lncRNA CASC9和miR?758?3p在肝細(xì)胞肝癌血清中的表達(dá)及診斷價(jià)值

陸秀琴 葛國(guó)洪 潘洪秋 王健

1上海健康醫(yī)學(xué)院（上海201318）；2鎮(zhèn)江市第三人民醫(yī)院肝病科（江蘇鎮(zhèn)江212021）；3上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院移植科（上海200082）

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是高度致命的惡性腫瘤，是全世界與癌癥相關(guān)死亡的第四大原因［1］，且其發(fā)病率還在呈增加的趨勢(shì)［2］。由于早期缺乏特異性的臨床癥狀，大多數(shù)HCC患者確診時(shí)已處于晚期，錯(cuò)過了進(jìn)行根治性治療的最佳時(shí)機(jī)，這類患者即使積極進(jìn)行了各種治療，其總體的預(yù)后情況依然很差［3］。目前檢測(cè)血清中甲胎蛋白（α?fetoprotein，AFP）的表達(dá)是HCC早期篩查的重要方法，但是分化成熟的肝細(xì)胞增生也可合成AFP，AFP 在肝硬化、肝炎等肝臟損傷所致肝細(xì)胞代償性增生的情況下會(huì)分泌增多，因此AFP 對(duì)HCC 的診斷價(jià)值還有待進(jìn)一步提升［4］。研究報(bào)道長(zhǎng)鏈非編碼RNA 腫瘤易感候選者9（long non?coding RNA cancer susceptibility candidate 9，lncRNA CASC9）在HCC 患者血清中高表達(dá)與患者不良病理分期相關(guān)［5］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non?coding RNA，lncRNA）調(diào)控惡性腫瘤進(jìn)展的重要分子機(jī)制是作為微小RNA（microRNA，miRNA）的內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）發(fā)揮重要作用［6］。HU 等［7］報(bào)道在卵巢癌中l(wèi)ncRNA CASC9 通過抑制miR?758?3p 的水平促進(jìn)卵巢癌的生長(zhǎng)。研究報(bào)道m(xù)iR?758?3p 可以抑制HCC 患者細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力［8］。從肥胖到代謝綜合癥的進(jìn)展過程中，miR?758?3p 具有作為一種基于血液的生物標(biāo)記物的潛力［9］。而miR?758?3p 在HCC 患者血清中表達(dá)的意義未知。本研究旨在分析HCC 患者血清中l(wèi)ncRNA CASC9 和miR?758?3p的表達(dá)及其與患者臨床病理特征的關(guān)系，并探討了兩者聯(lián)合AFP 能否提高對(duì)HCC 早期診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2018年6月至2020年2月于鎮(zhèn)江市第三人民醫(yī)院行手術(shù)治療或者穿刺診斷的HCC 患者72 例，將其納入到HCC 組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）入組前未經(jīng)放化療或者靶向等治療，術(shù)后或者穿刺病理確診為HCC；（2）臨床資料完整；（3）患者對(duì)本次研究?jī)?nèi)容知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并有肺癌、卵巢癌等其他惡性腫瘤者；（2）合并自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病者；（3）妊娠或哺乳期婦女?；颊吣挲g33～79歲，平均年齡（56.62±15.30）歲，＞56 歲者40 例，≤56 歲者32 例；男49 例，女23 例；腫瘤大?。海? cm 26 例，≤5 cm 46 例；肝硬化：有46 例，無26 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例；TNM分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期20例，Ⅲ期16例，Ⅳ期9 例；血清AFP（ng/mL）：＞200 為41 例，≤200為31 例。

選擇同期于我院行健康體檢人員30 例作為健康對(duì)照組，年齡28～72 歲，平均（55.08 ± 16.88）歲。男18 例，女12 例。所有患者均簽署書面知情同意書，本研究已得到我院倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)，且遵循赫爾辛基宣言。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器無RNA 酶PCR 管、EP 管和槍頭等購(gòu)于美國(guó)KIRGEN 公司；血清RNA 提取試劑盒購(gòu)于德國(guó)QIAGEN 公司；DEPC 水購(gòu)于北京索萊寶試劑公司；lncRNA CASC9、miR?758?3p 和內(nèi)參U6 引物購(gòu)于美國(guó)invitrogen 公司；ULtraRT one step RT?PCR 試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博；Nanodrop2000購(gòu)于美國(guó)Thermo 公司；7500 熒光定量PCR 儀購(gòu)于美國(guó)BIO?RAD 公司。

