假睛東方鲀肝臟中河豚毒素的分離純化

王瑞瑞，張小軍，曾軍杰，盧義博，方雙琪，陳思

（1.浙江省海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316021）（2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021）（3.浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316021）

河豚毒素（Tetrodotoxin，TTX）是一種非蛋白的神經(jīng)毒素，毒性很強(qiáng)的生物堿[1]。TTX得分子結(jié)構(gòu)為氨基全氫喹唑啉型化合物，分子式為C11H17O8N3，相對(duì)分子質(zhì)量為319.30。TTX不溶于水和有機(jī)試劑，溶于弱酸性水溶液和醇溶液，在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿溶液中容易被破壞，有機(jī)酸條件下可穩(wěn)定存在。河豚毒素最早是在河豚魚中發(fā)現(xiàn)的，毒素主要分布在卵巢、肝臟、皮膚等組織中[2]。不同生長(zhǎng)期的河鲀魚體內(nèi)毒素分布并不相同，幼年時(shí)期的河鲀魚的卵巢發(fā)育不成熟，TTX主要蓄積在皮膚中；而成年河鲀魚的主要蓄積器官是卵巢，肝臟次之[3]。除河鲀魚外，在其他動(dòng)物體內(nèi)也檢測(cè)到了TTX及其衍生物的存在，如藍(lán)環(huán)章魚[4]、蠑螈[5]、紐蟲[6]、織紋螺[7]等。在日本、中國(guó)、東南亞等地常有誤食河鲀魚中毒事件發(fā)生[8]，近些年來我國(guó)沿海地區(qū)也有食用織紋螺、河豚魚導(dǎo)致中毒的案例，其中毒表現(xiàn)通常為口腔麻木感覺異常，運(yùn)動(dòng)性麻痹，身體不協(xié)調(diào)，言語不清，嚴(yán)重者出現(xiàn)缺氧，心率過緩，意識(shí)不清，最終因呼吸衰竭和心臟衰竭而死亡[9]。雖然攝入過量的河豚毒素會(huì)導(dǎo)致肌體中毒，但它也具有重要的藥用價(jià)值。河豚毒素具有高效選擇性和高效親和性，可迅速阻斷神經(jīng)纖維上的鈉離子通道，從而抑制神經(jīng)和肌肉間的興奮傳導(dǎo)，使神經(jīng)和肌肉麻痹[10]。河豚毒素可作用于特定的鈉離子通道(VGSCs)亞型，VGSCs在疼痛中起著關(guān)鍵作用，河豚毒素具有高度選擇性可阻斷VGSCs超蛋白家族，使其在緩解疼痛方面有潛在作用[11]。因此經(jīng)過提純的TTX也常用于鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和麻醉等神經(jīng)性病患的治療[12]。

河豚毒素的生產(chǎn)最早起源于日本，1909年田原良純以紅鰭東方鲀的卵巢首次提取出河豚毒素粗品，并命名為河豚毒素（Tetrodotoxin）。1950年，一些日本學(xué)者橫尾晃、津田恭介、河村正郎等也相繼分離出河豚毒素[13]。1958年我國(guó)上海水產(chǎn)研究院開始相關(guān)TTX的提取工作。70年代末，由解放軍藥物化學(xué)研究所與河北省水產(chǎn)研究所合作共同研制出生產(chǎn)TTX的新工藝[14]。隨著TTX的進(jìn)一步研究，Noguchi[15]等從石灰藻及毒蟹中分離出能產(chǎn)生TTX的細(xì)菌。Thuesen[16]和Wu[17]等人也從攜帶河豚毒素的生物體內(nèi)分離到越來越多的產(chǎn)毒菌株。Yasumoto[18]等人利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)得到TTX，岳田芳等人[19]利用海藻希瓦氏菌（Shewanellaalga）發(fā)酵得到TTX。發(fā)酵法通過產(chǎn)毒菌株代謝來獲得TTX，在一定程度上是節(jié)省資源，減少了對(duì)環(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)的破壞，但是細(xì)菌生產(chǎn)的TTX產(chǎn)量低，不能工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。2019年日本的Keigo Murakami等人通過一系列化學(xué)合成了一種TTX[20]，但TTX同系物種類多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前人工合成TTX的方法操作難度大，合成經(jīng)驗(yàn)不足，尚不能推廣應(yīng)用。TTX純品生產(chǎn)工藝復(fù)雜，產(chǎn)量低，價(jià)格昂貴，限制了河豚毒素在醫(yī)療等領(lǐng)域的推廣應(yīng)用。本文以假睛方鲀肝臟為原料，對(duì)肝臟中的河豚毒素進(jìn)行粗提，在中性氧化鋁、活性炭、離子交換樹脂和Bio-Gel P2凝膠柱中選取合適的純化柱對(duì)河豚毒素粗提液進(jìn)行在分離純化，確定分離純化過程中柱子的最適pH、洗脫液濃度，回收率等條件，研究出一種操作簡(jiǎn)單，成本低廉，更容易大量得到河豚毒素的工藝流程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

