TRPM2基因敲除通過調(diào)控GSK3β改善脂多糖誘導小鼠抑郁樣行為

張占琴 王輝 蔣永潑

西安交通大學第一附屬醫(yī)院1麻醉手術(shù)部&腦科學中心，2疼痛科（西安710061）；3浙江大學臺州醫(yī)院重癥醫(yī)學科（浙江臺州317000）

抑郁癥是一種以對事物失去興趣或愉快感，持續(xù)性情緒低落或悲觀等為主要臨床特征的精神障礙性疾病［1］。臨床上目前常用的抗抑郁藥物多通過抑制去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體功能和5?羥色胺（5?HT）再攝取來改善抑郁癥狀，然而當前的抗抑郁藥物存在起效慢、有效率低、停藥易復(fù)發(fā)等缺點［2］。越來越多的證據(jù)表明炎癥反應(yīng)與抑郁的發(fā)病密切相關(guān)，促炎細胞因子腫瘤壞死因子?α（TNF?α）、白細胞介素?6（IL?6）和白細胞介素?1β（IL?1β）在抑郁癥過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［3］，抑郁癥患者外周血促炎因子TNF?α、IL?6 和IL?1β明顯升高［4］。另外，約30%左右的膿毒癥存活者表現(xiàn)出不同程度的抑郁樣癥狀，嚴重影響患者的生活質(zhì)量［5］。瞬時受體電位通道M2（transient receptor potential melastatin 2，TRPM2）是細胞膜上的一種多功能鈣離子通透性的非選擇性陽離子通道，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫細胞中高表達［6］。生理狀態(tài)下，TRPM2優(yōu)先定位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細胞，在星形膠質(zhì)細胞中較弱表達［7］。它同時又具有ADP 核糖及NAD 結(jié)合位點，能夠被H2O2及TNF?α調(diào)控，是體內(nèi)氧化應(yīng)激敏感的Ca2+通道［6］。研究發(fā)現(xiàn)缺血缺氧損害可以通過激活細胞膜上的TRPM2 通道介導Ca2+的出入胞活動，引起鈣超載和細胞凋亡，阻斷TRPM2 通道可顯著降低細胞凋亡［8］。膠質(zhì)細胞激活及其介導的神經(jīng)炎癥反應(yīng)參與膿毒癥介導的小鼠抑郁樣行為［9］，然而目前關(guān)于TRPM2是否在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）在誘導小鼠抑郁樣行為中的作用及其機制均不明確。本研究通過觀察TRPM2基因敲除（TRPM2-/-）對LPS誘導小鼠抑郁樣行為的影響，以期為其相關(guān)臨床應(yīng)用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型制備雄性C57 小鼠為背景的野生型和TRPM2-/-小鼠飼養(yǎng)于無病原體、12 h 光照循環(huán)（8：00 ～20：00）、室溫（24±2）℃的動物房，整個動物實驗遵從西安交通大學實驗動物倫理委員會要求進行。6 ～8 周齡（體質(zhì)量20 ～25 g）的雄性WT 和TRPM2-/-小鼠共分為野生小鼠對照組（WT）、野生小鼠模型組（WT+LPS）、TRPM2-/-小鼠對照組（TRPM2-/-）和TRPM2-/-小鼠模型組（TRPM2-/-+LPS）四組。其中將60 只TRPM2-/-小鼠，分為TRPM2-/-組和TRPM2-/-+LPS組各30只；另取60只同基因型背景的野生型小鼠，分為WT 組和WT+LPS組各30 只。模型組腹腔注射0.83 mg/kg LPS［10］，對照組腹腔注射等量體積的生理鹽水。參照文獻報道，4 組小鼠造模后24 h 觀察行為學（懸尾實驗和強迫游泳實驗）［10-12］，隨后處死所有小鼠進行ELISA、免疫熒光和Western blot 等檢測。

1.2 主要試劑LPS（血清型：0127：B8，美國Sigma公司）；5?HT 檢測試劑盒（美 國Abcam 公司）；TNF?α和IL?1β酶聯(lián)免疫吸附（Elisa）試劑盒（欣博盛生物科技有限公司）；Iba?1、GFAP、NeuN、t?GSK?3β和GAPDH 抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；p?GSK?3β（美 國cell signaling technology 公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒及ECL 發(fā)光試劑盒（美國Thermo 公司）；熒光二抗（西安壯志生物有限公司）；DAPI 和RIPA 裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 5?HT 含量測定處死小鼠后冰上取出腦組織，分離海馬和前額葉皮層。按照5?HT 檢測試劑盒的操作步驟，檢測小鼠海馬和前額葉皮層5?HT的含量。

