巴戟天-續(xù)斷-益母草組藥干預(yù)腎虛血瘀型多囊卵巢綜合征網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作用機(jī)制?

袁仁智，肖衛(wèi)瓊，唐 鵬，康開彪，潘 文

1 甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2 甘肅省中醫(yī)藥研究院；3 邵陽學(xué)院

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是影響女性最常見的內(nèi)分泌紊亂疾病，在育齡女性中發(fā)病率約5%～20%，且呈不斷上升趨勢［1］。PCOS 主要包括月經(jīng)周期紊亂、高雄激素血癥和肥胖等臨床癥候群［1］。PCOS的發(fā)病機(jī)制及其相關(guān)癥狀雖有待解釋，但癥狀和體征的異質(zhì)性提示其發(fā)病因素多樣［2］。有學(xué)者認(rèn)為，PCOS 的發(fā)生不僅受遺傳影響，也與下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)控功能紊亂、高胰島素血癥、肥胖、精神、心理、環(huán)境等因素密切相關(guān)［3］。西醫(yī)主要通過抗雄激素、胰島素增敏劑及促排卵藥物干預(yù)，雖有一定療效，但常伴有腫脹、胃痛、盆腔或下腹部痛等不良反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)引發(fā)卵巢過度刺激綜合征，出現(xiàn)頭暈、惡心、嘔吐、精神抑郁甚至導(dǎo)致卵巢早衰。中醫(yī)藥辨證論治的個(gè)性化方案在治療PCOS 方面有獨(dú)到之處。通過整理古今中醫(yī)名家治療PCOS 疾病或癥狀的方劑，運(yùn)用中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)治療PCOS 證候中以腎虛血瘀型和肝郁腎虛型最多，腎、脾、肝臟功能失調(diào)是PCOS 主要病機(jī)，補(bǔ)虛和解郁是治療PCOS 的根本方法，而補(bǔ)腎健脾、疏肝解郁、理氣化痰、活血化瘀是治療PCOS的主要思路［4］。

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）作為目前國內(nèi)較為完善的草藥成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫，共收錄了505 味草藥的12 144 個(gè)活性成分、關(guān)鍵藥物動力學(xué)性質(zhì)、類藥性、作用靶點(diǎn)、參與的通路及相關(guān)疾病，為中草藥檢索、新藥開發(fā)和中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論的現(xiàn)代闡釋提供了新手段和新方法。

本研究提取腎虛血瘀型方劑核心組藥，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析藥物的化學(xué)成分、靶點(diǎn)和通路之間的關(guān)系，試圖揭示中藥治療PCOS 的作用機(jī)制。

1 資料收集與分析方法選擇

借助中國中醫(yī)科學(xué)院研制的中醫(yī)傳承輔助平臺（2.5版本）建立PCOS方劑數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘［4］，數(shù)據(jù)庫收集了130 位現(xiàn)代醫(yī)家的352 個(gè)方劑，對其中的腎虛血瘀型方劑運(yùn)用熵聚類法進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

2 方法與結(jié)果

2.1 巴戟天-續(xù)斷-益母草組藥挖掘及其活性成分篩選和靶點(diǎn)預(yù)測進(jìn)入自建的中醫(yī)傳承輔助平臺PCOS 數(shù)據(jù)庫，通過數(shù)據(jù)分析組方規(guī)律，獲得腎虛血瘀型方劑25個(gè)，涉及藥物96味。運(yùn)用關(guān)聯(lián)規(guī)則和熵聚類法發(fā)現(xiàn)，當(dāng)支持度為6，置信度為0.6時(shí)，巴戟天-續(xù)斷-益母草配伍概率較高。因此，選取巴戟天-續(xù)斷-益母草為腎虛血瘀型PCOS 的核心組藥進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。

進(jìn)入TCMSP 平臺（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），選擇Herb name，依次輸入“Bajitian”“Xuduan”“Yimucao”，分別獲得174 個(gè)、31 個(gè)和51 個(gè)化學(xué)成分，然后根據(jù)口服生物利用度（OB）和藥物相似度（DL）進(jìn)行篩選，設(shè)為OB≥30%，DL≥0.05，去重后得到巴戟天-續(xù)斷-益母草活性化合物34個(gè)（巴戟天18個(gè)，續(xù)斷6個(gè)，益母草8個(gè)，巴戟天和續(xù)斷共有2 個(gè)）。同時(shí)在TCMSP 中獲得34 個(gè)化合物的620 個(gè)潛在靶點(diǎn)（其中有6 個(gè)化合物無靶點(diǎn)），篩去重復(fù)項(xiàng)，整理得到140個(gè)靶點(diǎn)，見表1。