假睛東方鲀（Takifugupseudommus），2018年采購于浙江舟山、溫州等地。經(jīng)浙江省海洋水產(chǎn)研究所專家對(duì)假睛方鲀進(jìn)行確認(rèn)后，將魚體解剖取出肝臟，用干凈無污染的絞肉機(jī)將肝臟混合攪拌均勻后，保存在-20 ℃冷庫中備用。

河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)品，TTX免疫親和柱（3 mL），江蘇美正生物科技有限公司；乙腈、甲醇，Merck德國(guó)；乙酸銨、甲酸，Sigma美國(guó)；乙酸、十二水合磷酸氫二鈉、二水和磷酸二氫鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、中性氧化鋁，AR上海國(guó)藥集團(tuán)；CM-High Performance離子交換樹脂（簡(jiǎn)稱CM HF），武漢晶誠生物科技有限公司；HILIC親水樹脂，天津艾杰爾科技有限公司；Bio-Gel P2凝膠，美國(guó)Bio-Rad公司；D152離子交換樹脂，上海一基實(shí)驗(yàn)有限公司；活性炭粉末（目數(shù)：200）。

1.2 儀器和設(shè)備

ACQUITY超高效液相色譜-質(zhì)譜儀Quattro Premier XE，美國(guó)Waters公司；氮吹儀、MS2渦旋混合器，德國(guó)IKA公司；20通道固相萃取裝置，美國(guó)Supelco公司；Centrifuge5810高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；冷凍干燥機(jī)，美國(guó)LABCONCO公司；層析柱，武漢晶誠生物科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；Waters 600 Controller，美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

稱取5.00 mg TTX標(biāo)準(zhǔn)品，用0.10%甲酸乙腈-水溶液1:1（V/V）溶解并定容至50 mL，得到濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃避光保存。用0.10%甲酸乙腈-水溶液1:1（V/V）對(duì)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，得到100、50、20、10、5、2 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。

1.3.2 TTX提取方法

取勻漿好的肝臟20 g，按液料比1:3（V/W）加入1%乙酸甲醇60 mL，渦旋振蕩5 min，在60 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)提取20 min，水浴過程中每5 min取出震蕩一次，待樣品冷卻至室溫，7000 r/min高速離心6 min，取上清液，55 ℃下旋蒸至體積不再變化，得到假睛方鲀肝臟的粗提液。

1.3.3 樣品的純化

取100 μg/mL的TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液，用1 M氫氧化鈉分別將pH調(diào)為3、4、5、6、7、8，將中性氧化鋁柱（2 g）、活性炭柱（2 g）、CM HF和D152弱酸性陽離子交換樹脂樹脂（2 g）的4種柱子分別用兩個(gè)柱體積的純凈水活化，隨后取1 mL上述TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）進(jìn)行上樣吸附，收集每個(gè)組分的淋洗液，用高效液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定其中TTX含量，計(jì)算四種柱子在不同pH值下的吸附率。

將裝好的中性氧化鋁柱（20 g）、活性炭柱（20 g）、CM HF（20 g）和D152（20 g）凈化柱用純水平衡12 h。取TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）10 mL用氫氧化鈉（1 mol/L）調(diào)pH后上樣，流速為1 min/L。上樣結(jié)束后，先用純凈水淋洗兩個(gè)柱體積，然后用1%～4%的乙酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，分別洗脫兩個(gè)柱體積，流速為1 mL/min，收集洗脫液，每2 mL收集一次。最后用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定不同濃度洗脫液中TTX含量，并計(jì)算TTX在中性氧化鋁柱、活性炭柱、CM HF離子交換柱和D152離子交換樹脂柱中的回收率。

