小柴胡湯化裁方對(duì)AD 小鼠記憶認(rèn)知能力及海馬神經(jīng)元形態(tài)的影響?

陳 靖，王 卉△，劉曉丹，許欣竹，劉文俊，謝 鑫

1 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847；2 中國(guó)中醫(yī)藥國(guó)際合作中心

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）又稱老年癡呆癥，是一種認(rèn)知功能障礙及漸進(jìn)性記憶障礙的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，其特征性病理主要標(biāo)志是β淀粉樣蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）沉積形成的細(xì)胞外老年斑和由Tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFTs）及神經(jīng)元丟失伴膠質(zhì)細(xì)胞增生［1］。

相關(guān)研究［2-4］證實(shí)，有效心理干預(yù)可緩解高齡癡呆患者抑郁表現(xiàn)，改進(jìn)各項(xiàng)生活功能。而情志不暢，氣機(jī)升降失常，易生濕釀痰，導(dǎo)致經(jīng)絡(luò)失養(yǎng)，誘導(dǎo)發(fā)生AD，加重病情，小柴胡湯是調(diào)暢氣機(jī)代表方劑，本研究觀察疏肝理氣，補(bǔ)腎填精的小柴胡湯化裁方對(duì)AD 小鼠水迷宮測(cè)試學(xué)習(xí)記憶能力和海馬組織形態(tài)學(xué)的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物SPF 級(jí)雄性昆明種小鼠（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）60 只，體質(zhì)量20～30 g，SPF 級(jí)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，溫度20～25℃，濕度55%～65%。

1.2 藥物尼莫地平（亞寶藥業(yè)，國(guó)藥準(zhǔn)字H14022821，規(guī)格：20 mg×50 s）；小柴胡湯化裁方（柴胡40 g，黃芩15 g，人參15 g，半夏15 g，炙甘草10 g，生姜10 g，大棗4枚，肉蓯蓉20 g，熟地黃20 g），適量水煎，大火煎沸后，再用小火煎20～30 min。頭煎30 min，第二次煎煮20 min，合并兩次藥液，在室溫條件下濃縮成含生藥1 g/mL的藥液備用。

1.3 試劑Aβ1-42（Sigma）；4%多聚甲醛（武漢博士德）；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（Solarbio 公司，貨號(hào)：G1120）。

1.4 設(shè)備Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)（成都泰盟公司）；DW-5 型腦立體定位儀（成都泰盟公司）；BX-50型光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.5 方法

1.5.1 造模及分組給藥 將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、西藥組及中藥高、中、低劑量組，每組5 只。除正常組外，其他各組參考文獻(xiàn)［5］制備AD小鼠模型，實(shí)驗(yàn)前將Aβ1-42用生理鹽水稀釋成5 μg/μL，放37℃恒溫水浴鍋中孵育7 天，老化呈凝聚絲狀。各組小鼠用5%的水合氯醛麻醉，固定于腦立體定位儀上，常規(guī)消毒后，切開頭皮，以雙側(cè)海馬CA1 區(qū)為給藥點(diǎn)，定位點(diǎn)位于前囟后2.3 mm，矢狀縫兩側(cè)旁開1.8 mm，進(jìn)針深度為顱骨表面向下2.0 mm。用微量進(jìn)樣器向每只小鼠雙側(cè)海馬各注入5 μg/μL Aβ1-42。進(jìn)針?biāo)俣葹? mm/min，注射速度為1 μg/min，留針5 min后以同樣速度緩慢拔出進(jìn)樣器。術(shù)后消毒縫皮，常規(guī)飼養(yǎng)。造模后7天開始給藥，中藥組灌胃小柴胡湯化裁方高（40 g/kg）、中（20 g/kg）、低（10 g/kg）劑量（按照人與小鼠體表面積比換算給藥等效劑量），西藥組灌胃尼莫地平15 mg/kg，正常組灌胃等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)21天。

1.5.2 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) 學(xué)習(xí)記憶檢測(cè)：藥物干預(yù)后采用Morris 水迷宮對(duì)小鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，測(cè)試內(nèi)容包括第1～4 天的定位航行和第5天的空間探索。Morris 水迷宮裝置為一直徑為100 cm，高約70 cm的圓形桶，將第三象限設(shè)置為目標(biāo)象限，象限中心放置逃生平臺(tái)，距離液面以下2 cm。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間位置保持不變。水池上方約2 m 處放置攝像機(jī)，自動(dòng)釆集小鼠游泳圖像，將所收集實(shí)驗(yàn)信號(hào)輸入計(jì)算機(jī)，利用圖像自動(dòng)采集和分析系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的運(yùn)行軌跡、逃避潛伏期、各平臺(tái)象限的游泳時(shí)間和路程等參數(shù)進(jìn)行自動(dòng)分析處理。定位航行：將小鼠面對(duì)池壁從1、2、3、4 象限分別緩慢放入水中，逃逸潛伏期以90 s計(jì)算，可人為將其拿到平臺(tái)上并停留10 s 后，再?gòu)牧硪幌笙奕胨?。? 天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，移去平臺(tái)，小鼠從選定象限頭朝池壁入水，記錄小鼠90 s 內(nèi)穿越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。

