2019年云南省玉溪市輸入性登革熱病例實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果分析

田 杰，范芝宏, 楊 娟, 蔣雪瑩, 楊明東, 郭曉芳

登革熱(Dengue fever，DF)是由登革病毒(dengue virus, DENV)引起的急性蚊媒傳染病，主要通過(guò)埃及伊蚊或白紋伊蚊叮咬傳播。DENV有4個(gè)血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4)[1]。2019年，WHO將登革熱列為“2019年全球十大健康威脅”之一[2]。目前全球有128個(gè)國(guó)家，約39億人口處于疾病風(fēng)險(xiǎn)之中，年感染DENV人數(shù)3.9億[3-4]。2015-2018年我國(guó)廣東、云南、浙江、福建、海南、湖南和山東省累計(jì)報(bào)告登革熱暴發(fā)111起，共涉及12 490例病例[5]。云南省位于我國(guó)西南部，邊境線4 060 km，與常年有登革熱流行的緬甸、老撾、越南接壤。僅2009-2014年，從東南亞輸入云南的登革熱病例為384例[6]。自2013年云南省首次暴發(fā)登革熱以來(lái)，瑞麗市每年均有登革熱的暴發(fā)流行[7]。而景洪市于2013年、2015年和2017年先后發(fā)生了DENV-3、DENV-2和DENV-1的暴發(fā)流行[7-9]。2013-2018年，玉溪市除了2016年，每年僅有1～3例輸入病例報(bào)告，分別來(lái)自云南西雙版納州及泰國(guó)、老撾、緬甸和馬來(lái)西亞。為弄清2019年玉溪市輸入的登革病毒血清型及病毒來(lái)源，本研究對(duì)登革熱病例樣本進(jìn)行病原檢測(cè)和分析，為當(dāng)?shù)氐歉餆岱揽靥峁┎≡瓕W(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 2019年輸入玉溪市的登革熱疑似病例和臨床診斷病例的診斷依據(jù)為《登革熱診斷》WS 216-2018[10]。采用廣州萬(wàn)孚生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的膠體金法登革病毒NS1抗原檢測(cè)試劑作為病例臨床診斷試劑。血清樣本采集后冷藏運(yùn)輸至本實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱保存待檢。病例個(gè)案信息來(lái)自國(guó)家傳染病報(bào)告信息管理系統(tǒng)。

1.2方 法

1.2.1DENV RNA提取和血清型分型 吸取200 μL血清樣本，用西安天隆公司生產(chǎn)的病毒DNA/RNA提取試劑盒(磁珠法)提取病毒RNA。參考《登革熱診斷》WS 216-2018合成DENV1-4型特異引物和探針，用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR進(jìn)行DENV血清型分型。PCR試劑為ABI AgPath-IDTMOne-step RT-PCR Kit(AM1005)。PCR反應(yīng)條件設(shè)置為：50 ℃ 30 min，95 ℃ 10 min；95 ℃15 s，60 ℃ 45 s，運(yùn)行40個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)的收集設(shè)置在每次循環(huán)的退火延伸時(shí)進(jìn)行。結(jié)果判斷以Ct值<35(熒光信號(hào)數(shù)據(jù)線性化處理后對(duì)應(yīng)循環(huán)數(shù)生成的曲線圖呈“S”形的標(biāo)本)可判斷為相應(yīng)的登革病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性。

1.2.3相似性和進(jìn)化分析 用Megalign分析所得E基因序列的核苷酸相似性和氨基酸同源性。進(jìn)化分析的參考序列下載自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)，包括在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST模塊對(duì)獲得的E基因序列進(jìn)行比對(duì)后選取的相似性最高的基因序列、各血清型登革病毒的基因型代表序列和近年?yáng)|南亞國(guó)家的登革病毒序列。以及本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)獲得的2019年景洪市1-3型登革病毒E基因序列。用MEGA 7(http://www.megasoftware.net)中的ML法進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，模型選用 Kimura2-parameter model。Bootstrap 值設(shè)定為1 000。

2 結(jié) 果

2.12019年輸入性登革熱病例 2019年玉溪市累計(jì)報(bào)告輸入性登革熱病例23例。4月至10月，除7月外，每月均有輸入病例報(bào)告。在4月份監(jiān)測(cè)到首例從越南芽莊輸入的登革病例，在5月、6月和10月共監(jiān)測(cè)到從柬埔寨輸入病例3例，8月監(jiān)測(cè)到從緬甸輸入病例1例，9月3日至10月24日，從云南省西雙版納州輸入18例。輸入病例主要分布在江川區(qū)(9例)和紅塔區(qū)(8例)。23例輸入病例年齡在21～56歲，年齡中位數(shù)為30歲。男性12例，女性11例。人群分類為農(nóng)民11例、家務(wù)及待業(yè)5例、工人1例、民工1例、不詳5例。