1.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real?time quanti?tative polymerase chain reaction，qRT?PCR）抽取納入研究患者的靜脈血4 mL，室溫靜置2 h 左右至血液完全凝固及分層后，以2 500 r/min 離心10 min。可見液體分為兩層，將上層上清液1 mL左右吸至EP 管中，放于液氮中保存?zhèn)溆?。將收集的血清加至QIAzol 裂解液中溶解，加入氯仿溶液，混勻后低溫高速離心30 min，可見液體分成水相和有機(jī)相。RNA 位于上層水相，將上層上清液移至新的EP 管中，加入無水乙醇后經(jīng)RNeasy MinElute離心柱過濾、DEPC 水洗脫后獲得血清中總RNA。采用Nanodrop2000 測(cè)得RNA 濃度，放于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

按照ULtraRT one step RT?PCR 試劑盒說明書進(jìn)行試劑的配制，RNA 質(zhì)量為1 μg（按照濃度計(jì)算體積）、2×Ultra RT one step Buffer 12.5 μL、上下游引物各1 μL、Ultra RT one step EnzymeMix 0.5 μL、無RNA 酶的雙蒸水補(bǔ)足25 μL。45 ℃30 min 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，變性退火延伸共40個(gè)循環(huán)，終延伸72 ℃5 min。采用2?ΔΔCt法以GAP?DH 基因?yàn)閮?nèi)參計(jì)算lncRNA CASC9 和miR?758?3p的相對(duì)表達(dá)量。

lncRNA CASC9 引物F：5′?TTGGTCAGCCACA?TTCATGGT?3′，R：5′?AGTGCCAATGACTCTCCAGC?3′，以GAPDH 為內(nèi)參，GAPDH 引物F：5′?GCACC?GTCAAGGCTGAGAAC?3′，R：5′?TGGTGAAGACGC?CAGTGGA?3′；miR?758?3p 引物F：5′?ACACTCCAG?CTGGGTTTGTGACCTGGTCCA?3′，R：5′?CTCAACT?GGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGTTAG?TG?3′，以U6 為內(nèi)參，U6 引物F：5′?CTCGCTTCGGC?AGCACA?3′，R：5′?AACGCTTCACGAATTTGCGT?3′。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 23.0進(jìn)行研究資料分析。觀測(cè)資料主要為計(jì)量數(shù)據(jù)，以（）描述。兩組間的比較為成組t檢驗(yàn)或校正t檢驗(yàn)?；€資料中的計(jì)數(shù)資料以例（%）描述。兩組間比較為χ2檢驗(yàn)。ROC 曲線分析診斷價(jià)值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA CASC9 和miR?758?3p 的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)采用starBase v2.0 在線軟件（https：//bigd.big.ac.cn/databasecommons/database）預(yù) 測(cè)lncRNA CASC9與miR?758?3p 的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果顯示lncRNA CASC9 與miR?758?3p 存在潛在的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，見圖1。

圖1 StarBase v2.0 在線軟件預(yù)測(cè)lncRNA CASC9 與miR?758?3p 的結(jié)合位點(diǎn)Fig.1 StarBase v2.0 online software predicts the binding sites of lncRNA CASC9 and miR?758?3p

2.2 lncRNA CASC9和miR?758?3p在HCC血清中的表達(dá)與健康對(duì)照組相比，lncRNA CASC9在HCC組血清中的表達(dá)顯著增加（P＜0.05），miR?758?3p在HCC組血清中的表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見表1。

表1 兩組血清中l(wèi)ncRNA CASC9、miR?758?3p 表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of lncRNA CASC9 and miR?758?3p in serum of two groups

2.3 HCC 患者血清中l(wèi)ncRNA CASC9、miR?758?3p 表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系lncRNA CASC9、miR?758?3p 在HCC 血清中的表達(dá)水平與患者的年齡、性別、腫瘤大小和血清AFP 均無關(guān)（P＞0.05），與患者的肝硬化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期有關(guān)（P＜0.05）。見表2。

表2 lncRNA CASC9 和miR?758?3p 在HCC 血清中的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Tab.2 Relationship between the expression levels of lncRNA CASC9 and miR?758?3p in serum of HCC and clinicopathological parameters ±s