1.3.2 免疫熒光染色甲醛灌注及固定腦組織后依次用含20%和30%蔗糖的PB 溶液沉底。冰凍切片機進行冠狀切片，厚度為6 μm。5 % BSA 室溫封閉2 h 后，分別用Iba?1（1∶100）、GFAP（1∶200）和NeuN（1∶200）抗體孵育18 h。然后用相應(yīng)的熒光二抗避光孵育2 h，DAPI（1∶300）核染色5 min。正置顯微鏡下拍照觀察，Image J 軟件統(tǒng)計每張腦片Iba?1、GFAP 和NeuN 陽性細胞數(shù)。

1.3.3 ELISA 法測定海馬組織TNF?α和IL?1β的含量處死小鼠后分離海馬組織并加入預(yù)冷的PBS，勻漿、4 ℃、8 000×g離心10 min，取上清。按照TNF?α和IL?1β檢測試劑盒的操作步驟，檢測小鼠海馬TNF?α和IL?1β的含量。

1.3.4 Western blot檢測采用RIPA 裂解液（10 mL/g）、廣譜磷酸酶抑制劑（1∶100）和PMSF（1∶100）提取海馬組織的總蛋白，冰上超聲破碎以及重新裂解后，4 ℃、13 000×g離心10 min，取上清行BCA蛋白定量。按照每孔60 μg 上樣量進行SDS?PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。加入一抗p?GSK?3β（1∶1 000）、t?GSK?3β（1∶1 000）和GAPDH（1∶3 000）后4 ℃過夜后，加入相應(yīng)的二抗羊抗兔（1∶10 000）或羊抗鼠（1∶5 000）室溫孵育1 h，ECL 顯影，Bio?Rad 凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并進行灰度值分析。

1.3.5 懸尾實驗固定小鼠尾部1 cm 處，將小鼠懸掛于30 cm 的觀察箱中，保持小鼠鼻尖距地面約20 ～25 cm。記錄6 min 內(nèi)小鼠的不動時間，并計算不動時間百分比。

1.3.6 強迫游泳實驗將小鼠置于高20 cm，直徑12 cm，水深10 cm 的圓柱形透明缸中，水溫（24 ±2）℃。攝像機采集6 min，記錄后4 min 內(nèi)累計不動時間。

1.4 統(tǒng)計學方法計量資料以均數(shù)±標準差表示，使用SPSS 20.0 軟件進行分析。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊性采用t檢驗，方差不齊采用非參數(shù)秩和檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TRPM2 基因敲除對LPS 模型前額葉皮層和海馬5?HT 含量的影響與WT 組比較，TRPM2-/-組小鼠前額葉皮層和海馬5?HT 含量無明顯差異，WT+LPS 組小鼠前額葉皮層和海馬5?HT 含量顯著降低（P＜0.01）；與WT+LPS 組比較，TRPM2-/-+LPS組小鼠前額葉皮層5?HT 含量無明顯差異，而海馬5?HT 含量顯著升高。見表1。

2.2 神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞標志物表達變化與WT組比較，TRPM2-/-組小鼠海馬GFAP、Iba?1 和NeuN 陽性細胞數(shù)無明顯差異，WT+LPS 組小鼠海馬GFAP和Iba?1 陽性細胞數(shù)增多（P＜0.05），而NeuN 陽性細胞數(shù)無明顯差異；與WT+LPS 組比較，TRPM2-/-+LPS組小鼠海馬GFAP和Iba?1陽性細胞數(shù)明顯減少（P＜0.05），而NeuN 陽性細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義。見圖1、表2。

表1 四組小鼠前額葉皮層和海馬5?HT 含量Tab.1 5?HT expressions of hippocampus and prefrontal cortex tissues in 4 groups of mice±s，ng/g

表1 四組小鼠前額葉皮層和海馬5?HT 含量Tab.1 5?HT expressions of hippocampus and prefrontal cortex tissues in 4 groups of mice±s，ng/g

注：與WT 組比較，##P ＜0.01；與WT+LPS 組比較，*P ＜0.05

組別 前額葉皮層 海馬WT 組618.92±45.17726.33±105.12 TRPM2-/-組625.16±34.53699.15±86.29 WT+LPS 組TRPM2-/-+LPS 組426.01±58.14##442.97±80.36 457.98±38.55##605.19±23.76*