表1 巴戟天-續(xù)斷-益母草組藥活性化合物特征

2.2 藥物與疾病共靶點(diǎn)及化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)NCBI是一個(gè)關(guān)于分子生物學(xué)、生物化學(xué)和遺傳學(xué)知識的存儲和分析的數(shù)據(jù)庫。進(jìn)入NCBI 基因數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），以“polycystic ovarian syndrome”為關(guān)鍵詞檢索，選擇種屬“人類”，得到228個(gè)PCOS疾病基因靶點(diǎn)。

將巴戟天-續(xù)斷-益母草組藥與PCOS 疾病靶點(diǎn)分別錄入Excel 建立文檔，通過比對找到兩者的共有靶點(diǎn)19 個(gè)，涉及化合物25 個(gè)，這些可能是PCOS 的主要作用靶點(diǎn)。將共靶點(diǎn)及其對應(yīng)化合物數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0 構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)（CT）網(wǎng)絡(luò)，44 個(gè)節(jié)點(diǎn)代表化合物和靶點(diǎn)，86 條連線代表化合物和靶點(diǎn)的關(guān)系，每個(gè)靶點(diǎn)涉及的化合物均值為4.52，每個(gè)化合物涉及的靶點(diǎn)均值為3.44，涉及4 個(gè)及以上靶點(diǎn)的化合物有8 個(gè)，最多的有17個(gè)靶點(diǎn)。涉及5個(gè)及以上化合物的靶點(diǎn)有5 個(gè)，最多的涉及20 個(gè)化合物。這8 個(gè)化合物和5個(gè)靶點(diǎn)可能與PCOS關(guān)系最為密切，見表2、圖1。

表2 巴戟天-續(xù)斷-益母草組藥與PCOS疾病共靶點(diǎn)

圖1 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圓形代表化合物，三角形代表靶點(diǎn)）

2.3 共靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)藥物作用既可以表現(xiàn)為直接與靶點(diǎn)結(jié)合和單一的信號通路，也可以是直接靶點(diǎn)和間接靶點(diǎn)共同調(diào)控等多靶點(diǎn)、多通路、多層次的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)模式。因此通過蛋白之間的相互作用關(guān)系即PPI 網(wǎng)絡(luò)可以進(jìn)一步深入分析藥物對PCOS的重要影響。進(jìn)入String數(shù)據(jù)庫，點(diǎn)擊Multiple Proteins，輸入19 個(gè)共靶點(diǎn)，種屬“人類”，設(shè)置評分為0.4，網(wǎng)絡(luò)邊緣含義為“分子作用”，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點(diǎn)數(shù)為19，邊數(shù)為99，平均節(jié)點(diǎn)度為10.4，局部聚類系數(shù)為0.852。PPI 富集P值＜1.0e-16，這意味著蛋白質(zhì)之間的相互作用較基因組中隨機(jī)的一組相似大小的蛋白質(zhì)所預(yù)期的更多，即蛋白質(zhì)之間的活躍度較高，見圖2。

圖2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.4 靶點(diǎn)通路通過DAVID 數(shù)據(jù)庫得到19 個(gè)共靶點(diǎn)的基因功能GO 富集1 048 條，KEGG 信號通路富集21條。其中細(xì)胞組成25個(gè)，主要包括細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域、分泌顆粒、細(xì)胞質(zhì)囊泡、細(xì)胞內(nèi)囊泡等；生物功能28 個(gè)，主要包括受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、類固醇激素受體活性、生長因子受體結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、生長因子活性、氧化還原酶活性、受體調(diào)節(jié)劑活性、調(diào)節(jié)區(qū)DNA 結(jié)合、調(diào)節(jié)區(qū)核酸結(jié)合等；生物過程995 個(gè)，主要涉及對有機(jī)物的反應(yīng)、細(xì)胞增殖、對脂質(zhì)的反應(yīng)、對含氧化合物的反應(yīng)、對外部刺激的反應(yīng)、生物合成過程的正調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、程序性細(xì)胞死亡、大分子生物合成、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)節(jié)、對類固醇激素刺激的細(xì)胞反應(yīng)、血管發(fā)育、單一生物代謝過程、趨化因子生物合成、細(xì)胞活化、血液循環(huán)、免疫效應(yīng)過程和炎癥反應(yīng)等；信號途徑主要有HIF-1信號通路、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、1 型糖尿病、炎癥性腸病、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、NOD 樣受體信號通路、PI3K-Akt 信號通路、癌癥的途徑、雌激素信號通路、胰島素抵抗、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、Jak-STAT 信號通路、非酒精性脂肪性肝病、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、同種異體移植排斥反應(yīng)、膀胱癌等；設(shè)置參數(shù)為FDR＜0.05，P＜0.05，獲得GO 條目189 個(gè)，KEGG條目1條即HIF-1信號通路。21條信號通路富集結(jié)果采用OMICSHARE（http：//www.omicshare.com）在線工具作出泡泡圖。同時(shí)借助Cytoscape 3.7.0構(gòu)建靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，見表3—4、圖3—5。

