2019年廣東省梅州市首起人間布魯氏菌病暴發(fā)疫情的調查

孫長云，黃天鵬，韋入豐，張 薇，鄧愛萍，彭曉放，曾靈風，張少忠，黃元祥，武 婕

布魯氏菌病(簡稱布病)是由布魯氏桿菌感染而引起的一種具有傳染性的人獸共患病。該病可通過直接接觸受感染動物或間接食用受污染的肉和乳制品等而發(fā)生。布病患者的主要臨床表現(xiàn)為低燒、夜間盜汗、關節(jié)及肌肉階段性疼痛等癥狀[1]。隨著廣東省經(jīng)濟的快速發(fā)展，人們的生活水平發(fā)生了實質性的改變，對于肉類和奶制品等產(chǎn)品的需求量不斷增加。外地輸入的部分病畜未能及時進行檢疫，混入市場，從而導致布病的暴發(fā)事件增加[2]。歷史上廣東省一直以豬種布魯氏菌病為主，自2006年以后轉變?yōu)楦吒腥拘缘难蚍N為主要種型，呈現(xiàn)出各地區(qū)布病病例逐漸遞增的發(fā)展趨勢[3]。布病不僅給地方畜牧業(yè)的發(fā)展造成嚴重影響，更重要的是給人們的生命健康帶來了嚴重的威脅[4]。

本研究收集2019年廣東省梅州市五華縣發(fā)生布病疫情的數(shù)據(jù)，并采集具有相關癥狀人群的血液進行血清學和分子生物學方法鑒定，同時對可疑病羊的羊奶進行分子生物學檢測。對血清學顯示陽性的病人血樣進行布魯氏菌實驗室分離與種型鑒定。為進一步了解本次分離菌株與其他標準菌株各生物種型之間的關系，選取14株分離布魯氏菌株進行了多位點序列分型(MLST)研究，從根源上了解此次布病疫情的暴發(fā)的原因，同時也為更好掌握廣東省布病疫情動態(tài)和分析流行特征提供有力數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1資料來源 采集的血液樣本及羊奶樣本均來源于廣東省梅州市五華縣。布魯氏菌病病例的數(shù)據(jù)資料來源于廣東省急性傳染病監(jiān)測系統(tǒng)，主要包括病例的臨床癥狀和人群基本特征等。

1.2血清抗體檢測 無菌環(huán)境下，采集靜脈血2～3 mL，離心后獲得血清，經(jīng)虎紅平板凝集試驗(RBPT)進行初篩。初篩陽性者再通過試管凝集試驗(SAT)進行復核確認。上述試驗結果均依據(jù)布魯氏菌病診斷標準，以RBPT陽性且SAT滴度≥1∶100判定為血清抗體陽性。

1.3分子生物學檢測

1.3.1引物設計及合成 根據(jù)張輝等[5]報道的針對布魯氏桿菌外膜蛋白基因Omp22序列設計的特異性引物和參考細菌16S rRNA基因引物，委托上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列如表1。

1.3.2基因擴增及測序 按照血液基因組DNA抽提試劑盒(TIANGEN，DP304)所述方法提取血液和羊奶的基因組DNA，并保存于-20 ℃以備后續(xù)試驗使用。應用表1合成的引物，以提取的血液和羊奶DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系均為50 μL：DNA模板4 μL，上游引物 2 μL，下游引物 2 μL，Premix Taq 25 μL，ddH2O 17 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃(Omp22基因)和56 ℃(16S rRNA基因)退火1 min，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物送廣州昊天生物科技有限公司進行測序。

表1 布魯氏菌Omp22和16S rRNA基因引物序列

1.4布魯氏菌Omp22基因和16S rRNA基因序列遺傳進化樹分析 測序結果結合GenBank中布魯氏菌的Omp22和16S rRNA參考序列進行序列比對，通過生物學軟件Mega 6.0應用鄰位相連法(Neighbor-joining method)構建系統(tǒng)進化樹[6]。

