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    抗疏強骨顆粒對去卵巢模型大鼠血清ALP 及TRACP5b 的影響?

    2021-06-04 06:52:28陳丹丹歐國峰王國柱袁普衛(wèi)
    西部中醫(yī)藥 2021年5期
    關(guān)鍵詞:血清模型

    陳丹丹,董 博,歐國峰,王國柱,肖 斌,陳 瑞,袁普衛(wèi),方 晴

    1 陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽 712046;2 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院;3 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院

    骨質(zhì)疏松癥是一種全身性代謝性疾病,主要表現(xiàn)為骨量低下或骨微觀結(jié)構(gòu)改變,進而引起骨脆性和骨折風險增加[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計,目前世界上原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者已超過2 億,世界衛(wèi)生組織將其列為老年人三大疾病之一[2]。本病屬祖國醫(yī)學(xué)“骨痿”“骨痹”等范疇,雖然其病因和發(fā)病機制尚未完全闡明,但中醫(yī)藥治療具有明顯優(yōu)勢[3-5]??故鑿姽穷w粒是陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑,在治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥方面取得了良好效果[6]。本研究旨在觀察抗疏強骨顆粒對去卵巢模型大鼠血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和人抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate resistant acid phosphatase 5b,TRACP5b)的影響,探討其作用機理。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物選用6 月齡清潔級未懷孕雌性大鼠100 只,體質(zhì)量約(200±50)g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供,檢疫符合實驗研究標準,生產(chǎn)許可證號:SCXK(陜)2017-003。

    1.2 實驗藥物抗疏強骨顆粒由陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中草藥房提供,藥物組成:黃芪30 g,熟地黃15 g,淫羊藿15 g,肉蓯蓉15 g,菟絲子15 g,當歸12 g,丹參12 g,三七6 g,延胡索15 g,白芍12 g,骨碎補15 g,牛膝15 g,甘草10 g,1 g干浸中藥粉末相當于2.83 g生藥。

    1.3 實驗主要試劑與儀器ALP 試劑盒(批號:

    AR0019)、TRACP5b 試劑盒(批號:ST1021)均由陜西博達生物科技有限公司提供;蘇木素染液(批號:ST047);伊紅染液(批號:G1120)均由北京索萊寶科技有限公司提供;固定板、手術(shù)器械、離心管、移液槍、EP 管等;2135 型石蠟切片機(德國萊卡);DM400B生物顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

    1.4 方法

    1.4.1 造模方法 除正常組外,其他組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開始造模,造模前將大鼠禁食、禁水24 h,10%水合氯醛(0.15 mL/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉,待大鼠進入睡眠狀態(tài)(麻醉滿意)后俯臥固定,剔除腰脊背部兩側(cè)毛發(fā),用濕紗布擦拭,手術(shù)部位擦干凈后進行局部消毒,沿腰椎左側(cè)切開1 cm 皮膚,取出筋膜,分離肌肉后可見腎臟外下方呈淡粉色的卵巢及緊密相連的子宮角,在子宮上端及下部輸卵管部位結(jié)扎[7],切斷子宮角,摘除卵巢并稱重,用同樣的方法切除右側(cè)卵巢,清洗后依次逐層關(guān)閉切口,齒鑷對皮后縫合皮膚,傷口涂抹紅霉素并用消毒紗布包扎。術(shù)后臀肌注射青霉素(40 萬IU/kg)7天,每天1次,預(yù)防感染。該“切除雙側(cè)卵巢”造模方法于1969年由Saville最先建立,經(jīng)過長期反復(fù)實驗驗證,具有可靠性,國內(nèi)外應(yīng)用廣泛[8]。飼養(yǎng)90 天后造模組大鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、精神不振等癥狀,骨組織病理切片示出現(xiàn)骨質(zhì)疏松病理改變,提示造模成功。