表3 預(yù)測靶點(diǎn)基因功能富集

表4 潛在靶點(diǎn)信號通路富集

圖3 潛在靶點(diǎn)生物功能富集圖

圖4 預(yù)測靶點(diǎn)信號通路富集圖

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門從生物網(wǎng)絡(luò)角度研究疾病發(fā)生和發(fā)展過程，認(rèn)識藥物與機(jī)體的相互作用并指導(dǎo)新藥發(fā)現(xiàn)的學(xué)科，在研究工具上，該學(xué)科借助高通量組學(xué)數(shù)據(jù)、分子網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)以及計(jì)算機(jī)模擬分析，研究藥物的作用機(jī)制和促進(jìn)藥物創(chuàng)新［5］。而中醫(yī)的整體觀念、辨證論治理論與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的系統(tǒng)動態(tài)觀高度一致，因此，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究中醫(yī)復(fù)方的作用機(jī)制成為目前藥理學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)［6］。本研究通過數(shù)據(jù)挖掘找出了治療腎虛血瘀型PCOS 的一組核心組藥巴戟天-續(xù)斷-益母草（B-X-Y），這3 味藥是中醫(yī)臨床專家廣泛使用的補(bǔ)腎活血藥物。研究借助系統(tǒng)藥理學(xué)、藥代動力學(xué)和生物信息學(xué)方法確定組藥的活性化合物及與PCOS相關(guān)的靶點(diǎn)和通路。

圖5 靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

通過TCMSP 平臺的OB 和DL 篩選，獲得巴戟天-續(xù)斷-益母草的34 個(gè)化合物和140 個(gè)靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其中靶點(diǎn)最多的是槲皮素（87 個(gè)靶點(diǎn)）和山奈酚（55 個(gè)靶點(diǎn)），其次是β-谷甾醇、異鼠李素、花生四烯酸和蒽醌。可見，槲皮素和山奈酚是治療PCOS 的主要化合物，這與LIU 等［7］研究二仙湯治療PCOS 的結(jié)果一致，也與本項(xiàng)目前期研究菟絲子治療腎虛血瘀型PCOS 的結(jié)果相吻合，不同之處在于LIU等［7］研究主要來自二仙湯當(dāng)中的淫羊藿、知母和黃柏，本研究中槲皮素、山奈酚和異鼠李素（36 個(gè)靶點(diǎn)）、花生四烯酸（31 個(gè)靶點(diǎn)）均來源于益母草。槲皮素是一種植物多酚，除了在血小板聚集、脂質(zhì)過氧化、毛細(xì)血管通透性、細(xì)胞攝取和自由基中的積極作用外，還具有抗炎、抗癌及抗病毒活性［8］。WANG 等［9］研究結(jié)果表明，槲皮素可抑制Toll樣受體/NF-κB信號通路，改善PCOS大鼠模型中卵巢組織的炎癥微環(huán)境。REZVAN 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在隨機(jī)安慰劑對照的雙盲試驗(yàn)中，口服槲皮素補(bǔ)充劑可增強(qiáng)AMPK 水平，改善PCOS 的代謝特征。山奈酚是一種膳食類黃酮，具有抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞凋亡、抗癌、雌激素和抗雌激素活性［11］。其通過減弱炎癥和細(xì)胞凋亡來調(diào)節(jié)MAPK 通路以防止IR 損傷［12］。異鼠李素屬于黃酮類，分子式為C16H12O7，其作用廣泛，有擴(kuò)張冠脈、保護(hù)血管內(nèi)皮及抗血栓、抗腫瘤細(xì)胞［13］、抗病毒［14］及減輕氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡［15］和抗炎［16］等作用。花生四烯酸是一種ω-6 多不飽和脂肪酸，為花生油中飽和的花生酸的相對物，具有酯化膽固醇、增加血管彈性、降低血液黏度，調(diào)節(jié)血細(xì)胞功能等一系列生理活性，對預(yù)防心血管疾病、糖尿病和腫瘤等具有重要作用。相關(guān)文獻(xiàn)［17-18］報(bào)道糖異生的增加是2 型糖尿病基礎(chǔ)狀態(tài)下高血糖的一個(gè)重要因素，而吳勉云等［19］實(shí)驗(yàn)表明，花生四烯酸能顯著降低糖異生兩個(gè)關(guān)鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶的轉(zhuǎn)錄水平以及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的酶活性。來源于巴戟天的兩種蒽醌：2-羥基-1，5-二甲氧基-6-（甲氧基甲基）-9，10-蒽醌和1，6-二羥基-5-甲氧基-2-（甲氧基甲基）-9，10-蒽醌，分別有31個(gè)靶點(diǎn)和29個(gè)靶點(diǎn)，兩者的口服生物利用度較高，分別為95 和104。蒽醌類化合物是各種天然醌類化合物中數(shù)量最多的一類化合物，具有抗菌消炎［20］、抗病毒［21-23］、抗腫瘤［24-25］、利尿、活血［26］、降血脂［27］和增強(qiáng)免疫功能［28］等作用。β-谷甾醇的51 個(gè)靶點(diǎn)來源于巴戟天和續(xù)斷。β-谷甾醇是植物甾醇類成分之一，屬于四環(huán)三帖類化合物，有降膽固醇、止咳、祛痰及抑制腫瘤和修復(fù)組織作用。用于Ⅱ型高脂血癥、動脈粥樣硬化癥和慢性氣管炎，亦用于早期子宮頸癌及皮膚潰瘍等［29］。由于巴戟天-續(xù)斷-益母草組藥中已知的化合物成分多達(dá)256 種，它們中可能有多種成分通過多種機(jī)制作用于多個(gè)靶標(biāo)。

