侵入后失活瘧原蟲的免疫保護性初探①

彭佳聰,官宏莉,李媛媛,蔣莉萍,彭小紅

(桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲學(xué)教研室,廣西 桂林 541199)

瘧疾是世界上嚴重危害公共衛(wèi)生的三大傳染病之一,主要通過感染瘧原蟲的雌性按蚊叮咬而傳播。據(jù)WHO估計,2019年全球共有2.29億人感染瘧疾,導(dǎo)致約40.9萬人死亡,其中2/3為撒哈拉以南非洲地區(qū)5歲以下兒童[1]。近年來,盡管瘧疾防控已取得巨大進展,但瘧疾患病及死亡人數(shù)仍居高不下,其原因主要是殺蟲劑及抗瘧藥物耐藥性的擴散[2-3]。因此,新型抗瘧藥物和瘧疾疫苗的研制變得尤為迫切。

過去70多年來,全球在瘧疾疫苗研制方面進行了艱苦的努力,但尚未開發(fā)出一種安全、有效的瘧疾疫苗[4]。由于瘧原蟲抗原具有高度多態(tài)性,以瘧原蟲表面優(yōu)勢抗原為基礎(chǔ)的亞單位疫苗產(chǎn)生的免疫保護性受限[5-6],使得近年來瘧疾疫苗的研發(fā)焦點逐漸轉(zhuǎn)移至全蟲疫苗。實驗證實,瘧原蟲紅內(nèi)期全蟲減毒疫苗對瘧原蟲再感染具有免疫保護作用,但其免疫過程中可能因減毒不完全而導(dǎo)致接種者出現(xiàn)瘧原蟲感染[7-8]。因此,全蟲滅活疫苗或許能成為紅內(nèi)期瘧疾疫苗研制的突破點。本研究在瘧原蟲感染康復(fù)期小鼠紅細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)類似Howell-Jolly小體的單點狀深紫染顆粒,采用約氏瘧原蟲感染小鼠模型,制備及富集該顆粒,并以此為抗原免疫小鼠,檢測其接種安全性和免疫保護性,為其作為瘧原蟲紅內(nèi)期全蟲滅活疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康清潔級雌性BALB/c小鼠40只,6~8周齡,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司;健康普通級雌性昆明株小鼠40只,6~8周齡,購自桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物中心;約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii,P.yoelii)BY265株,為本室長期保存蟲株;甲醇購自西隴科學(xué)股份有限公司;姬姆薩染液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司;磷酸氯喹(chloroquine phosphate,CQ)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;生理鹽水購自廣西裕源藥業(yè)有限公司;磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution,PBS,0.1 mol/L,pH 7.5)購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠接種感染 取昆明株小鼠,按常規(guī)方法經(jīng)腹腔接種P.yoeliiBY265株感染的紅細胞(infected red blood cells,iRBCs),接種后第3天尾靜脈取血,薄血膜涂片,甲醇固定后姬姆薩染色,光鏡下觀察小鼠瘧原蟲感染情況,計數(shù)紅細胞的瘧原蟲感染率,即原蟲血癥百分比。

1.2.2 抗原獲取 采取以下3種方法制備類似Howell-Jolly小體顆粒抗原,每組5只昆明株小鼠。①CQ-ITV法(基于磷酸氯喹的感染后控制疫苗):按照參考文獻[9]構(gòu)建CQ-ITV免疫小鼠模型。末次免疫后第30天,計數(shù)P.yoelii感染小鼠的原蟲血癥所占百分比,根據(jù)計數(shù)結(jié)果,用生理鹽水將P.yoelii感染小鼠的全血稀釋至103iRBCs/100μl,尾靜脈注射100μl攻擊小鼠;攻擊后第2天起,每日查血,計數(shù)小鼠原蟲血癥及類似Howell-Jolly小體顆粒所占的比例。②高劑量接種法:計數(shù)P.yoelii感染小鼠的原蟲血癥所占百分比,用生理鹽水將P.yoelii感染小鼠的全血稀釋至108iRBCs/100μl,小鼠尾靜脈注射接種100μl;3 h后,腹腔注射100μl PBS稀釋的CQ(0.8 mg/100μl),此后每日同一時間注射CQ,并查血計數(shù)小鼠原蟲血癥及類似Howell-Jolly小體顆粒所占的比例。③感染后CQ治療法:小鼠腹腔注射100μl P.yoelii感染小鼠的全血,接種后第3天起,每日查血觀察小鼠原蟲血癥。待原蟲血癥約15%時,腹腔注射100μl PBS稀釋的CQ(0.8 mg/100μl)進行治療,此后每日同一時間注射CQ,并查血計數(shù)小鼠原蟲血癥及類似Howell-Jolly小體顆粒所占的比例。