    1.4.2 分組及給藥 根據(jù)隨機數(shù)字表法將造模后的大鼠分為模型組和中藥(大、中、小劑量)組,另設(shè)未造模正常組,每組20 只分籠飼養(yǎng),予抗生素常規(guī)喂養(yǎng)7日后開始給藥,中藥大、中、小劑量組按照相應(yīng)劑量灌胃給藥(2.865、1.432、0.714 mg/kg)抗疏強骨顆粒,均分別制成2 mL 溶液灌胃),每日1 次,每周6 次,連續(xù)給藥3 個月,正常組和模型組正常飼養(yǎng)不給藥。為計量準確,灌胃期間,每2 周用電子天枰稱體質(zhì)量1次。

    1.4.3 標本采集 正常組正常飼養(yǎng)2 周、模型組于造模成功后處死取材。其余各組在完成3 個月灌胃給藥后,10%水合氯醛(0.15 mL/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉(取材前1 天需禁食24 h),待麻醉滿意后腹部備皮消毒。1)取血:沿腹部中線切開至腹腔,拔開腸管在腹腔后壁可見腹主動脈,用采血針穿刺腹主動脈將血標本采集在負壓采血管中3 mL,拔除采血管。將血液離心后取上清液,離心半徑10 cm,3000 r/min,離心20 min,放入無菌EP 管置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?)骨組織切片取材:取大鼠右側(cè)股骨去除肌肉和筋膜,保留骨膜部分,取出股骨遠端,置于10%福爾馬林溶液中固定24 h,然后置于10%脫鈣液中,脫鈣液每天更新,直到可以用大頭針輕輕刺入,大約用時3周。

    1.4.4 觀察指標 觀察正常組、模型組和中藥(大、中、小劑量)組給藥前后大鼠一般情況(包括體質(zhì)量、精神狀態(tài)、毛發(fā)顏色和光澤等);使用ElISA 方法檢測大鼠血清ALP 和TRACP5b,繪制相關(guān)曲線以確定其含量;將脫鈣后的股骨標本常規(guī)包埋并用HE 染色觀察鏡下骨小梁結(jié)構(gòu)及骨細胞和骨髓脂肪細胞的形態(tài)。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù),計量資料以表示,采用單因素方差分析,組間多重比較方差齊用LSD-t檢驗,方差不齊用Tambane's T2 法,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 一般情況正常組大鼠除體質(zhì)量增加外,其他(精神狀況、毛發(fā)顏色和光澤等)無明顯異常;手術(shù)當天,所有造模大鼠精神較差,活動較少,術(shù)后第4 天精神狀態(tài)和活動基本恢復(fù)正常,能夠正常飲水和進食。造模組大鼠造模90 天后精神狀況較差,毛發(fā)顏色晦暗無光澤,體質(zhì)量下降顯著,偶有毛發(fā)脫落等;給予相應(yīng)劑量藥物灌胃后大鼠精神狀況尚可,毛發(fā)色澤較正常組稍差,體質(zhì)量輕微下降,整體接近正常組大鼠狀態(tài)。

    2.2 各組大鼠股骨病理切片正常組大鼠細胞結(jié)構(gòu)清晰,大小、形態(tài)正常;模型組軟骨細胞顯示有空骨陷窩,細胞核聚縮,且排列不整齊,骨小梁內(nèi)骨細胞明顯減少;中藥(大、中、小劑量)組軟骨細胞排列規(guī)則,結(jié)構(gòu)完整,空骨陷窩罕見,接近正常組。見圖1。

    圖1 各組動物骨組織HE染色結(jié)果(×40)

    2.3 血清ALP 及TRACP5b 含量與正常組比較,模型組血清ALP及TRACP5b含量上升,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,中藥大、中、小劑量組血清ALP及TRACP5b含量下降,中劑量組含量最低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

    表1 各組大鼠血清ALP及TRACP5b含量()

    表1 各組大鼠血清ALP及TRACP5b含量()