藥靶網(wǎng)絡(luò)和PCOS網(wǎng)絡(luò)有19個(gè)重疊基因，富集于21 條通路。其中有5 個(gè)靶點(diǎn)富集的通路有HIF-1 信號通路、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、1 型糖尿病、炎癥性腸病、TNF 信號通路，涉及基因12 個(gè)，根據(jù)其所涉通路依次排序?yàn)椋篒L-6（15 條）、IL1β（11 條）、IFNG（11 條）、INS（6 條）、CCL2（6 條）、IL-2（5 條）、VEGFA（5 條）、NOS3（4 條）、PPARG（3 條）、MMP2（3條）、AR（1 條）、HMOX1（1 條），結(jié)合蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系（表2 和圖3），得分前10 位的基因是IL-6、INS、VEGFA、NOS3、PPARG、MMP2、CCL2、IL1β、IL2和ESR2，因此IL-6、IL-1B、IFNG、INS、CCL2、IL2、VEGFA 等，可能是PCOS治療中涉及的關(guān)鍵基因。如TNF主要由巨噬細(xì)胞分泌，并可誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞死亡。CHEN 等［15］發(fā)現(xiàn)PCOS 患者血清TNF-α和AMH高表達(dá)，血清TNF-α和AMH水平與PCOS高度相關(guān)，可以作為預(yù)測PCOS 風(fēng)險(xiǎn)的診斷指標(biāo)。FASSHAUER 等［30］發(fā)現(xiàn)TNF-α和胰島素能上調(diào)脂肪細(xì)胞上IL-6表達(dá)，胡靜等［31］研究發(fā)現(xiàn)IL-6主要與IR 有關(guān)，TNF-α 和IL-6 協(xié)同作用能加重PCOS病情的發(fā)生發(fā)展。TNF 信號通路和胰島素抵抗與PCOS發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)已成為共知。最近的研究發(fā)現(xiàn)，NOD 樣受體信號通路也對PCOS 產(chǎn)生影響。賀晶等［32］探討促性腺釋放激素激動劑輔助腹腔鏡下卵巢巧克力囊腫剝離術(shù)對TNF-α和IL-6 水平的影響研究表明，該術(shù)不僅能提高妊娠率，還能降低NOD1、NOD2 的表達(dá)，下調(diào)血清NF-α和IL-6 水平，抑制患者體內(nèi)炎癥狀態(tài)。

總之，巴戟天-續(xù)斷-益母草組藥治療PCOS 是分子間協(xié)同作用的結(jié)果，通過干預(yù)分子網(wǎng)絡(luò)、生物過程和通路來恢復(fù)機(jī)體平衡，具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，其對PCOS 的治療主要是通過補(bǔ)腎活血化瘀達(dá)到抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂、促進(jìn)微循環(huán)及改善胰島素抵抗的目的，與現(xiàn)代醫(yī)藥治療多囊卵巢綜合征的作用機(jī)制相符合。