凝膠型菌落總數(shù)測試片的研制

王杰偉，吳艷輝，孫萬東，何艷玲

（北京陸橋技術股份有限公司，中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100123）

近些年，隨著國家對食品質(zhì)量管控的日趨嚴格，在食品檢測行業(yè)，作為必檢項目食品中菌落總數(shù)指標[1]檢測量激增，菌落總數(shù)是衡量食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標之一，為食品樣品的衛(wèi)生學評價提供科學依據(jù)。依據(jù)GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》標準，食品微生物菌群數(shù)量的檢測方法為平板培養(yǎng)法[2]，整體檢測流程費時費力，微生物菌落計數(shù)測試片檢測法是一種新型檢測方法，它是以凝膠、無紡布和濾紙3種主流載體替代瓊脂作為培養(yǎng)基載體培養(yǎng)微生物的一種檢測新技術。測試片作為在傳統(tǒng)瓊脂平板計數(shù)法基礎上經(jīng)過簡化和改進，形成的一種新型檢測方法，是微生物快速檢測方法發(fā)展的趨勢，測試方法的接受度逐年上升[3]。

國內(nèi)對于菌落總數(shù)測試片的研究以無紡布體系為主，隨著研究的不斷深入，無紡布體系菌落色素擴散、菌落顯色不清晰或連成片[4]，有的需要借助壓板固定菌落生長區(qū)等缺點，以及與傳統(tǒng)方法相比計數(shù)結果偏低[5]的問題逐漸顯露，因此，無紡布應用于菌落總數(shù)測試片還需進一步改善，目前并尚無理想改進方案。

本研究針對無紡布載體測試片的弊端，進行冷水可溶凝膠測試片的研制。冷水可溶凝膠作為一種親水膠體，在適當?shù)呐浔认驴商峁┹^好的固化粘合作用[6]，可起到替代瓊脂粉的效果，因此相比無紡布體系菌落測試片，凝膠體系菌落測試片可為微生物提供與GB 4789.2-2016傾注培養(yǎng)法更為接近的生長環(huán)境，從而得到更為準確的檢測結果。本文以GB 4789.2-2016平板計數(shù)培養(yǎng)基為基礎，使冷水可溶凝膠替代瓊脂粉，進行凝膠體系菌落總數(shù)測試片的研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

1.1.1 主要試劑

腦心浸液肉湯（BHI）、平板計數(shù)瓊脂由北京陸橋技術股份有限公司提供；3M Petrifilm菌落總數(shù)測試片購自3M中國有限公司；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）購自SIGMA公司；瓜爾膠、聚丙烯酸鈉、黃原膠、卡拉膠、高吸水樹脂（SAP）、丙酮酸鈉購自阿拉丁試劑有限公司；聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜、聚乙烯膜、聚丙烯膜購自上海晶華膠粘新材料股份有限公司；紙基膠板購自上海金標生物科技有限公司。

1.1.2 菌株

大腸埃希氏菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC6538、銅綠假單胞菌ATCC10104、阪崎克羅諾桿菌ATCC29544、單增李斯特氏菌ATCC19111購自美國菌種保藏中心；枯草芽孢桿菌CMCC63501購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

分別挑取上述試驗菌株的單菌落接種于腦心浸液肉湯中，于36 ℃培養(yǎng)24 h。取1 mL菌液加入9 mL無菌生理鹽水中混合均勻，即為10-1稀釋液，重復上述操作將菌液稀釋至適宜稀釋度，得到菌落總數(shù)處于102CFU/mL的各標準菌株菌懸液；將大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌與枯草芽孢桿菌四種標準菌株菌懸液各取2 mL混合，得到混合菌液。

1.2.2 測試片的制備

測試片上層覆膜為PET塑料膜，底板為200 g防水型背膠相紙，將培養(yǎng)基各組分混合均勻后添加于測試片底板培養(yǎng)區(qū)域。

1.2.3 菌落總數(shù)測試片覆膜的確定

分別選用厚度為0.2 mm的聚乙烯膜、聚丙烯膜、PET膜作為覆膜，使用200 g/m2紙基膠板作為下基材。按照38.5 g/L BHI（本研究后續(xù)試驗中BHI添加量均為38.5 g/L），卡拉膠15 g/L的添加量混合均勻，涂布于基材上制成菌落總數(shù)測試片，接種銅綠假單胞菌菌液，于36 ℃培養(yǎng)24 h觀察菌落狀態(tài)。

