲堿、異鉤藤堿、鉤藤堿、縫籽嗪甲醚、去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿。綠原酸具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降血脂、降壓等[13,14]廣泛的藥理作用；異帽柱木菲堿對人淋巴細(xì)胞白血病T細(xì)胞具有抗增殖作用[15]；異鉤藤堿和鉤藤堿是鉤藤治療高血壓的主要活性成分[16]；縫籽嗪甲醚為有效的5-HT1A受體的激動劑，是傳統(tǒng)日藥抑肝散的主要成分[17,18]；去氫毛鉤藤堿是神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的有效成分[19]；毛鉤藤堿具有抗癌作用[20]，在體外可抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞活力，并誘導(dǎo)DNA損傷反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)[21]。采用無監(jiān)督的聚類分析、主成分分析進(jìn)一步將30批樣品分為不同組別，在對鉤藤藥材品質(zhì)一致性評價的同時進(jìn)行差異性評價；并通過正交偏最小二乘判別分析篩選對樣品分組影響較大的色譜峰。通過指紋圖譜相似度評價和模式識別方法相結(jié)合，我們發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致批次間差異的主要是1、3(綠原酸)、7(異帽柱木菲堿)、9、12(縫籽嗪甲醚)這幾個成分引起的，提示在對鉤藤藥材質(zhì)量進(jìn)行評價時應(yīng)重點關(guān)注這幾個差異成分。1號、9號色譜峰，有必要結(jié)合質(zhì)譜、核磁等技術(shù)或采用相關(guān)對照品，進(jìn)一步加以指認(rèn)。

4 結(jié)論

采用化學(xué)模式識別技術(shù)結(jié)合指紋圖譜的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可以更加客觀完整的評價中藥的真?zhèn)闻c優(yōu)劣。本實驗采用指紋圖譜相似度評價和化學(xué)模式識別技術(shù)相結(jié)合的方法對不同來源的鉤藤進(jìn)行研究，與已有僅以含量測定或指紋圖譜的品質(zhì)評價與質(zhì)量控制方法相比，不僅可有效評價鉤藤藥材品質(zhì)的一致性，同時還可闡明鉤藤藥材品質(zhì)差異形成的主要因素，因而為鉤藤的品質(zhì)評價與質(zhì)量控制提供了更為豐富的信息，為鉤藤的質(zhì)量控制和后續(xù)開發(fā)提供了一定參考。