1.5病原菌的分離與常規(guī)方法鑒定 無菌條件下，共計采集血液樣品18份，無菌操作接種至血培養(yǎng)瓶。帶回生物安全三級實驗室后轉接至培養(yǎng)箱中進行可疑菌的分離與培養(yǎng)。對分離的可疑菌分別進行單因子血清凝集試驗、染料抑菌試驗和噬菌體裂解試驗。具體操作步驟參考國家布魯氏菌鑒定的標準方法進行[7]。

1.6AMOS-PCR分型鑒定 AMOS-PCR根據(jù)姜海等[8]報道，選取AMOS-PCR引物序列并委托上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列如表2。AMOS-PCR擴增擴增體系: 2×Premix Taq 10 μL; 引物 IS711(10 pmol/μL)1 μL; 引物 A、M、O、S(10 pmol/μL)各0.4 μL; 模板DNA 2 μL，ddH2O 5.4 μL。AMOS-PCR擴增條件: 95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min;最終延伸 72 ℃ 5 min, 35個循環(huán)。待擴增完畢，PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測并觀察結果。

表2 AMOS-PCR引物序列

1.7MLST分型 將14株布魯氏菌全基因測序文件在數(shù)據(jù)庫(https://pubmlst.org/)中查找到21個基因片段，包括布魯氏菌19個管家基因(acnA、aroA、cobQ、csdB、ddlA、dnaK、gap、gyrB、leuA、mviM、prpE、soxA、trpE、caiA、fbaA、fumC、glk、mutL、putA)、1個外膜蛋白基因(omp25)和1個基因間區(qū)Int-hyp共21個基因片段作為MLST的靶標基因。使用 Bio Numerics(Version 6)將14株分離菌株與11株標準株和10株文獻參考株用平均連鎖聚類法(UPGMA)進行聚類分析，探討各菌株間的進化關系。

2 結 果

2.1發(fā)病情況 本次疫情病例均居住在梅州市五華縣華陽鎮(zhèn)，主要分布在4個自然村，包括坪南、太坪、葉新和華南地區(qū)，其中坪南村和太坪村病例人數(shù)最多，占總病例的90%(27/30)。坪南村罹患率最高達32.67/萬，如表3所示。

表3 梅州市五華縣暴發(fā)布病疫情各地區(qū)的病例分布

2.2臨床特征 本次疫情病例的臨床表現(xiàn)主要是發(fā)熱、乏力、多汗和肌肉關節(jié)酸痛等癥狀，其中70%都有發(fā)熱的癥狀。具體如表4所示。

表4 梅州市五華縣布病暴發(fā)疫情病例臨床表現(xiàn)

2.3血清抗體檢測 本次共采集了277個村民的血樣，經(jīng)RBPT初篩后有30份血清顯示陽性反應。隨后對這30份血清進行SAT試驗，結果顯示30份血清SAT滴度均≥1∶100，可以初步確定有30例布魯氏菌病陽性患者。

2.4布魯氏菌的16S rRNA基因序列遺傳進化樹結果 根據(jù)布魯氏菌的16S rRNA基因構建的系統(tǒng)發(fā)育樹可見，從血液和羊奶中分離到的布魯氏菌16S rRNA基因序列可聚類在同一進化分支上，并能夠很好的聚類。同時，來自血液和羊奶中檢測到布魯氏菌的16S rRNA基因序列與布魯氏菌的標準參考菌株序列聚類在同一末端分支，而與其它菌株的16S rRNA基因序列相距較遠(圖1)。

圖1 基于布魯氏菌16S rRNA基因構建的系統(tǒng)進化樹

2.5布魯氏菌的Omp22基因序列遺傳進化樹結果 根據(jù)布魯氏菌的Omp22基因構建的進化樹可見，在血液和羊奶中檢測到的Omp22基因序列聚類在同一末端進化分支上，與來自新疆地區(qū)的參考序列聚類在同一分支上，但與西班牙、德國和印度的分離株相距較遠(圖2)。

