引起部分奶牛場(chǎng)呼吸道疾病的主要病毒性病原檢測(cè)

畢玉彧，宋麗麗，王冬鳴，薛 原，宋曉飛，張連秀，李金波

（1.齊魯動(dòng)物保健品有限公司，山東濟(jì)南 250105；2.山東省重大動(dòng)物疫病新獸藥創(chuàng)制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250105；3.天津市北辰區(qū)畜牧獸醫(yī)局，天津 300400）

牛呼吸道疾病綜合征（bovine respiratory disease complex，BRDC）是嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)的一類疾病，其主要病毒性病原包括牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）以及牛副流感病毒3型（bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3）[1]。研究[2]表明，BRDC是奶牛場(chǎng)中最常見的一類疾病，全球約46%的犢?；加蠦RDC，嚴(yán)重影響?zhàn)B牛業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。其中IBRV、BVDV對(duì)牛的影響主要體現(xiàn)在經(jīng)濟(jì)效益方面，可導(dǎo)致感染牛生產(chǎn)性能下降，如增重減緩、產(chǎn)奶量下降、流產(chǎn)率升高等[3-4]，嚴(yán)重時(shí)，可造成感染牛死亡。IBRV、BVDV感染牛后均可導(dǎo)致免疫抑制與持續(xù)性感染，且易發(fā)生混合感染[5-6]，給奶牛場(chǎng)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失與防疫壓力[7-8]。BPIV3又稱運(yùn)輸熱，單獨(dú)感染時(shí)癥狀較輕，但易與IBRV、BVDV等發(fā)生混合感染[9]。

近年來，我國(guó)東北地區(qū)以及山東、河北、天津、甘肅等?。ㄊ校┠膛?chǎng)相繼發(fā)生了以流黏性鼻液為主的呼吸道疾病，且排除了牛支原體、牛巴氏桿菌感染可能，由此懷疑由牛呼吸道病毒引起。本研究通過采集相關(guān)樣品，對(duì)發(fā)生呼吸道癥狀的奶牛場(chǎng)進(jìn)行IBRV、BVDV、BPIV3 PCR檢測(cè)，并將抗原檢測(cè)結(jié)果與奶牛場(chǎng)發(fā)病情況進(jìn)行分析，以期為奶牛場(chǎng)呼吸道疾病防控提供依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品來源

2018—2019年，在山東、河北、甘肅和天津4?。ㄊ校┑?家發(fā)生流黏性鼻液的奶牛場(chǎng)，采集發(fā)病牛與無癥狀牛鼻拭子298份，具體信息如下（表1）。

表1 奶牛場(chǎng)信息 單位：份

1.2 相關(guān)毒株及試劑

1.2.1毒株 IBRV、BVDV、BPIV3陽(yáng)性毒株，均由齊魯動(dòng)物保健品有限公司分離、鑒定并保存。

1.2.2試劑 2×TaqPlus MasterMix（Dye），購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；一步法RT-PCR試劑，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；核酸提取或純化試劑，為杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，購(gòu)自Gibco公司。

2 方法

2.1 鼻拭子采集

使用長(zhǎng)桿無菌棉拭子深入牛鼻腔內(nèi)部，貼近黏膜旋轉(zhuǎn)多圈，然后將棉拭子放入DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（含10%新生牛血清以及10萬IU青鏈霉素）中，低溫運(yùn)輸，充分振蕩后2 500g/min離心5 min，取上清液過濾備用。

2.2 引物來源與PCR檢測(cè)

參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[10-11]與學(xué)位論文[12]設(shè)計(jì)PCR檢測(cè)引物（表2），并送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。對(duì)鼻拭子樣品使用核酸自動(dòng)提取儀提取DNA/RNA，然后進(jìn)行IBRV/BVDV/BPIV3 PCR檢測(cè)，同時(shí)設(shè)立陰、陽(yáng)性對(duì)照。

表2 引物信息

3 結(jié)果

3.1 鼻拭子PCR檢測(cè)

結(jié)果（表3）顯示：5家奶牛場(chǎng)IBRV、BVDV陽(yáng)性率分別為28.9%、7.1%，BPIV3未檢出。其中發(fā)病牛IBRV陽(yáng)性率為42.6%，無癥狀牛IBRV陽(yáng)性率為10.9%；發(fā)病牛BVDV陽(yáng)性率為11.3%，無癥狀牛BVDV陽(yáng)性率為1.6%。

表3 鼻拭子PCR檢測(cè)結(jié)果 %

3.2 IBRV、BVDV混合感染情況

結(jié)果（表4）顯示，5家奶牛場(chǎng)IBRV、BVDV混合感染率為5.7%。其中IBRV、BVDV混合感染占IBRV總感染數(shù)的19.8%，占BVDV總感染數(shù)的81.0%。