1.2.4 菌落總數(shù)測試片培養(yǎng)基組分的確定

1.2.4.1 冷水可溶凝膠的篩選

冷水可溶凝膠的篩選參照Ren[7]等的相關信息，選擇瓜爾膠、聚丙烯酸鈉、黃原膠、卡拉膠進行試驗。將各冷水可溶凝膠均按照15 g/L的添加量，分別與BHI培養(yǎng)基進行混合，均勻添加至測試片培養(yǎng)區(qū)域，接種枯草芽孢桿菌菌液，于36 ℃培養(yǎng)24 h。綜合測試片理化與微生物生長狀態(tài)篩選冷水可溶凝膠。

1.2.4.2 單因素-正交實驗確定培養(yǎng)基組分

（1）TTC添加量水平的確定[8,9]

分別將0.006、0.007、0.008、0.009與0.01 g/L TTC與BHI培養(yǎng)基，15 g/L復合凝膠（黃原膠：卡拉膠=1:1，下同），0.05 g/L SAP以及1.5 g/L丙酮酸鈉混合后均勻添加至測試片培養(yǎng)區(qū)域，接種1 mL混合菌液于37 ℃培養(yǎng)24 h統(tǒng)計菌落數(shù)量。

（2）SAP添加量水平的確定

分別將0.03、0.04、0.05、0.06和0.07 g/L SAP與BHI培養(yǎng)基、復合凝膠、0.008 g/L TTC以及1.5 g/L丙酮酸鈉混合后均勻添加至測試片培養(yǎng)區(qū)域，接種1 mL混合菌液，于37 ℃培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計菌落數(shù)量。

（3）丙酮酸鈉添加量水平的確定

分別將0.5、1.0、1.5、2.0與2.5 g/L丙酮酸鈉與BHI培養(yǎng)基，復合凝膠，0.008 g/L TTC以及0.05 g/L SAP混合后均勻添加至測試片培養(yǎng)區(qū)域，接種1 mL混合菌液，于37 ℃培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計菌落數(shù)量。

（4）培養(yǎng)基組分最優(yōu)組合的確定

在上述試驗結果的基礎上，根據(jù)所確定的TTC添加量范圍（0.007 L、0.008、0.009 g/L）、SAP添加量范圍（0.04、0.05、0.06 g/L）以及丙酮酸鈉添加量范圍(1.0、1.5、2.0 g/L)，進行三因素三水平正交試驗，以確定三種關鍵組分在培養(yǎng)基中的最優(yōu)組合。

1.2.5 冷水可溶性凝膠比例的確定

按照15 g/L的總凝膠添加量，黃原膠與卡拉膠復配比例分別為9:1、8:2、7:3、6:4、5:5，與優(yōu)化后的培養(yǎng)基混合后均勻添加至測試片培養(yǎng)區(qū)域，接種1 mL混合菌液，于37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察測試片理化狀態(tài)并統(tǒng)計菌落數(shù)量。

1.2.6 菌落總數(shù)測試片的性能評價

本文所研制的菌落總數(shù)測試片的性能，通過靈敏度、準確度兩項指標，與GB 4789.2-2016平板計數(shù)法以及當前市場占有率最高的3M Petrifilm測試片進行比對驗證并評估。

1.2.6.1 靈敏度

將制備好的混合菌液，以生理鹽水進行梯度稀釋至10-2~10-7，分別使用測試片方法、GB 4789.2-2016平板計數(shù)法以及3M Petrifilm測試片進行菌落計數(shù)，試驗設置三個平行，以最低稀釋度的檢測結果作為最低檢測限，以最低檢測限作為測試片靈敏度的檢測標準。檢測結果大于最低檢測限的為陽性，檢測結果小于最低檢測限的為陰性，靈敏度=陽性/（陽性+陰性）[10]。

