2020年秋冬季四川省內(nèi)江市無害化處理病死豬5種病毒核酸檢測

雷明霞，徐 凱，彭 娟，李 梅，蔣 凜，余 姣

（內(nèi)江市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川內(nèi)江 641000）

當(dāng)前，豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟、豬圓環(huán)病毒病、豬偽狂犬病是豬群中最常發(fā)生且危害較為嚴(yán)重的傳染病[1]，臨床上非典型和多病原混合感染現(xiàn)象較為普遍[2-5]，制約著豬養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。本研究采用熒光PCR/RT-PCR方法，以無害化處理收集點(diǎn)的病死豬為檢測對象，進(jìn)行豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環(huán)病毒（PCV-2和PCV-3）、豬偽狂犬病病毒（PRV）5種病原的核酸檢測，旨在了解內(nèi)江市秋冬季病死豬群中這5種病毒的感染情況，以期為該市豬病防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

在內(nèi)江市5個(gè)轄區(qū)的無害化處理收集點(diǎn)，每天采集1～2個(gè)收集點(diǎn)，根據(jù)采樣當(dāng)日無害化收集量及死豬來源，每個(gè)來源點(diǎn)隨機(jī)采集3頭（不足3頭全采）病死豬組織病料（腹股溝淋巴結(jié)）。其中：秋季于2020年10月21—26日，在10個(gè)無害化處理收集點(diǎn)，共采集58份樣品，來源于22個(gè)規(guī)模場和7個(gè)散養(yǎng)戶；冬季于2020年12月1—7日，在14個(gè)無害化處理收集點(diǎn)，共采集50份樣品，來源于18個(gè)規(guī)模場和5個(gè)散養(yǎng)戶。采集的108份樣品信息詳見表1。

表1 內(nèi)江市秋冬季無害化處理病死豬樣品采集信息統(tǒng)計(jì)

1.2 樣品前處理

從每份組織病料（腹股溝淋巴結(jié)）的3個(gè)位置取樣品共約1 g，用眼科剪剪碎混勻后裝入2 mL無酶離心管中；在全自動(dòng)組織研磨儀中，加入1 mL PBS和金屬研磨珠研磨2 min；待勻漿后，置于高速冷凍離心機(jī)8 000 r/min離心2 min；取上清液600 μL于1.5 mL滅菌離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑來源

TGuide磁珠法病毒RNA/DNA提取試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司（批號U8319）和西安天隆科技有限公司（批號20011710T913）；PRRSV和CSFV雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測試劑盒（批號PRRSV&CSFV20200922P），購自哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司；PCV-2和PCV-3型雙重?zé)晒釶CR檢測試劑盒（批號040332002）、PRV-gE基因熒光PCR檢測試劑盒（批 號040042006），均購自青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心。

1.4 主要儀器設(shè)備

旋渦混勻器、單道微量移液器（德國Brand公司）、Ⅱ級生物安全柜（賽默飛世爾科技中國有限公司）、熒光定量PCR儀（Bio-Rad Laboratories Inc）、全自動(dòng)組織研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）、高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技中國有限公司）。

1.5 檢測方法

1.5.1DNA/RNA抽提 參照磁珠法病毒RNA/DNA提取試劑盒說明書，在第1孔加入20.0 mL蛋白酶K和200.0 mL樣品，執(zhí)行DP604-Virus或VIRUS RNA/DNA程序進(jìn)行DNA/RNA抽提；抽提完畢后，在第5孔/第6孔取出RNA/DNA，用封板膜封好置于-20 ℃環(huán)境中備用。

1.5.2熒光PCR/RT-PCR擴(kuò)增 PRRSV/CSFV反應(yīng)體系：無菌無核酸酶水5.6 μL、RT-PCR反應(yīng)液12.5 μL、酶混合液1.0 μL、熒光探針3.9 μL。在反應(yīng)管中分別加入反應(yīng)體系23.0 μL和DNA/RNA模板2.0 μL，做好標(biāo)記，輕彈混勻并瞬時(shí)離心；將反應(yīng)管置于熒光PCR儀中，分別選擇FAM通道和HEX通道進(jìn)行如下反應(yīng)：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，循環(huán)40次，每次在循環(huán)第2步（60 ℃ 35 s）收集熒光信號。PCV-2/PCV-3/PRV反應(yīng)體系：將引物探針和酶反應(yīng)液瞬時(shí)離心后，將1 000.0 μL酶反應(yīng)液全部移至引物探針管中，顛倒混勻6次，充分混勻，配制成50份PCR反應(yīng)液。根據(jù)樣品量，在每個(gè)反應(yīng)管中各加入反應(yīng)體系20.0 μL，再分別加入5.0 μL樣品DNA/RNA模板和陰陽性對照模板，做好標(biāo)記，輕彈混勻并瞬時(shí)離心；將反應(yīng)管置于熒光PCR儀中，分別選擇FAM通道和HEX通道進(jìn)行如下反應(yīng)：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，循環(huán)40次，每次在循環(huán)第2步（60 ℃20 s）收集熒光信號。