表2 lncRNA CASC9 和miR?758?3p 在HCC 血清中的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Tab.2 Relationship between the expression levels of lncRNA CASC9 and miR?758?3p in serum of HCC and clinicopathological parameters ±s

臨床病理參數(shù)年齡≤56 歲＞56 歲性別男 女腫瘤大?。? cm≤5 cm肝硬化有 無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無 有TNM 分期Ⅰ+Ⅱ期Ⅲ+Ⅳ期AFP＞200 ng/mL≤200 ng/mL例數(shù)32 40 49 23 26 46 46 26 52 20 47 25 41 31 lncRNACASC9 1.80±0.50 1.87±0.48 1.88±0.48 1.75±0.47 1.99±0.56 1.76±0.53 1.92±0.51 1.70±0.27 1.71±0.52 2.19±0.40 1.73±0.55 2.05±0.46 1.76±0.47 1.94±0.52 t 值0.604 0.609 1.733 2.392 3.720 2.482 1.537 P 值0.548 0.544 0.087 0.019＜0.001 0.015 0.129 miR?758?3p 0.79±0.31 0.75±0.28 0.74±0.29 0.83±0.30 0.70±0.29 0.81±0.37 0.71±0.31 0.88±0.27 0.83±0.29 0.61±0.33 0.86±0.30 0.60±0.22 0.80±0.29 0.74±0.26 t 值0.440 1.284 1.305 2.338 2.774 3.817 0.908 P 值0.661 0.203 0.196 0.022 0.007＜0.001 0.367

2.4 血清中l(wèi)ncRNA CASC9、miR?758?3p 和AFP的表達(dá)水平對(duì)HCC 診斷的價(jià)值進(jìn)一步探討血清中l(wèi)ncRNA CASC9、miR?758?3p 和AFP 等3 指標(biāo)對(duì)HCC 的診斷價(jià)值。

2.4.1 各指標(biāo)的單獨(dú)應(yīng)用以HCC 患者組為陽性樣本，以健康對(duì)照組為陰性樣本，建立ROC 診斷分析模型。經(jīng)ROC 分析知：各指標(biāo)對(duì)HCC 均有一定的診斷價(jià)值，ROC?AUC 分別為0.745（95%CI：0.632～0.879）、0.762（95%CI：0.641～0.907）、0.797（95%CI：0.707～0.899），見表3，ROC 分析曲線見圖2。

2.4.2 三指標(biāo)的聯(lián)合應(yīng)用采用SPSS 軟件的聯(lián)合應(yīng)用ROC 理論模式：LogP 模式。結(jié)果顯示：聯(lián)合應(yīng)用對(duì)HCC 的診斷價(jià)值比各單一指標(biāo)均有明顯提高，ROC?AUC 為0.848（95%CI：0.767～0.937），見表3、圖2。

表3 血清中l(wèi)ncRNA CASC9、miR?758?3p 和AFP 指標(biāo)對(duì)HCC 診斷價(jià)值之ROC 分析結(jié)果Tab.3 ROC analysis results of serum lncRNA CASC9，miR?758?3p and AFP in the diagnosis of HCC

圖2 ROC 分析曲線Fig.2 ROC analysis curve

3 討論

肝癌是全球常見腫瘤相關(guān)死亡原因，每年約有85 萬例新發(fā)病例［10］。HCC 是人類肝臟中的最常見腫瘤，約占所有原發(fā)性肝癌病例的90%，中國(guó)由于乙型肝炎病毒的流行，HCC 更為常見［11］。在HCC 的臨床治療中已采用了包括藥物干預(yù)、化學(xué)栓塞和外科治療在內(nèi)的許多治療策略，但由于HCC 的異質(zhì)性、復(fù)雜性和高復(fù)發(fā)，患者的病死率依然較高［3］。HCC 發(fā)生進(jìn)展的潛在分子機(jī)制目前仍未完全闡明，lncRNA 是長(zhǎng)度超過200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在包括表觀遺傳修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后修飾等多種機(jī)制中具有調(diào)控功能［6］，近年來發(fā)現(xiàn)了大量與HCC 相關(guān)的lncRNA，并有部分可作為腫瘤早期診斷和預(yù)后的分子標(biāo)志物［12］。