1.2.6.2 準確度檢測

將6種標準菌菌懸液，以無菌生理鹽水稀釋至102CFU/mL，同時選取散裝熟食、散裝糕點、生雞肉、奶粉等菌落總數(shù)相對較高的市售食品樣品，分別進行10-2~10-5稀釋，各標準菌株以及實際樣品稀釋液均分別使用測試片方法、GB 4789.2-2016平板計數(shù)法以及3M Petrifilm測試片進行菌落計數(shù)，其中實際樣品檢測統(tǒng)計菌落數(shù)處于102CFU/mL稀釋度的結果。建立標準菌株測試片法-國標法以及測試片法3M Petrifilm法檢測結果的標準曲線。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

本試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件進行處理，靈敏度檢測數(shù)據(jù)采用t檢驗，以p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義；準確度檢測采用線性回歸分析以檢驗不同方法檢測結果的一致性。各組試驗均重復三次，檢測結果使用平均值±標準偏差表示。

2 結果與討論

2.1 覆膜的確定

測試片的覆膜除作為結果觀察與計數(shù)的窗口外，對于保證測試片培養(yǎng)區(qū)域的氧氣供應起著決定作用。本研究中選用好氧程度較高的銅綠假單胞菌進行試驗，結果表明，以聚乙烯和聚丙烯材質(zhì)作為覆膜的測試片中銅綠假單胞菌生長狀態(tài)差顯色均過淺，無法準確計數(shù)，而以PET材質(zhì)作為覆膜的測試片中菌落生長良好顯色清晰，說明PET材質(zhì)微觀結構有一定程度上利于氧氣自由擴散[11]，對好氧菌的促生長效果更理想，更為適宜作為測試片的覆膜材質(zhì)，各種材質(zhì)覆膜制備的測試片效果見圖1。

圖1 不同上基材制備測試片的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of testing plates prepared by 3 different upper substrates

2.2 冷水可溶凝膠的篩選

菌落測試片中冷水可溶凝膠的性能要求包括：結構穩(wěn)定，不可被液化能力較強的芽孢桿菌所分解液化；復水后阻隔性強，可阻斷色素在培養(yǎng)體系中的過度擴散，從而使色素聚集于菌落周邊，避免產(chǎn)生色素暈圈，便于計數(shù)；水擴散性能理想，樣品稀釋液加入培養(yǎng)區(qū)域后可自由擴散至整個培養(yǎng)區(qū)域且時間盡量短，方便實驗操作并節(jié)省試驗時間。本試驗中選用凝膠液化能力強，菌落色素擴散較嚴重的枯草芽孢桿菌檢測各種冷水可溶凝膠的穩(wěn)定性，同時觀察菌落暈圈情況及稀釋液自由擴散至整個培養(yǎng)區(qū)域的時間。各冷水可溶凝膠培養(yǎng)后的菌落形態(tài)與性能比對情況見表1與圖2。

表1 各冷水可溶性凝膠性能比對Table 1 Comparison of cold water soluble gel

本試驗表明，四種冷水可溶凝膠制作的測試片中，菌落數(shù)量及大小差異不大；聚丙烯酸鈉與瓜爾膠穩(wěn)定性較差[12]，對應的測試片均被嚴重液化，不適用于作為測試片中的凝膠組分；卡拉膠有輕微程度的液化以及因菌落色素擴散產(chǎn)生的暈圈，稀釋液在測試片表面擴散速度最快；黃原膠擴散速度慢[13]，但具有優(yōu)越的穩(wěn)定性以及色素阻隔性能。

本試驗所選用的四種冷水可溶凝膠中的任何一種均無法滿足菌落總數(shù)測試片對于凝膠的要求，綜合考慮上述試驗中各凝膠的技術指標，水擴散性能優(yōu)勢且結構穩(wěn)定性尚可的卡拉膠，恰好與結構穩(wěn)定但水擴散性能略有欠缺的黃原膠形成互補，因此本試驗選用以黃原膠為主體，同時添加少量比例的卡拉膠作為復合凝膠進行后續(xù)試驗研究。