1.6 結(jié)果判定

根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行結(jié)果判定。PRRSV/CSFV：陽性對照Ct ≤30并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，陰性對照無Ct值并且無特定擴(kuò)增曲線，試驗(yàn)結(jié)果成立；被檢樣品FAM熒光信號Ct ≤30并出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判為PRRSV核酸陽性；被檢樣品HEX熒光信號Ct ≤30并出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判為CSFV核酸陽性；若被檢樣品病毒含量較低，30 ＜Ct ＜36并出現(xiàn)特定擴(kuò)增曲線，判為可疑，需重新提取樣本后進(jìn)行擴(kuò)增，若仍為疑似，則判為陽性，其余為陰性。PCV-2/PRV-gE/PCV-3：陽性對照Ct ≤35并出現(xiàn)特異擴(kuò)增曲線，陰性對照無Ct值并且無特定擴(kuò)增曲線，試驗(yàn)結(jié)果成立；被檢樣品FAM熒光信號Ct ≤38并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，判為PCV-2/PRV-gE核酸陽性；被檢樣品HEX熒光信號Ct ≤38并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，判為PCV-3核酸陽性，其余為陰性。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)樣品數(shù)及檢測結(jié)果，采用Office Excel 2007軟件計(jì)算陽性率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同病種

不同病種統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表2）顯示：PCV-2和PRRSV陽性檢出率較高，樣品陽性檢出率分別為44.4%和33.3%，場戶陽性檢出率分別為46.2%和34.6%；其次是PCV-3和CSFV，樣品陽性檢出率分別為12.9%和7.4%，場戶陽性檢出率分別為11.5%和7.7%；未檢出PRV。

表2 秋冬季5種病毒核酸陽性檢出率統(tǒng)計(jì)結(jié)果 %

2.2 不同來源場點(diǎn)

不同來源場點(diǎn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表3）顯示：規(guī)模場的PRRSV、CSFV、PCV-3場戶陽性檢出率高于散養(yǎng)戶，其中PRRSV和CSFV未在散養(yǎng)戶中檢出；散養(yǎng)戶的PCV-2場戶陽性檢出略高于散養(yǎng)戶。

表3 秋冬季不同來源場點(diǎn)的場戶病原陽性統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3 混合感染情況

混合感染統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表4）顯示，檢測樣品的混合感染率為20.4%，其中二重感染率為18.5%，主要是“PCV-2+PRRSV”“PCV-2+PCV-3”；三重感染率為1.9%，為“PCV-2+PRRSV+PCV-3”。

表4 檢測樣品多病原混合感染陽性率統(tǒng)計(jì)結(jié)果 %

2.4 不同生長階段

不同生長階段統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表5）顯示，CSFV陽性主要在保育階段被檢出，PRRSV、PCV-2、PCV-3陽性主要在育肥階段被檢出。

表5 豬只不同生長階段病原陽性樣品占比分布 %

3 討論

3.1 CSFV

本次檢測從4個(gè)不同規(guī)模養(yǎng)殖場檢出CSFV，樣品陽性檢出率為7.4%，與四川省南充市（臨床病料，9.21%）[6]、四川省綿陽市（病死豬組織，5.71%）[7]的檢測結(jié)果類似，表明四川省實(shí)施的豬瘟過渡期政策取得較好的防控效果，尤其是散養(yǎng)戶中未檢出陽性。本次檢出的CSFV陽性病料主要來源于保育仔豬。這可能同母源抗體衰減、免疫失敗或注射疫苗后抗體未及時(shí)起效有關(guān)。因此，應(yīng)加強(qiáng)母源抗體監(jiān)測，及時(shí)注射豬瘟疫苗，加強(qiáng)疫苗運(yùn)輸、貯存管理，強(qiáng)化疫苗免疫技術(shù)培訓(xùn)。

3.2 PRRSV

本次檢測從18個(gè)不同規(guī)模養(yǎng)殖場中檢出PRRSV，樣品陽性檢出率為33.3%，高于南充市（臨床病料，17.11%）[6]、遂寧市（病死豬組織，22.22%）[7]等四川省內(nèi)其他地區(qū)，表明四川省部分地區(qū)PRRSV感染現(xiàn)象較為普遍。PRRSV在哺乳、育肥兩個(gè)年齡段均有檢出，其中在育肥階段檢出最多。經(jīng)進(jìn)一步調(diào)查發(fā)現(xiàn)，75%（12/16）的養(yǎng)豬場未免疫PRRSV疫苗，故應(yīng)重視疫苗免疫，加強(qiáng)病原和抗體檢測，推進(jìn)PRRSV凈化。散養(yǎng)戶中未檢出PRRSV，這可能跟飼養(yǎng)方式及飼養(yǎng)環(huán)境和密度有關(guān)。