1.3.4 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH Amide柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；初始流動(dòng)相（A:B=1:9）A：0.10%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液，B：乙腈；樣品室溫度：10 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；洗脫方式：梯度洗脫（0～0.50 min，10% A，90% B；1.50～4 min，60% A，40% B；4.50～5 min，10% A，90% B），流速：0.30 mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子掃描（ESI+）；多反應(yīng)檢測(cè)模式；毛細(xì)管電壓：3.50 kV；脫溶劑氣溫度：385 ℃；離子源溫度；119 ℃；錐氣孔：高純氮?dú)?，流?5 L/h；脫溶劑氣：高純氮?dú)猓魉?00 L/h；TTXm/z320→m/z302.10；錐孔電壓：30 V；碰撞能量：25 V。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

TTX含量以高效液相色譜法檢測(cè)，吸附率和回收率曲線由Origin 9進(jìn)行繪制。吸附率和回收率按下列公式計(jì)算[21]：

式中：M：TTX的吸附率；m0：TTX上樣液濃度；m1：TTX上樣接收液濃度；N：洗脫液回收率；n1：TTX上樣液濃度；n2：柱子洗脫液濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 上樣液pH對(duì)不同柱子吸附率的影響

如圖1所示，中性氧化鋁柱在酸性條件下吸附率僅為35%左右，酸性條件下TTX不能吸附在中性氧化鋁上，隨著pH值的增大，中性氧化鋁的吸附能力變大，pH值為中性時(shí)，吸附率最大為86.42%；當(dāng)pH=3時(shí)，活性炭的吸附率最低，幾乎不吸附，隨著pH的增大，河豚毒素在極性變小，活性炭對(duì)TTX得吸附量逐漸增加，在pH=7時(shí)吸附率最大為92.73%。CM HF離子交換柱對(duì)TTX的吸附率也隨pH值的增大而增大，在pH=7時(shí)最大為90.15%。D152柱在pH=3時(shí)對(duì)TTX的吸附率較低，pH=5時(shí)，達(dá)到最大吸附率為91.97%，當(dāng)pH繼續(xù)增大，吸附力變小。綜上所述，中性氧化鋁柱、活性炭柱、CM HF和D152離子交換柱的最高吸附率分別為86.42%、92.73%、90.15%、91.97%，而此時(shí)四種柱子吸附率最高時(shí)與之相應(yīng)的上樣液pH分別為7、7、7、5。因此，為保證上述四種柱子能夠最大吸附TTX，上樣時(shí)中性氧化鋁柱、活性炭柱和CM HF離子交換柱應(yīng)將pH調(diào)為7，D152離子交換柱上樣液pH應(yīng)調(diào)為5。

圖1 四種柱子在不同pH中的吸附率Fig.1 Adsorption rates of the four columns at different pH

2.2 不同凈化柱對(duì)TTX回收率條件的影響

假睛東方鲀肝臟粗提液中基質(zhì)復(fù)雜，含有大量的蛋白質(zhì)、色素、油脂等大分子雜質(zhì)，需要通過層析柱的處理，對(duì)河豚毒素粗提液進(jìn)行分離純化，去除色素、蛋白質(zhì)等其他雜質(zhì)，得到目標(biāo)物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)比較了TTX溶液分別在中性氧化鋁柱、活性炭柱、CM HF和D152離子交換柱凈化時(shí)的效果，確定不同柱子在洗脫時(shí)洗脫液的乙酸濃度，并根據(jù)洗脫液回收率選擇適合純化河豚毒素的柱子。如圖2所示，中性氧化鋁柱在乙酸濃度為2%～3%區(qū)間被洗脫出來，在洗脫液為2%乙酸溶液時(shí)存在一個(gè)較大的洗脫峰，當(dāng)洗脫液乙酸濃度為3%時(shí)仍有少量TTX被洗出，計(jì)算得到中性氧化鋁柱純化時(shí)TTX的總回收率為78.75%；圖3為活性炭柱純化時(shí)TTX的回收率曲線圖，由圖可知，當(dāng)洗脫液的為2%乙酸溶液時(shí)存在一個(gè)洗脫峰，計(jì)算活性炭柱的回收率為88.57%，且在洗脫過程中發(fā)現(xiàn)有部分活性炭會(huì)進(jìn)入洗脫液中，增加后續(xù)實(shí)驗(yàn)難度；圖4為CM HF柱純化時(shí)洗脫曲線，由圖可知TTX在洗脫液濃度為在1%乙酸溶液時(shí)較多洗脫出來，洗脫液乙酸濃度為2%乙酸溶液時(shí)仍有部被洗脫出來，當(dāng)濃度繼續(xù)增加不再有TTX洗脫下來，計(jì)算CM HF柱純化時(shí)的總回收率為83.13%；根據(jù)圖5中D152離子交換柱洗脫曲線圖可知，TTX在乙酸濃度為3%～4%存在洗脫峰，且測(cè)得洗脫液中TTX的總回收率總93.98%。綜上所述，D152離子交換柱在在四種柱子中的回收率最高，洗脫液濃度為3%～4%乙酸溶液，活性炭柱的回收率次之為88.57%，為減少純化過程中有效物質(zhì)的損失，D152離子交換柱和活性炭柱更符合純化柱的選擇。中氧化鋁柱和CM HF柱的回收率較低，吸附率也較低，純化過程中容易造成有效物質(zhì)的流失，降低純化效率，增加純化成本，因此不考慮后兩者進(jìn)行純化。