圖2 不同冷水可溶凝膠制備測試片的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of testing plates prepared by different gel

2.3 培養(yǎng)基組分單因素實驗

TTC作為測試片中菌落生長指示劑，相對于其他指標劑靈敏準確，且常溫下它與菌落形成的顏色在空氣中穩(wěn)定，可長時間保存，但濃度過高時對于微生物，尤其是革蘭氏陽性細菌造成較強的抑制，需根據(jù)測試片菌落顏色清晰且計數(shù)準確的實際需求對TTC的使用濃度進行優(yōu)化[14]。TTC添加量為0.006 g/L時，菌落顯色略淺尚無法清晰計數(shù)，TTC添加量為0.008 g/L時菌落顯色明顯（見圖3）且未表現(xiàn)出明顯的抑制性，當TTC添加量達到0.01 g/L時菌落數(shù)量明顯減少，因此確定TTC最佳添加量為0.008 g/L。

SAP親水性強，將其添加于培養(yǎng)基組分中作為分散劑，可顯著提升測試片的水擴散速度，但其含量過高時也會對微生物生長形成負作用。不同SAP添加量的測試片菌落數(shù)量見圖4，SAP添加量越高測試片水擴散速度越快，添加量達到0.07 g/L時對微生物表現(xiàn)出一定的抑制性，SAP的最佳添加量為0.05 g/L，此時測試片水擴散速度為3~5 s。

圖3 不同TTC添加量對菌落顯色狀態(tài)的影響Fig.3 Effect of different TTC concentration on colony chromogenic reation

微生物在正常生長過程中因需氧代謝會生成過氧化氫等有毒代謝產(chǎn)物[15]，丙酮酸鈉在酸性條件下分解產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸一方面可進行三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量，供微生物合成代謝酶分解過氧化氫，同時還可直接還原過氧化氫解除其毒害作用。因此丙酮酸鈉對于促進微生物生長，修復損傷菌有著重要作用。由圖4可知當丙酮酸鈉添加量達到1.5 g/L后，菌落數(shù)量趨于平穩(wěn)，因此確定丙酮酸鈉的添加量為1.5 g/L。

2.4 培養(yǎng)基組分最優(yōu)組合的確定

根據(jù)1.2.4.2中確定的三種關鍵組分添加量范圍，進行三因素三水平正交試驗，結果見表2，影響培養(yǎng)基效果關鍵組分主次順序為A(丙酮酸鈉)>B(TTC)>(SAP)，最佳水平組合為C3A2B2，即三種組分的最優(yōu)組合方式為TTC 0.008 g/L，SAP 0.05 g/L，丙酮酸鈉2.0 g/L。按照最優(yōu)組合再次進行驗證，菌落總數(shù)為213 CFU/mL，與表2中試驗5結果相符。

表2 培養(yǎng)基關鍵組分正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results of the key components

表3 不同冷水可溶凝膠復配比例測試片效果Table 3 Effect of different cold water soluble gel ratio testing plate

表4 菌落總數(shù)測試片靈敏度檢測Table 4 Sensitivity detection of testing plate

2.5 冷水可溶凝膠比例的確定

不同黃原膠與卡拉膠比例下測試片水擴散速度、培養(yǎng)基液化情況、菌落色素擴散情況與菌落數(shù)量見表3，黃原膠與卡位膠比例為9:1與8:2時，測試片培養(yǎng)基無液化以及菌落色素擴散，但相比于9:1時水擴散速度6~7 s，8:2水擴散速度可達到3~4 s，此優(yōu)勢相當于在實際檢測過程中縮短了整體檢測周期，尤其在樣品量大時此優(yōu)勢更為明顯；黃原膠與卡位膠比例為7:3時，隨著卡拉膠比例的增加，測試片出現(xiàn)了5%左右的液化，雖然此時水擴散速度也有了小幅度增加，但僅為改善0.2~0.3 s水擴散性能而犧牲掉5%液化并非理想的選擇；黃原膠與卡位膠比例為6:4以及5:5時測試片液化比例已經(jīng)較高，因此將黃原膠:卡拉膠為8:2作為冷水可溶凝膠復配比例。