選擇完全無瘧原蟲感染且含類似Howell-Jolly小體顆粒最多的時間點取小鼠全血,4℃,離心15 min,去除血漿,留取紅細胞,PBS洗滌3次,5 min/次,加入與血漿等量PBS重懸,獲得類似Howell-Jolly小體顆?？乖?。

1.2.3 接種安全性及保護性檢測 計數(shù)以上類似Howell-Jolly小體顆?？乖?用生理鹽水將抗原稀釋至103個/100μl及105個/100μl,分別尾靜脈注射進行免疫接種兩組BALB/c小鼠(5只/組,100μl/只),共免疫3次,每次間隔14 d。末次免疫后第30天,計數(shù)小鼠的原蟲血癥(P.yoelii感染的紅細胞)所占百分比;用生理鹽水將P.yoelii感染小鼠的全血稀釋至103iRBCs/100μl,尾靜脈注射100μl攻擊小鼠,同時另取3只空白(未經(jīng)免疫接種)BALB/c小鼠,同樣方法進行攻擊作對照,攻擊后第3天起,每日查血檢查小鼠瘧原蟲感染情況。

1.2.4 凍存后抗原的接種安全性及免疫保護性檢測將1.2.2獲得的抗原于-20℃凍存30 d。免疫前37℃水浴鍋中迅速解凍,計數(shù)抗原含量,用生理鹽水將抗原稀釋至105個/100μl,尾靜脈注射100μl稀釋抗原對昆明株小鼠進行免疫接種(5只/組,100μl/只),共免疫3次,每次間隔14 d,另取3只空白小鼠同樣方法注射100μl PBS作對照。末次免疫后第30天,用1.2.1制備的103iRBCs/100μl攻擊小鼠,攻擊后第2天起,每日查血檢查小鼠瘧原蟲感染情況,檢測凍存后抗原免疫保護性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8軟件完成實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析與作圖,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 類似Howell-Jolly小體的單點狀深紫染顆粒

小鼠瘧原蟲感染康復(fù)期,部分紅細胞內(nèi)出現(xiàn)類似Howell-Jolly小體的特殊單點狀深紫染顆粒,其形態(tài)不同于紅內(nèi)期瘧原蟲,但這些紅細胞的基本形態(tài)與正常紅細胞無異,將該顆粒命名為侵入后失活瘧原蟲(invaded and inactivatedPlasmodium,IIP)。詳見圖1。

圖1 IIP及紅內(nèi)期瘧原蟲光鏡下形態(tài)(100×)

2.2 IIP的獲取情況

采用CQ-ITV法、高劑量接種法及感染后CQ治療法均成功獲取IIP,其中CQ-ITV法最早可于接種后第59天出現(xiàn)IIP,高劑量接種法最早可于接種后第3天出現(xiàn)IIP,但小鼠外周血僅見IIP的時間差異較大,從7 d至18 d不等;感染后CQ治療法最早可于接種后第12天出現(xiàn)IIP,第14天開始,外周血僅見IIP。

2.3 IIP接種的安全性

103個IIP/100μl的低劑量組,小鼠免疫全程均未出現(xiàn)瘧原蟲感染,而105個IIP/100μl的高劑量組,小鼠首次免疫后第3至8天相繼出現(xiàn)感染。原蟲血癥峰值僅7%。

2.4 IIP免疫的原蟲血癥峰值

實驗組與對照組小鼠均于攻擊后第3天出現(xiàn)原蟲血癥,隨著時間的增加,全部小鼠出現(xiàn)瘧原蟲感染,原蟲血癥也逐漸上升,兩組小鼠原蟲血癥對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。但是,未免疫組原蟲血癥于攻擊后第12至15天達到峰值,隨后逐步下降,而免疫組原蟲血癥在第8至22天維持在較低水平,于第23天起迅速下降。此外,免疫組原蟲血癥峰值(43.8%)明顯低于未免疫組(56.1%)。詳見圖2。

圖2 IIP免疫保護性檢測

2.5 IIP凍存后的安全性及免疫保護性

接種凍存后IIP小鼠3次免疫過程中均未出現(xiàn)瘧原蟲感染。免疫的實驗組與對照組小鼠均于iRBCs攻擊后第5天出現(xiàn)原蟲血癥,免疫的實驗組原蟲血癥于第10天達到峰值,隨后逐漸下降,至第23天完全恢復(fù);未免疫組原蟲血癥于第12天達到峰值,但小鼠分別于第8、10、16天死亡;此外,免疫組原蟲血癥峰值明顯低于未免疫組。詳見圖3。