1.5.3 HE 染色 取4%多聚甲醛固定的海馬組織，固定組織脫水、透明，樣本浸蠟包埋，石蠟包塊切片，脫蠟處理，蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察AD小鼠海馬組織形態(tài)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果各組逃避潛伏期隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加而逐漸下降，前3天各組無明顯差異，第4天，與正常組比較，模型組潛伏期增加（P＜0.05），提示AD 小鼠出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)障礙；與模型組比較，中藥高劑量組和西藥組潛伏期縮短（P＜0.05）。模型組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)少于正常組（P＜0.05），說明癡呆小鼠記憶力下降；與模型組比較，中藥各組癡呆小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)均不同程度增加，中藥高劑量組和西藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1—2。

表1 各組小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（）

表1 各組小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（）

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

圖1 小鼠逃避潛伏期

圖2 小鼠空間探索次數(shù)

2.2 海馬組織HE染色結(jié)果模型組小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞增加，錐體神經(jīng)細(xì)胞帶不完整，神經(jīng)元喪失，部分為膠質(zhì)細(xì)胞所取代。正常組細(xì)胞排列緊密，核染均勻，與模型組比較，中藥高、中劑量組和西藥組海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及神經(jīng)元喪失減輕，膠質(zhì)細(xì)胞呈散在分布。見圖3。

圖3 海馬組織HE染色結(jié)果（×200）

3 討論

AD 是一種進(jìn)行性、發(fā)病隱匿的神經(jīng)系統(tǒng)性病變之一［6-9］，淀粉樣蛋白沉積后誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞活化，神經(jīng)元損傷，促進(jìn)上調(diào)炎癥反應(yīng)［10］，并誘發(fā)學(xué)習(xí)記憶能力減退，病情呈進(jìn)行性發(fā)展。相關(guān)研究顯示，在AD 致病因素中，抑郁情緒高于50%［11］，據(jù)此，BENNETT 等［12］提出抑郁癥可能是引發(fā)AD 的1項(xiàng)因素，此癥狀為AD的前驅(qū)病癥。

AD 病因復(fù)雜，較常見的學(xué)說包括Aβ 毒性假說、膽堿能學(xué)說、炎癥刺激反應(yīng)學(xué)說、自由基損傷學(xué)說、Tau蛋白異常磷酸化等［13-15］。AD發(fā)病群體中抑郁癥可能是重要致病危險(xiǎn)因素，并且抑郁癥癥狀在AD 臨床診斷之前就已出現(xiàn)。抑郁癥患者患AD 的發(fā)病率高于非抑郁癥者［16］。AD 發(fā)病機(jī)理以肝氣凝聚、髓?？仗?、腎精缺乏為主。對(duì)于高齡者而言，腎精氣虛，不能充分滋養(yǎng)髓海，反應(yīng)性降低，神情木訥。諸多消極因素包括空虛、抑郁、生活壓力等均會(huì)導(dǎo)致肝失疏泄，心理抑郁，經(jīng)絡(luò)受阻，長(zhǎng)期以往導(dǎo)致瘀、濕、痰等的形成，無法充分滋養(yǎng)腦海，導(dǎo)致認(rèn)知困難。

本研究以小柴胡湯為基礎(chǔ)方化裁，可理氣開郁，補(bǔ)腎填精，切中AD 病機(jī)。水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，模型組小鼠潛伏期增加，跨越平臺(tái)次數(shù)減少，中藥尤其是高劑量干預(yù)小鼠潛伏期縮短，跨越平臺(tái)次數(shù)增加，說明模型組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，而中藥干預(yù)有效。海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞HE 染色說明模型組小鼠符合AD 疾病發(fā)展規(guī)律，神經(jīng)元缺失，細(xì)胞松散，導(dǎo)致負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)記憶功能的海馬組織受損傷，進(jìn)而出現(xiàn)行為學(xué)變化，高劑量中藥從AD 病機(jī)出發(fā)，能有效改善AD 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，保護(hù)海馬神經(jīng)元組織。