圖2 中性氧化鋁柱TTX洗脫曲線圖Fig.2 TTX elution diagram of neutral alumina column

圖3 活性炭柱TTX洗脫曲線圖Fig.3 TTX elution diagram of activated carbon column

圖4 CMHF離子交換柱TTX洗脫圖Fig.4 TTX elution diagram of activated carbon column

圖5 D152離子交換柱TTX洗脫曲線圖Fig.5 TTX elution diagram of D152 ion exchange column

2.3 實(shí)際樣品的驗(yàn)證

表1 不同型號(hào)柱子測(cè)定結(jié)果對(duì)比Table 1 The measurement results of different types of columns were compared

根據(jù)表1可知，活性炭柱的吸附率最高，D152柱的吸附率次之，但對(duì)比兩者解吸率D152柱的洗脫能力更強(qiáng)一些，且活性炭柱在洗脫過程中會(huì)引入新的雜質(zhì)，增加了純化的難度。在實(shí)際應(yīng)用中，凈化柱的吸附率和洗脫率越高，其有效成分損失越少，分離效率越高，降低了生產(chǎn)成本。綜合以上因素，選用D152離子交換柱作為河豚毒素粗提液的純化。

河豚毒素具有鎮(zhèn)痛、麻醉等作用，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有重要作用，但目前河豚毒素純品稀少，且價(jià)格昂貴，使河豚毒素應(yīng)用受到限制。目前河豚毒素的生成方法主要有海洋細(xì)菌生物合成法[22]、人工合成法[23]和以河鲀魚為原料的提取分離法。但微生物生產(chǎn)的TTX含量低且存在副產(chǎn)物較多，目前應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)較為困難；人工合成技術(shù)難度較大，且該技術(shù)尚未成熟，應(yīng)用推廣難度大，尚不適合工業(yè)推廣。目前市場(chǎng)河豚毒素的主要來源還是從有毒河鲀中提取和純化得來的。本實(shí)驗(yàn)選取勻漿好的假睛東方鲀肝臟10 g，按照1.2.3步驟進(jìn)行提取，將粗提液調(diào)pH，然后用D152離子交換柱純化得到洗脫液，最后對(duì)洗脫液濃縮，用8%～10%的氨水調(diào)節(jié)pH至中性，有白色固體析出，將白色固體洗滌3遍，進(jìn)行冷凍干燥，得到TTX粗品（粗品中含TTX及同系物），純度達(dá)80%。將純化后的河豚毒素樣品通過超高效液相色譜柱檢測(cè)，由圖6可知純化后的河豚毒素粗品與河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間相同，是目標(biāo)產(chǎn)物。

圖6 河豚毒素液相色譜圖Fig.6 Liquid chromatography of tetrodotoxin

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用層析技術(shù)對(duì)河豚毒素進(jìn)行分離純化，比較了中性氧化鋁柱、活性炭柱、CM HF柱和D152弱酸性陽離子交換柱分別對(duì)河豚毒素的純化效果，最終確定D152離子交換柱作為河豚毒素粗提液的純化柱，其中D152柱的上樣液最適pH為3，洗脫液為3%～4%乙酸水溶液兩個(gè)柱體積。并且經(jīng)過實(shí)際樣品驗(yàn)證得到純度為80%的河豚毒素粗品。通過一系列的提取，分離純化等步驟，將肝臟粗提液中的脂類，蛋白質(zhì)，色素等大分子雜質(zhì)得以除去，得到白色的河豚毒素粗品。粗品可經(jīng)過進(jìn)一步的分離純化得到TTX純品及TTX同系物純品，此項(xiàng)技術(shù)有待繼續(xù)研究。本實(shí)驗(yàn)以河鲀魚肝臟為原料提高資源利用率，減少有毒河鲀魚造成的環(huán)境污染，且實(shí)驗(yàn)操作流程簡(jiǎn)單，成本低廉，富集純化效果好，為進(jìn)一步制取河豚毒素純品提供便捷。