圖3 IIP凍存后的免疫保護性檢測

3 討論

目前在研的瘧疾全蟲疫苗均為減毒疫苗,除了制備條件,安全性也是限制其應(yīng)用的主要原因[10]。紅外期基因減毒子孢子疫苗(genetically-attenuated parasites,GAP)的人體實驗中,第一批接種惡性瘧原蟲p52-/p36-GAP的6名志愿者之一出現(xiàn)了瘧原蟲感染[11]。感染后控制疫苗(infection and treatment vaccine,ITV)免疫過程中低劑量的藥物治療也可能導(dǎo)致受試者出現(xiàn)瘧原蟲感染,提高藥物濃度可降低感染風(fēng)險,但高濃度藥物可能會引起不良反應(yīng),殘留藥物也可能導(dǎo)致不良反應(yīng)發(fā)生[12]。

本研究建立約氏瘧原蟲感染小鼠模型,在小鼠感染瘧原蟲康復(fù)期的部分紅細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了單點狀深紫染顆粒(圖1)。起初以為該顆粒是Howell-Jolly小體,它是位于成熟紅細胞或晚幼紅細胞胞質(zhì)中的紫紅色圓形顆粒,多見于溶血性貧血。然而,在CQ-ITV免疫過程中也發(fā)現(xiàn)了該物質(zhì),此時小鼠處于正常生理狀態(tài),并無貧血及紅細胞增生癥狀。CQ主要作用于瘧原蟲紅內(nèi)期裂殖體,對早期滋養(yǎng)體作用并不明顯[13]。因此,上述特殊顆粒不是CQ直接對瘧原蟲殺傷形成的,而可能為侵入紅細胞過程中被免疫系統(tǒng)殺傷失活的瘧原蟲。

通過比較CQ-ITV法、高劑量接種法以及感染后CQ治療法3種制備方法發(fā)現(xiàn),CQ-ITV法因其3次免疫逐步加強了對再感染的保護效果,攻擊后一般不會出現(xiàn)瘧原蟲感染,但此法耗時較長,從接種到獲取IIP至少需要59 d。而CQ治療法小鼠狀態(tài)穩(wěn)定,且僅需約14 d即可獲得IIP,因此后續(xù)實驗均采用此法制備。低劑量IIP(103個IIP/100μl)接種小鼠過程中均未出現(xiàn)瘧原蟲感染,而高劑量IIP(105個IIP/100μl)首次接種即出現(xiàn)感染,但是小鼠原蟲血癥峰值僅為7%,說明IIP的制備仍有待改進。本研究所采取的IIP富集方式可能存在血涂片未見iRBCs,但體內(nèi)仍有少量感染瘧原蟲未被發(fā)現(xiàn)的情況。

最后,在小鼠末次免疫后第30天給予免疫組與未免疫組小鼠103iRBCs/100μl攻擊發(fā)現(xiàn),兩組小鼠均于攻擊后第3天出現(xiàn)原蟲血癥,雖然其原蟲血癥對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但免疫組原蟲血癥峰值明顯低于未免疫組,說明IIP具有一定的免疫保護性,可能因免疫能力不夠?qū)е缕湮闯霈F(xiàn)完全免疫保護作用。此外,-20℃下,IIP凍存30 d后稀釋至105個IIP/100μl后免疫小鼠過程中均未出現(xiàn)瘧原蟲感染,攻擊后原蟲血癥水平明顯低于未免疫組,說明凍存后IIP具備100%的接種安全性,提示高免疫劑量可產(chǎn)生更好的免疫保護作用。

本研究未取得理想效果,還有很多問題有待深入探討。首先,康復(fù)期紅細胞內(nèi)單點狀深紫染顆粒是否為侵入后失活瘧原蟲值得進一步確定,后續(xù)可采用質(zhì)譜分析,明確該顆粒的成分。其次,如果確定了該顆粒為瘧原蟲成分,其瘧原蟲相關(guān)抗原是否可表達于侵入紅細胞表面。如果明確了上述兩個問題,可采用流式細胞術(shù)分選方式獲取高純度IIP,以確保免疫過程的安全性,同時通過提高免疫劑量驗證其保護性。

總之,本研究發(fā)現(xiàn)了瘧原蟲感染康復(fù)期宿主紅細胞內(nèi)的特殊顆粒物質(zhì),通過制備并富集證實了該顆粒具有一定的免疫保護性。提示IIP可能是潛在的瘧疾紅內(nèi)期滅活全蟲疫苗,這也為新型有效瘧疾疫苗的設(shè)計提供了新的思路。