2.6 性能評價

2.6.1 靈敏度檢測

靈敏度試驗結果見表4，本文所研制的菌落總數(shù)測試片、國標方法以及3M Petrifilm測試片的檢測限均為2 CFU/mL。本文所研制的菌落總數(shù)測試片與國標方法對菌落數(shù)量為30~300之間的可計數(shù)樣本進行計數(shù)與分析，t=2，p=0.18>0.05，說明菌落總數(shù)測試片與國標方法檢測結果無差異顯著性。

2.6.2 準確度檢測

使用菌落總數(shù)測試片與GB 4789.2-2016傾注法對各標準菌株進行菌落總數(shù)檢測，兩種檢測方法的線性相關曲線見圖5，由本試驗結果可知，菌落總數(shù)測試片與國標方法檢測結果具有良好的線性關系，R2達到0.994，表明兩種檢測方法對于包括標準菌株與實際樣品在內(nèi)所有樣本的計數(shù)結果無差異顯著性。

圖5 測試片法與國標法檢測結果相關曲線Fig.5 Linear correlation curve of test results between

圖6 測試片法與3M檢測結果相關曲線Fig.6 Linear correlation curve of test results between testing plate and national standard method testing plate method and 3M Petrifilm method

測試片法-3M Petrifilm法的線性相關曲線見圖6，對于標準菌株以及實際樣品，菌落總數(shù)測試片與當前市場占有率最高的測試片產(chǎn)品-3M Petrifilm檢測結果的線性關系達到0.99，說明本文所研制的菌落總數(shù)測試片可應用于食品微生物檢測。

3 結論

本文以四種食品檢測中常見的條件致病菌為試驗菌株，通過篩選基材，優(yōu)化培養(yǎng)基干粉的組分，研制菌落總數(shù)測試片；在優(yōu)化培養(yǎng)基干粉組分這一核心環(huán)節(jié)上，首先通過理化性狀及菌落生長狀態(tài)篩選出黃原膠與卡拉膠作為測試片冷水可溶性凝膠；再通過單因素-正交實驗確定培養(yǎng)基中關鍵組分TTC、SAP與丙酮酸鈉的添加量分別為0.008 g/L、0.05 g/L與2.0 g/L；最后確定復合凝膠內(nèi)黃原膠與卡拉膠的比例為8:2（m/m）。菌落總數(shù)測試片與國標中平板計數(shù)法以及3M Petrifilm測試片進行比對，標準菌株與實際樣品檢測線性相關性均良好，R2均達到0.99以上，測試片檢出限可達2 CFU/mL，靈敏度達到100%，說明本文研制的菌落總數(shù)測試片可應用于食品微生物檢測領域，同時對于不同基質(zhì)的樣品均有較理想的適用性。在食品檢測行業(yè)精準高效的發(fā)展趨勢下，相比于國標方法，測試片方法具有明顯的優(yōu)勢，在檢測流程上省去了培養(yǎng)基制備、高壓、冷卻、倒平板等工序，極大簡化了檢驗流程；在微生物定量結果準確性保證上，測試片法避免了國標傾注法在傾倒培養(yǎng)基時對細菌的熱損傷，同時適量TTC的加入使得培養(yǎng)后菌落更易識別，不存在國標平板計數(shù)法在讀取結果時生長于培養(yǎng)基內(nèi)部的細菌形態(tài)過小不易識別的問題；另外測試片體積極小，便于培養(yǎng)、保存與運輸。在檢測成本方面，雖然測試片在直接材料成本上高于國標方法，但如考慮到測試片法無繁瑣的平板制備工序，節(jié)省人工縮短、總體檢測周期短從而隱形成本更低，測試片法在總成本上與國標法差距并不明顯，而且在檢測量越大時優(yōu)勢越明顯。因此本文所研制的測試片方法在檢測行業(yè)具有廣闊的應用前景。