圖2 基于布魯氏菌Omp22基因構建的系統(tǒng)進化樹

2.6細菌培養(yǎng)結果 在采集的18份血樣中分離到14份有可疑菌落，菌落特征為無色半透明、濕潤、邊緣光滑、無色透明、呈針尖狀。經(jīng)革蘭染色菌體呈紅色短桿菌，柯氏染色菌體也呈紅色短桿菌狀。上述結果均符合布魯氏菌的菌落形態(tài)和細菌形態(tài)特征。

2.7AMOS-PCR鑒定結果 AMOS-PCR擴增結果顯示，14株分離菌株均可在731 bp大小處出現(xiàn)目的片段，與陽性對照組中的羊種布魯氏菌處在相同位置，可判定14株分離菌株均為羊種布魯氏菌(圖3)。

M：DNA分子量標準；1-14：分離菌株；N：陰性對照；15：羊種菌；16：牛種菌；17：豬種菌

2.8種型鑒定結果 對分離的布魯氏菌進行CO2需求、H2S產(chǎn)生、血清凝集反應、噬菌體裂解和染料抑菌試驗，結果顯示14份布魯氏菌均為羊種3型菌株，表現(xiàn)為：CO2(-)、H2S(-)、單項特異性血清凝集A(+)M(+)R(-)、染料抑菌硫堇和堿性復紅(+)、噬菌體裂解BK2(+)Tb(-)104Tb(-)。見表5。

表5 布魯氏菌的種型鑒定結果

2.9MLST分型結果 經(jīng)MLST聚類分析發(fā)現(xiàn)，本次疫情分離到的14株布魯氏菌可聚類在同一個進化分支上，并與羊種布魯氏菌聚類在同一個進化分支末端。其次，14株分離株與各標準生物型的布魯氏菌的相似值介于82.0%～100.0%(圖4)。

圖4 廣東省梅州市14株羊種布魯氏菌MLST聚類分析

3 討 論

布病因其對人類的危害大，且近幾年呈現(xiàn)出疫情擴大的趨勢，越來越受到重視。盡早的診斷布病是該病的防控關鍵，布魯氏菌作為該病的病原體，由于初次分離培養(yǎng)時生長較為緩慢，應用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)鑒定不利于早期的診斷，但分子生物學檢測技術具有明顯的優(yōu)勢[9]。目前文獻中報道PCR檢測布魯氏菌的方法很多，在布魯氏菌屬水平的檢測一般選用單對引物PCR，其中主要是以外膜蛋白Omp22、Bcsp31和IS711等的編碼基因設計引物[5,10]。而在種及生物型水平的鑒定則選用多對引物的多重PCR方法，比如AMOS-PCR和多位點序列分型(MLST)等[8,11]。本研究在病例的血液和羊奶樣本中均檢測到了布魯氏菌Omp22基因和16S rRNA基因，表明羊奶和病例的血液中均存在布魯氏菌。經(jīng)測序Omp22基因序列比對后結果發(fā)現(xiàn)，羊奶中的病原與血液中的布魯氏菌序列相同，提示本次布魯氏菌病疫情由生飲鮮羊奶所致。經(jīng)布魯氏菌16S rRNA基因構建的系統(tǒng)進化樹分析，分離株與標準參考菌株聚集在同一末端分支，進化程度趨同，遺傳距離相似，無法辨別菌株間遺傳關系，實驗結果表明16S rRNA不宜做布魯氏菌遺傳進化分析的靶基因，但可在屬水平準確的鑒定布魯氏菌，這與已有研究結果相似[12]?；谏鲜鰡栴}，對Omp22基因構建的進化樹顯示，本次檢測的羊奶和人血液中擴增的布魯氏菌Omp22基因在同一個進化分支上，而且同新疆地區(qū)的分離菌株相距較近，但與西班牙、德國和印度的分離株相距較遠，提示此次布病疫情可能非進口羊所致，而可能與國內擴散性較高的羊型布魯氏菌有關。