    注:*表示與正常組比較,P<0.05;#表示與模型組比較,P<0.05;△表示與中藥中劑量組比較,P<0.05

    3 討論

    骨質(zhì)疏松癥是一種全身性骨病,系因各種原因?qū)е鹿橇繙p少或骨微結(jié)構(gòu)改變,最終因骨骼變脆易于發(fā)生骨折[9-10]。有研究[10]表明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生與體內(nèi)雌激素分泌水平有密切聯(lián)系,雌激素對骨代謝具有調(diào)節(jié)作用。祖國醫(yī)學(xué)認為人體是一個有機整體,五臟六腑、氣血陰陽之間相互作用和影響,腎主骨,腎精不足則骨髓不滿,故從腎論治各醫(yī)家達到共識[11-13]。肝腎同源,主疏泄,主藏血,兩者之間互相轉(zhuǎn)化,若肝失疏泄,血與精津液生產(chǎn)及運行受到影響,骨不得充,筋骨不堅,引起疼痛[14-15]。陜西省名中醫(yī)劉德玉教授認為骨瘺(骨質(zhì)疏松癥)是因人素體虛弱,臟腑虛衰,耗損正氣,以致肝腎虧虛為本,正氣不足,無力生血行血,血行不暢,筋骨經(jīng)脈不得濡養(yǎng),導(dǎo)致骨質(zhì)疏松性骨折,肝腎不足是基礎(chǔ),以補益肝腎為治療大法?!翱故鑿姽穷w?!币渣S芪、熟地黃為君,益氣助陽、補肝益腎;仙靈脾、肉蓯蓉、菟絲子補腎健脾,強筋健骨;當歸、丹參、三七活血化瘀補血;延胡索、白芍活血止痛;骨碎補、牛膝補肝腎強筋骨;甘草益氣止痛,調(diào)和諸藥。組方立法嚴謹,既不忘補肝腎強筋骨,同時兼活血化瘀止痛,標本兼治,正中病因病機。

    TRACP5b 是破骨細胞分泌的糖基化蛋白酶,是人體骨吸收的敏感指標。人體血清中存在TRACPa、TRACPb 兩種類型,且二者含量相近,來源不同,在唾液酶作用下二者可相互轉(zhuǎn)化。來源于巨噬細胞的TRACPa 無酶活性,破骨細胞分泌的TRACPb 具有酶活性,且不受肝腎代謝影響,晝夜數(shù)值較穩(wěn)定,具有廣泛的應(yīng)用性。SALMINEN 等[16]通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)TRACPb 是一個敏感度高、可靠性強的骨吸收檢測指標。向青等[17]對大量正常及骨質(zhì)疏松患者臨床研究發(fā)現(xiàn)其血清TRACPb水平不同程度升高,證實TRACPb 是一個較好的骨吸收指標,可在一定程度上代替骨密度儀作為反映骨丟失速率的重要指標。堿性磷酸酶ALP 是反應(yīng)骨轉(zhuǎn)換的常用指標,其在人體中分布廣泛,血清ALP 主要來源于骨組織與肝臟。相關(guān)研究[18-20]表明堿性磷酸酶與骨礦物質(zhì)化密切相關(guān),堿性磷酸酶水平可反映成骨細胞活性,是目前評估人體骨礦化障礙的最佳指標。本實驗選取大鼠作為實驗動物,具有價格低廉,喂養(yǎng)方便,與人體解剖結(jié)構(gòu)相似,更易建立骨代謝與吸收平衡等一系列優(yōu)點,采用切除大鼠雙側(cè)卵巢這一經(jīng)典造模方法,模擬人絕經(jīng)后雌激素下降狀態(tài),采用HE 染色觀察造模成功與否以及其骨組織病理學(xué)改變,通過TRACP5b、ALP水平檢測骨代謝情況,進一步探討中藥抗疏強骨顆粒治療作用與TRACP5b、ALP的相關(guān)性,為骨質(zhì)疏松的中醫(yī)藥防治提供一定的實驗基礎(chǔ)。

    本研究結(jié)果表明,絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠血清TRACP5b、ALP 上升,其原因可能與骨質(zhì)疏松的病因有關(guān),抗疏強骨顆粒能降低去卵巢模型大鼠血清TRACP5b、ALP 含量,其中中劑量效果最顯著。由此得知抗疏強骨顆粒通過降低去卵巢模型大鼠血清ALP、TRACP5b 水平,降低破骨細胞活性,抑制骨吸收,從而治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。

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