本研究首先采用qRT?PCR 檢測(cè)血清中l(wèi)ncRNA CASC9 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示lncRNA CASC9 在HCC 患者血清中表達(dá)增加，且與患者的年齡、性別、腫瘤大小和血清AFP 無關(guān)，與患者的肝硬化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期相關(guān)。而ZENG 等［5］報(bào)道HCC 患者血清中l(wèi)ncRNA CASC9 的高表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、分化程度和AFP 相關(guān)，高表達(dá)lncRNA CASC9 的HCC 患者預(yù)后較差。本研究結(jié)果與ZENG 等［5］的研究均顯示lncRNA CASC9 參與HCC 的惡性進(jìn)展，但是病理參數(shù)的相關(guān)性并不完全一致，分析原因可能與收集樣本例數(shù)的多少以及來源不同有關(guān)。lncRNA CASC9 是位于8q21.1 號(hào)染色體上的基因，研究報(bào)道lncRNA CASC9 在多種類型的人類腫瘤中發(fā)揮促癌作用，包括結(jié)直腸癌［13］、甲狀腺乳頭狀癌［14］和乳腺癌［15］等，在這些腫瘤中l(wèi)ncRNA CASC9 高表達(dá)與腫瘤患者的不良病理參數(shù)相關(guān)，在細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中l(wèi)n?cRNA CASC9 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，這些研究均提示lncRNA CASC9 是一種促癌因子。lncRNA 調(diào)控miRNA 的表達(dá)是參與腫瘤惡性生物學(xué)行為的重要作用分子機(jī)制［16］。研究報(bào)道在卵巢癌中l(wèi)ncRNA CASC9 作為miR?758?3p 的ceRNA 發(fā)揮促癌作用［7］。本文采用StarBase v2.0 軟件提示lncRNA CASC9 與miR?758?3p 存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)，提示兩者在HCC 中可能存在調(diào)控關(guān)系。本研究通過qRT?PCR 檢測(cè)顯示，miR?758?3p 在HCC 患者血清中的表達(dá)顯著低于在對(duì)照組血清中的表達(dá)，且與患者的肝硬化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期相關(guān)，表明miR?758?3p 可能具有抑制HCC 進(jìn)展的作用。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［8］，miR?758?3p 可通過抑制小鼠雙微體2、雷帕霉素靶蛋白的表達(dá)抑制HCC 的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。還有相關(guān)研究顯示，miR?758?3p 可抑制膀胱癌［17］、甲狀腺乳頭狀癌［18］、胃癌［19］等腫瘤的惡性進(jìn)展，提示miR?758?3p 是一種抑癌因子。

由于外周血游離核酸檢測(cè)具有局部微創(chuàng)、操作簡(jiǎn)單和成本低等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于各種疾病的診斷和預(yù)后［20］。目前AFP 是診斷HCC 早期的公認(rèn)腫瘤標(biāo)志物［4］，但其診斷價(jià)值還有待進(jìn)一步提升。本研究通過ROC 分析顯示，lncRNA CASC9、miR?758?3p 與AFP 對(duì)HCC 均有一定的診斷價(jià)值，ROC?AUC 分別為0.745（95%CI：0.632～0.879）、0.762（95%CI：0.641～0.907）、0.797（95%CI：0.707～0.899），然而指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)通常存在一定的缺陷，目前聯(lián)合檢測(cè)已成為趨勢(shì)。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA CASC9、miR?758?3p 與AFP 聯(lián)合檢測(cè)HCC 診斷的敏感度和特異性均高于各指標(biāo)的單獨(dú)檢測(cè)，ROC?AUC 為0.848（95%CI：0.767～0.937），提示lncRNA CASC9 和miR?758?3p 的聯(lián)合檢測(cè)在HCC 的診斷中具有重要指導(dǎo)意義。

綜上所述，血清lncRNA CASC9 和miR?758?3p在HCC 中均異常表達(dá)，二者的表達(dá)水平與肝硬化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期有關(guān)，二者可能參與了HCC 的惡性進(jìn)展，兩者聯(lián)合AFP 對(duì)HCC 有較高的診斷價(jià)值。然而本研究選取的病例數(shù)較少，且僅設(shè)計(jì)了健康對(duì)照組，未納入單純肝硬化、病毒性肝炎、脂肪肝等良性肝臟疾病人群，這些不足之處將在后續(xù)的研究中加以完善。