表4 IBRV、BVDV混合感染情況 %

4 討論

5家奶牛場(chǎng)出現(xiàn)以流黏性鼻液為主的臨床癥狀后，進(jìn)行了牛支原體與牛巴氏桿菌檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，因此懷疑與牛呼吸道相關(guān)病毒有關(guān)，故采集部分發(fā)病牛與無癥狀牛鼻拭子樣品開展相關(guān)病毒核酸PCR檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)病牛部分鼻拭子樣品為IBRV和/或BVDV陰性，也存在無癥狀牛鼻拭子樣品IBRV和/或BVDV核酸陽(yáng)性情況。推測(cè)其原因可能為：一是牛感染病毒后排毒期與表現(xiàn)臨床癥狀期不對(duì)應(yīng)[13-14]，出現(xiàn)“發(fā)病牛有臨床癥狀但不排毒以及無癥狀牛無臨床癥狀但排毒”情況；二是IBRV、BVDV均具有隱性感染特性，在病毒處于休眠時(shí)患畜不排毒，當(dāng)動(dòng)物受到應(yīng)激后排毒，而此時(shí)臨床癥狀還未表現(xiàn)，可導(dǎo)致無癥狀牛鼻拭子檢測(cè)呈陽(yáng)性；三是與牛個(gè)體情況、牛場(chǎng)環(huán)境因素有關(guān)[15]。

IBRV是導(dǎo)致奶牛流黏性鼻液的主要病原，且鼻液中含毒量高，因此本研究中IBRV檢出率高于BVDV。BVDV雖然也可引起牛呼吸道癥狀，但不是主要病因，更多時(shí)候起輔助其他病原侵襲動(dòng)物機(jī)體作用。BPIV3在奶牛發(fā)生應(yīng)激時(shí)易感，如天氣驟變、長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)?，本試?yàn)中奶牛未經(jīng)歷明顯應(yīng)激活動(dòng)，這也是BPIV3未檢出的原因之一。研究表明，牛感染BVDV后由于免疫力下降，更易感染IBRV[16]，這與本試驗(yàn)中IBRV、BVDV混合感染占BVDV感染比率較高相一致。當(dāng)感染BVDV牛繼發(fā)感染IBRV后，可加速IBRV在牛群中傳播。

此外，奶牛場(chǎng)疾病防控的難點(diǎn)之一是BVDV持續(xù)感染（persistently infected，PI）牛的存在。雖然大部分PI牛由于免疫抑制、發(fā)育遲緩等原因過早死亡或淘汰，但仍有部分PI牛存活并長(zhǎng)期散毒，導(dǎo)致其成為奶牛場(chǎng)中BVDV的主要傳染源[17]，為奶牛場(chǎng)混合感染其他病原提供了條件。

有文獻(xiàn)[18]指出，我國(guó)不同地區(qū)IBRV感染率為5%～88%，平均感染率由2013年的32%提高至目前的43%，這說明IBRV在我國(guó)不同地區(qū)流行廣泛且呈上升趨勢(shì)，牛群感染IBRV的風(fēng)險(xiǎn)不斷增大。由于IBRV引起的臨床癥狀相對(duì)輕微，奶牛場(chǎng)對(duì)IBRV危害普遍認(rèn)識(shí)不足，尤其是沒有從繼發(fā)感染、流產(chǎn)率升高、產(chǎn)奶量下降等方面考慮其危害，因此相關(guān)防控措施不到位，IBRV感染常發(fā)，再連同牛群BVDV感染等因素，加重了牛場(chǎng)疫病的流行與經(jīng)濟(jì)損失。此外，本研究中5家奶牛場(chǎng)臨床癥狀相似，但不同奶牛場(chǎng)不同病原陽(yáng)性率有差別（比如奶牛場(chǎng)C、E）。推斷除排毒期與表現(xiàn)臨床癥狀期不對(duì)應(yīng)之外，也存在除IBRV、BVDV以外其他病原體的可能，如牛呼吸道合胞體病毒（bovine respiratory syncytial virus，BRSV）以及其他病原體等，這還需進(jìn)一步檢測(cè)研究。因此，奶牛場(chǎng)在日常做好IBRV、BVDV、BPIV3抗原檢測(cè)及PI牛檢測(cè)與淘汰外，也必須重視BRSV等其他病原檢測(cè)，避免混合感染發(fā)生，最大限度降低奶牛場(chǎng)呼吸道疾病造成的危害。