2.2DENV血清型分型和基因分型結(jié)果 從20份血清樣本(包括17份從西雙版納州景洪市輸入樣本，2份為從柬埔寨輸入樣本，1份為緬甸輸入樣本)中共檢測(cè)到18份DENV陽(yáng)性，其中在17份景洪輸入樣本中檢測(cè)到11份DENV-1、5份DENV-2和1份DENV-3；在2份柬埔寨輸入樣本中檢出1份DENV-1陽(yáng)性；1份緬甸輸入樣本為DENV陰性。20份樣本采血時(shí)間為發(fā)病后3～10 d。1例DENV陰性的柬埔寨輸入樣本為NS1抗原檢測(cè)陽(yáng)性，為發(fā)病后第5 d采集。1例DENV陰性的緬甸輸入樣本為NS1抗原檢測(cè)陰性，為發(fā)病后第6 d采集。

2.3DENV E基因相似性與進(jìn)化分析 對(duì)18份DENV血清型陽(yáng)性樣本進(jìn)行RT-PCR和測(cè)序，僅從17例景洪市輸入的DENV陽(yáng)性樣本中得到6條DENV-1 E基因序列(1 485 bp)、3條DENV-2 E基因序列(1 485 bp)、1條DENV-3 E基因序列(1 479 bp)。

6條DENV-1 E基因序列的核苷酸相似性為99.4%～100%，氨基酸同源性為99.6%～100%。與從GenBank下載的31條參考序列、4條2019年景洪市本地流行的E基因序列進(jìn)行進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，共41條序列分為5個(gè)基因型，6株DENV-1均屬于基因I型，分別位于兩個(gè)不同的進(jìn)化分支(a，b)中(圖1)。a進(jìn)化分支的序列由2019年流行的DENV-1組成，源自云南玉溪市(9-10月)與景洪市(9月)、廣州(10月)、江西南昌市(6月)、河南(8月)和柬埔寨(6月)。在a進(jìn)化分支中，4條玉溪市E基因序列(19YX7、19YX12、19YX14、19YX15)與2019年景洪市本地流行株(JH48、JH57、JH60)和2019年廣州流行株(GenBank號(hào)：MN921432)的核苷酸相似性為100%。b進(jìn)化分支的序列均為2019年流行的DENV-1，源自云南玉溪市(9-10月)與景洪市(9月)、江西南昌市(4月)、廣州(9月)和柬埔寨(4-5月)。該進(jìn)化分支中2條E基因序列(19YX2、19YX13)與2019年景洪市本地流行株(JH78)、2019年從柬埔寨株(MW314720)、2019年廣州流行株(GenBank號(hào)：MN921447、MN923083)和2019年南昌株(GenBank號(hào)：MN894235)的核苷酸相似性最高為100%。

▲為2019年輸入玉溪的DENV-1 E基因序列；●為2019年景洪市本地流行的DENV-1 E基因序列

3條DENV-2 E基因序列核苷酸相似性為91.1%～99.9%，氨基酸同源性為97.4%～99.8%。與從GenBank下載的24條序列及2019年在云南景洪市本地流行的5條E基因序列進(jìn)行進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，共32條序列分為5個(gè)基因型，3株DENV-2分布在亞洲Ⅰ基因型(Asian I)和全球基因型(Cosmopolitan)中，均與2019年景洪市流行株位于同一進(jìn)化分支中(圖2)。1株 全球基因型(YX8)與2019年景洪市流行株(JH22)的核苷酸相似性為99.8%，氨基酸同源性為99.6%。2株AsianⅠ基因型(YX1/YX4)與2019年景洪市流行株(JH38/JH89/JH92/JH100)的核苷酸相似性為99.8%～100%，氨基酸同源性為99.8%～100%。

▲為2019年輸入玉溪的DENV-2 E基因序列；●為2019年景洪市本地流行的DENV-2 E基因序列

1條DENV-3 E基因序列(YX5)與從GenBank下載的23條序列及2019年景洪市的1條E基因序列進(jìn)行進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，共25條序列分為4個(gè)基因型。YX5與2019年景洪市流行株(JH75)位于同一進(jìn)化分支，屬于基因Ⅲ型(圖3)。YX5與2019年景洪市流行株(JH75)的核苷酸相似性為99.3%，氨基酸同源性為100%。