近年來，廣東省人間布病疫情呈逐年上升趨勢，每年都有患者中分離到布魯氏菌菌株的案例[13]。此前，梅州市五華縣從未有布病的流行報道，而隨著該地區(qū)的經(jīng)濟發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，奶食品也成為了人們生活中重要的營養(yǎng)品之一。羊奶營養(yǎng)豐富，其中干物質和能量含量比牛奶稍高，非常適宜中老年人和嬰幼兒飲用[14]。當?shù)氐牟糠执彘_發(fā)了小型家庭式山羊養(yǎng)殖場，為附近的村民提供了羊奶的供應需求。當?shù)匮蛑坏慕灰字饕峭ㄟ^流動式貨車不定點銷售，交易也較為隱蔽，由于經(jīng)濟利益的驅使，從疫區(qū)購入的未檢疫的羊也混入其中，從而導致當?shù)夭疾∫咔榈陌l(fā)生。再加之銷售方及居民對布病的認知不足，從擠奶到包裝都未進行有效的消毒處理，而且當?shù)卮蠖鄶?shù)居民有進食生鮮羊奶的習俗，這也導致了本次布病疫情的暴發(fā)流行。在本疫情中發(fā)現(xiàn)，生飲染疫羊生鮮羊奶的114人中，共有30人經(jīng)確診為布病陽性病例，而飲用煮沸的染疫羊生鮮羊奶的112人均未發(fā)現(xiàn)布病陽性病例。這進一步明確了此次疫情暴發(fā)流行的根源，為我們疫情的追蹤和控制提供了有力數(shù)據(jù)。

本次疫情有30人的血清虎紅平板試驗顯示陽性，期間成功采集到18人的全血進行布魯氏菌分離試驗，剩余12人赴醫(yī)院就診，未能成功采集到全血樣本。隨著感染者全血中布魯氏菌的成功分離，通過AMOS-PCR的結果初步分析發(fā)現(xiàn)，本次的分離菌株均屬于羊種布魯氏菌。種型鑒定確定分離的布魯氏菌均屬于羊種3型布魯氏菌。這與陳經(jīng)雕等報道的廣東省的布魯氏菌株已經(jīng)由豬種3型流行菌株轉變?yōu)檠蚍N3型流行株一致[15]。本研究采用MLST進行分析，發(fā)現(xiàn)本次疫情分離到的14株布魯氏菌聚類在同一個進化分支上，并且與布魯氏菌各標準株之間相似度為82.0%～100.0%。從MLST進化分支中發(fā)現(xiàn)，所有菌株在100.0%相似值水平上可分為13種ST型別，其中2株布魯氏菌分離株(菌株編號為LB-127和LB-132)與來自內蒙古地區(qū)的ASM42086V1菌株ST型處于同一分支上，其余12株布魯氏菌分離株與羊種參考菌株和標準菌株聚類在同一ST型進化分支上。以上有關MLST分析結果提示，本次疫情分離到的14株布魯氏菌分離株，與羊種2型和羊種3型布魯氏菌的親緣關系最為相近，且與內蒙古地區(qū)參考菌株存在100%同源關系，可能是本次布病疫情的溯源地。本研究在生物分型的基礎上結合MLST分型技術可以更好地對布魯氏菌進行流行病學溯源調查和進一步明確菌株之間的遺傳關系[16]。家庭式山羊養(yǎng)殖場的不斷擴大，可能是造成廣東省布病疫情呈逐年上升的主要原因。加強畜間布病疫情的監(jiān)測、增強對進出省羊只的布病專項免疫、提高群眾對布病的認知和防范意識是防控布病疫情的有效措施。

利益沖突：無