圖1 四組小鼠海馬CA3 區(qū)神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞標志物表達變化情況Fig.1 Changes of neuronal and glial cell markers of hippocampal CA3 region in 4 groups of mice

2.3 TRPM2 基因敲除對LPS 模型海馬TNF?α和IL?1β水平的影響與WT 組比較，TRPM2-/-組小鼠海馬TNF?α和IL?1β水平無明顯差異，WT+LPS 組小鼠海馬TNF?α和IL?1β水平顯著升高（P＜0.05）；與WT+LPS 組比較，TRPM2-/-+LPS 組小鼠海馬TNF?α和IL?1β水平顯著降低（P＜0.05）。見表3。

2.4 TRPM2基因敲除對LPS 模型海馬p?GSK?3β和t?GSK?3β蛋白表達的影響Western blot 檢測結(jié)果顯示，四組小鼠海馬組織的t?GSK?3β的相對蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義，但WT+LPS 組小鼠海馬組織p?GSK?3β的相對表達與WT 組比較明顯下降。而TRPM2-/-+LPS 組小鼠海馬p?GSK?3β的相對表達水平較WT+LPS 組升高。見圖2、表4。

表2 四組小鼠海馬神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞陽性細胞數(shù)（40×）Tab.2 The number of NeuN，GFAP and Iba?1 positive cells of hippocampus in 4 groups of mice（40×）

表3 四組小鼠海馬TNF?α和IL?1β含量Tab.3 TNF?α and IL?1β contents of hippocampus in 4 groups of mice ±s

表3 四組小鼠海馬TNF?α和IL?1β含量Tab.3 TNF?α and IL?1β contents of hippocampus in 4 groups of mice ±s

注：與WT 組比較，##P ＜0.01；與WT+LPS 組比較，**P ＜0.01

組別WT 組TRPM2-/-組WT+LPS 組TRPM2-/-+LPS 組TNF?α（pg/mL）96±16 87±14 228±26##141±22**IL?1β（pg/mL）69±21 71±15 178±34##113±29**

表4 四組小鼠海馬區(qū)p?GSK?3β和t?GSK?3β表達的相對光密度值Tab.4 Relative optical density value of hippocampal p?GSK?3β and t?GSK?3β expressions in 4 groups of mice x±s

圖2 四組小鼠海馬區(qū)p?GSK?3β、t?GSK?3β和GAPDH 的電泳條帶圖Fig.2 p?GSK?3β，t?GSK?3β and GAPDH expressions of hippocampal tissues in 4 groups of mice

2.5 TRPM2基因敲除改善LPS誘導的小鼠抑郁樣行為與WT組比較，TRPM2-/-組小鼠在懸尾和強迫游泳實驗中的不動時間差異無統(tǒng)計學意義，WT+LPS 組小鼠在2 個實驗中不動時間顯著延長（P＜0.05）；與WT+LPS 組比較，TRPM2-/-+LPS 組小鼠在2 個實驗中不動時間顯著縮短（P＜0.05）。見表5。

表5 四組小鼠在懸尾和強迫游泳實驗中的不動時間Tab.5 The mobility time of tail suspension test and forced swim test in 4 groups of mice ±s，s

表5 四組小鼠在懸尾和強迫游泳實驗中的不動時間Tab.5 The mobility time of tail suspension test and forced swim test in 4 groups of mice ±s，s

注：與WT 組比較，##P ＜0.01；與WT+LPS 組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

組別WT 組TRPM2-/-組WT+LPS 組TRPM2-/-+LPS 組懸尾實驗176.24±7.53 172.19±6.28 224.47±12.82##185.33±9.46**強迫游泳實驗111.07±23.26 115.45±17.31 162.69±35.24##123.18±24.09*

3 討論

抑郁癥的病因和發(fā)病機制目前尚不清楚，研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者外周血炎性細胞因子濃度升高［4］，各種動物抑郁模型顯示腦內(nèi)炎癥因子表達升高［13］，說明抑郁的發(fā)病與炎癥的發(fā)生密切相關(guān)。TRPM2 是一種非選擇性的鈣離子通道，廣泛表達于腦內(nèi)的免疫細胞上。近年來發(fā)現(xiàn)TRPM2 基因敲除對神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿爾茨海默病、癲癇及缺血性腦血管病均具有良好的保護作用，其機制可能與其抗炎、抗氧化和抗凋亡等作用有關(guān)［14］。本研究結(jié)果顯示，TRPM2 基因敲除顯著逆轉(zhuǎn)LPS 誘導的海馬5?HT 含量降低和不動時間延長，同時海馬異常升高的炎癥細胞因子TNF?α和IL?1β水平也明顯下降，說明TRPM2 基因敲除能夠改善LPS 誘導的小鼠抑郁樣行為，而且這種作用可能和降低海馬炎癥反應(yīng)有關(guān)。