▲為2019年輸入玉溪的DENV-3 E基因序列；●為2019年景洪市本地流行的DENV-3 E基因序列

3 討 論

2019年登革熱在全球范圍內(nèi)廣泛流行，美洲和亞洲區(qū)域多個(gè)國(guó)家和地區(qū)登革熱流行強(qiáng)度超過(guò)2018年同期水平[11-14]。2019年7-9月在東南亞和西太平洋地區(qū)，菲律賓、馬來(lái)西亞、新加坡、越南、柬埔寨等國(guó)家是受疫情影響最為嚴(yán)重的國(guó)家[12-14]。由東南亞國(guó)家輸入的登革熱病例高于去年同期水平，國(guó)內(nèi)廣東、云南、江西和福建等省份暴發(fā)本土群聚性疫情[11,13]。

玉溪市位于滇中腹地，交通便利，存在登革熱輸入的便利條件。2019年4月至10月，玉溪市共監(jiān)測(cè)到來(lái)自西雙版納州、柬埔寨、緬甸和越南的輸入性病例23例，其中18例為9月至10月從西雙版納州輸入，無(wú)本地登革熱病例報(bào)告，與往年相比輸入病例數(shù)量和輸入來(lái)源地區(qū)/國(guó)家數(shù)量均有增加，且輸入病例來(lái)源以西雙版納為主。輸入病例以成年人為主，分布于9縣/區(qū)中的7個(gè)縣區(qū)，主要分布在江川區(qū)和紅塔區(qū)。人群分類以農(nóng)民、家務(wù)及待業(yè)為主。登革熱傳播媒介白紋伊蚊在云南呈全省性分布[15]，玉溪市屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，溫和濕潤(rùn)，有利于蚊蟲(chóng)孳生，2015年玉溪市在中心城區(qū)首次監(jiān)測(cè)到白紋伊蚊且密度較高[16]，因此玉溪市存在因登革熱輸入引起本地傳播及暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，提示今后應(yīng)在全市范圍內(nèi)進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)農(nóng)民、家務(wù)及待業(yè)等人群的登革熱防控知識(shí)宣傳和病例監(jiān)測(cè)工作。

對(duì)輸入病例進(jìn)行病原檢測(cè)和E基因進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，2019年從景洪市輸入的病例中檢測(cè)到3個(gè)血清型的登革病毒(DENV-1/DENV-2/DENV-3),其中6株DENV-1屬于基因I型，3株DENV-2屬于兩個(gè)基因型(Asian I基因型和Cosmopolitan 基因型)，1株DENV-3屬于基因Ⅲ型。溯源分析發(fā)現(xiàn)，輸入的DENV-1 E基因序列均與2019年景洪市本地流行株E基因序列相似性為100%，與病例的流行病學(xué)史相符。同時(shí)，與2019年從柬埔寨輸入云南的病毒株、2019年廣州和江西南昌流行株進(jìn)化關(guān)系較近。輸入的3株DENV-2 分別屬于Asian I基因型和Cosmopolitan 基因型，均與2019年景洪市DENV-2本地流行株位于同一進(jìn)化分支，核苷酸相似性最高，與病例流行病學(xué)史相符。其中Asian I基因型序列與東南亞國(guó)家流行株進(jìn)化關(guān)系較近，位于同一大的進(jìn)化分支中。Cosmopolitan 基因型的序列與2017-2019年廣州、泰國(guó)流行株進(jìn)化關(guān)系較近。輸入的1株DENV-3 E基因序列屬于基因III型，與2019年景洪市流行株的核苷酸相似性最高為99.3%，氨基酸同源性為100%，與病例流行病學(xué)史相符。同時(shí)，與2019年緬甸流行株進(jìn)化關(guān)系較近，位于同一進(jìn)化分支。

綜上所述，2019年玉溪市輸入性登革熱病例中存在境外輸入和本省其它地區(qū)輸入兩種類型登革病例，輸入型病例攜帶3種登革病毒(登革病毒1、2和3型)，病毒分子遺傳進(jìn)化分析結(jié)果提示輸入性登革病毒與東南亞國(guó)家流行的登革病毒毒株進(jìn)化關(guān)系最近，提示需進(jìn)一步加強(qiáng)登革熱境內(nèi)外輸入病例的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)，同時(shí)加強(qiáng)登革熱防控知識(shí)宣傳工作。

利益沖突：無(wú)