3.3 PCV-2

PCV-2主要侵害豬免疫系統(tǒng)造成免疫抑制，對豬危害極大，已被證實(shí)能引起包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、皮炎腎病綜合征（PDNS）、呼吸道綜合征、仔豬先天性震顫、母豬繁殖障礙等一系列病癥[8-9]?，F(xiàn)臨床上多采用全病毒滅活苗或亞單位疫苗在仔豬斷奶后免疫[10]，起到一定的防控效果[11]。本次檢測發(fā)現(xiàn)，PCV-2樣品陽性檢出率為44.4%，與四川省巴中市和樂山市（病死豬組織，40%）的檢測結(jié)果類似[7]，表明豬群中PCV-2感染極為普遍。內(nèi)江市散養(yǎng)戶PCV-2檢出率略高于規(guī)模場，且在豬只保育和育肥階段均有檢出，其中育肥階段尤其嚴(yán)重，占比91.3%，多呈混合感染狀態(tài)。這可能是因?yàn)椴糠忠?guī)模場和散養(yǎng)戶防疫意識不到位，基本沒有進(jìn)行PCV-2免疫；PCV-2陽性檢出多在豬只育肥后期，說明僅在斷奶后免疫1次PCV-2疫苗，不足以保護(hù)育肥階段豬只免受PCV-2侵襲。由此建議，可根據(jù)抗體水平衰減情況，在育肥階段加強(qiáng)免疫1次。此外，PCV-2存活力極強(qiáng)，在75 ℃加熱15 min后仍具有傳染性[12]，因此應(yīng)注意合理采取消毒滅源措施。

3.4 PCV-3

PCV-3是2016年在美國首次報(bào)道被檢出的新型圓環(huán)病毒[13]，隨后在國內(nèi)也檢測到[14-15]。PCV-3感染可引起心臟、呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等多系統(tǒng)炎癥[16-17]。此次檢測的陽性檢出率為12.9%，與南充市（病死豬組織，10.53%）[6]、資陽市（病死豬組織，15%）和樂山市（病死豬組織，10%）[7]的檢測結(jié)果類似，說明PCV-3零星存在。內(nèi)江市規(guī)模場PCV-3陽性率略高于散養(yǎng)，主要在育肥階段檢出，這可能跟地域分布、飼養(yǎng)環(huán)境和密度以及豬只對疫病的抵抗力有關(guān)。此外，該病毒在環(huán)境中廣泛存在，且具備跨種傳播能力[18]，需引起重視。

3.5 PRV

PRV是豬偽狂犬病病原，為自然疫源性病原[19]，主要引起神經(jīng)和呼吸系統(tǒng)方面的疾病[20]。此次在內(nèi)江市豬群中未檢測到PRV野毒感染，與四川省13個(gè)地區(qū)病死豬組織檢出率為0[7]的結(jié)果一致，說明PRV-gE基因缺失苗免疫取得了較好的防控效果，為后續(xù)豬偽狂犬病凈化起到積極的推動(dòng)作用。此外，動(dòng)物疫病發(fā)生是一個(gè)動(dòng)態(tài)的發(fā)展過程，因此內(nèi)江市仍需要持續(xù)加強(qiáng)PRV檢測，實(shí)時(shí)掌握其感染情況。

3.6 混合感染

本次檢測結(jié)果表明，內(nèi)江市存在PRRSV、PCV-2、PCV-3和CSFV這4種病原的混合感染，混合感染率為20.4%，其中雙重和三重感染率分別為18.5%和1.9%，同四川瀘州、遂寧、資陽、廣安等13個(gè)市（28.67%）[7]、南充市（13.82%）[6]檢測結(jié)果類似，表明雙重感染現(xiàn)象普遍存在。其中雙重混合感染以“PRRSV+PCV-2”“PCV-2+PCV-3”為主。PCV-2、PRRSV可引起機(jī)體免疫抑制[21]，導(dǎo)致對原發(fā)性和繼發(fā)性病原體感染的易感性增加[22]，進(jìn)而增加發(fā)病率和死亡率。所以單靠疫苗免疫來實(shí)現(xiàn)疫病防控是不夠的，應(yīng)從豬場生物安全管理角度出發(fā)進(jìn)行疫病綜合防控，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)疫病凈化。

4 結(jié)論

檢測發(fā)現(xiàn)，四川省內(nèi)江市病死豬群中PRRSV、PCV-2感染較為嚴(yán)重，PCV-3零星分布，且呈現(xiàn)一定的混合感染狀態(tài)，而CSFV和PRV感染得到有效控制。因此，應(yīng)加強(qiáng)PRRSV、PCV-2、PCV-3感染的監(jiān)測與控制。