LPS 是一種常用的促炎內(nèi)毒素，可觸發(fā)小膠質(zhì)細胞激活，誘導免疫激活和行為改變，類似于人類抑郁的臨床癥狀［15］，因此常經(jīng)小鼠中樞或者外周給予LPS 誘導抑郁動物模型。研究證實LPS 誘導的抑郁行為包括懸尾和強迫游泳實驗不動時間增加［10］，這與本研究結(jié)果一致。LPS 引起的小鼠病態(tài)行為（豎毛、眼瞼下垂和嗜睡等）通常在給藥后6 h 達峰值時進行測量，24 h 后小鼠自主活動便可恢復(fù)正常，此時LPS 誘導的抑郁樣行為可與LPS 誘導的病態(tài)行為分離［16］，對抑郁樣行為的觀察多在24 h 這一時間點進行［10］。在本實驗中，0.83 mg/kg LPS 腹腔注射24 h 后，小鼠自發(fā)活動恢復(fù)正常，強迫游泳實驗中不動時間增多，與既往文獻報道一致［10］。先前的研究證實外周LPS 刺激誘導產(chǎn)生的炎性細胞因子能激活吲哚胺2，3-雙加氧酶（indole?amine2，3?dioxygenase，IDO），引起色氨酸代謝異常，最終導致5?HT 合成水平下降，并出現(xiàn)抑郁樣行為［17］，給予小膠質(zhì)細胞刪除劑米諾環(huán)素后可間接阻斷IDO 激活，阻止抑郁癥的發(fā)展［18］。炎性細胞因子可直接或/和間接損傷神經(jīng)細胞，導致額葉皮層、海馬、杏仁核和基底核等與情緒有關(guān)腦區(qū)的神經(jīng)細胞功能受損［19］。本研究結(jié)果顯示LPS 誘導小鼠海馬和前額葉皮層5?HT 含量顯著降低，而TNF?α和IL?1β水平升高，并出現(xiàn)抑郁樣行為，進一步說明炎癥反應(yīng)在抑郁癥發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

在新生兒缺血缺氧性腦損傷模型中，TRPM2基因敲除可以降低星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞激活，其機制可能與促進GSK3β磷酸化有關(guān)［8］。本研究在LPS 模型中證實了TRPM2 基因敲除可以減輕小鼠抑郁樣行為，同時與抑郁發(fā)病密切相關(guān)的腦區(qū)海馬的TNF?α和IL?1β水平明顯下降，進一步揭示了TRPM2 基因敲除改善抑郁樣行為可能和降低腦內(nèi)炎癥反應(yīng)程度有關(guān)。GSK3β的活性受到5?HT 信號的影響，GSK3 是5?HT1B 受體調(diào)控的Giα信號的功能選擇性調(diào)制器，刺激5?HT1 和5?HT7 激活PI3K/AKT 通路，增加GSK3β的磷酸化［20-21］。細胞中GSK3β的活性和表達受到神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)和神經(jīng)營養(yǎng)因子等的調(diào)節(jié)，這其中有許多被作為抗抑郁的靶標，GSK3β蛋白激酶活性異常、表達改變和基因多態(tài)性與重度抑郁癥的發(fā)病機制、發(fā)病年齡和嚴重程度相關(guān)［22］。然而，GSK3β活性增強是情緒障礙的因還是果，仍需進一步的研究來充分闡明。腦內(nèi)過度的氧化應(yīng)激也是導致抑郁的原因［23］，TRPM2 介導ROS 依賴的NLRP3 炎性體激活，TRPM2 基因敲除可以降低腦內(nèi)氧化應(yīng)激程度［6］。

綜上所述，TRPM2 基因敲除可以改善LPS 誘導的小鼠抑郁樣行為，可能與上調(diào)海馬p?GSK3β的蛋白表達有關(guān)，但確切的抗抑郁機制有待進一步研究。因此，仍需深入研究TRPM2 與GSK3β的聯(lián)系以及TRPM2 在抑郁等情緒調(diào)控中的作用，為抑郁癥的發(fā)病機制和治療提供新途徑。