TaqMan-rRT-PCR檢測豬霍亂沙門菌方法的建立和實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)

張景山，李 旭，閆梅英，闞 飆，樊粉霞

豬霍亂沙門氏菌是非傷寒沙門菌的一種，是引起仔豬副傷寒的主要病原菌[1-2]，也容易侵染人[3]，人感染后主要表現(xiàn)為高熱及菌血癥等全身性感染癥狀[2-4]，但臨床癥狀不典型，很難與傷寒及副傷寒沙門菌引起的腸熱癥及其他非沙門菌引起的人類發(fā)熱癥狀區(qū)分，如布魯氏菌病、鉤端螺旋體病、斑疹傷寒及侵襲性金黃色葡萄球菌感染等。在發(fā)達(dá)國家，沙門菌引起的腹瀉仍是公共衛(wèi)生問題，但血液感染傷寒及非傷寒沙門菌的病例很少；在非洲，非傷寒沙門菌感染引起發(fā)熱病例很常見[5]；在我國，也有豬霍亂沙門菌引起敗血癥的報(bào)道[6-8]。

利用沙門菌增菌液進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)是傳統(tǒng)鑒定豬霍亂沙門菌的方法[9-11]。對(duì)分離得到的疑似菌落進(jìn)行生化及血清型凝集鑒定，需要3～5 d，耗時(shí)費(fèi)力，同時(shí)血清凝集反應(yīng)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等存在交叉反應(yīng)、特異性不高及敏感性低等一些問題，這樣很容易引起病例漏診、誤診而延誤治療。ELISA法診斷豬霍亂沙門菌比傳統(tǒng)的方法時(shí)間短[12]，但豬霍亂沙門菌與丙型副傷寒沙門菌兩者的抗原式相同，均可引起血液感染，且利用血清凝集試驗(yàn)以及ELISA診斷疑似樣本時(shí)會(huì)出現(xiàn)交叉[13]，最終準(zhǔn)確鑒別還需要特殊生化反應(yīng)[14]。沙門菌血清分型鑒別主要基于細(xì)菌細(xì)胞壁脂多糖(O抗原)和鞭毛抗原(H抗原)[15]，鞭毛抗原的編碼基因兩端在不同血清型沙門菌間高度保守，中間區(qū)域高度變異，有時(shí)能夠根據(jù)變異區(qū)基因序列找到特異引物用于區(qū)分不同的血清型[16]，但高度變異的特性作為分子檢測靶標(biāo)時(shí)也存在結(jié)果不準(zhǔn)確的隱患。尋找簡單、特異的單基因分子診斷方法對(duì)豬霍亂沙門菌的快速靈敏診斷以及鑒別排除十分必要，也是傳染病檢測、監(jiān)測和應(yīng)急中亟待解決的關(guān)鍵問題。

已有研究利用核酸擴(kuò)增(PCR)檢測豬霍亂沙門菌的報(bào)道[17-18]，但一般是用樣本DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。由于DNA可能是來源于處于感染狀態(tài)的活細(xì)菌，也有可能是來源于死亡細(xì)菌的DNA殘留，如果檢測標(biāo)本是原始樣本，在不能培養(yǎng)出菌株的情況下，無法最終判斷陽性樣本中細(xì)菌處于活的狀態(tài)還是死亡細(xì)菌殘留的DNA，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。另外，PCR檢測不同血清型沙門菌，也需要以特異基因片段作為靶標(biāo)。本研究經(jīng)過不同血清型沙門菌基因組序列分析，篩選到豬霍亂沙門菌的保守、特異基因SC0358，根據(jù)SC0358的基因序列，設(shè)計(jì)基于TaqMan方法的逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptional real-time polymerase chain reaction, rRT-PCR)所用引物和探針，簡寫為TaqMan-rRT-PCR，進(jìn)而驗(yàn)證基因及方法的特異性，并優(yōu)化反應(yīng)體系，以純菌、血樣本模擬等分析了反應(yīng)體系的敏感性，建立了快捷、特異和高靈敏的診斷豬霍亂沙門菌的TaqMan-rRT-PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1豬霍亂沙門菌特異基因?qū)ふ液鸵锾结樤O(shè)計(jì) 根據(jù)以往的研究[19]，我們對(duì)豬霍亂沙門菌的特有基因進(jìn)行了篩選，數(shù)據(jù)的分析過程簡述為：利用R腳本，分析比對(duì)GenBank中所有豬霍亂沙門菌已知序列，初步獲得這些全基因組序列共有的基因序列，再將這些共有序列與其他血清型沙門菌及人類基因組(人類EST庫)進(jìn)行比對(duì)分析，最終獲得豬霍亂沙門菌特異基因SC0358。分析過程中，判定基因是否存在的標(biāo)準(zhǔn)為：基因序列一致性若<50%，則認(rèn)為該基因不存在；若≥50%，則認(rèn)為該基因存在。根據(jù)豬霍亂沙門菌參考菌株SC-B67(NC_006905.1)中SC0358基因(Gene ID: 3332775)序列，利用Beacon Designer軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的TaqMan-rRT-PCR引物(表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

1.2實(shí)驗(yàn)用菌株及培養(yǎng) 本研究所用菌株均來自中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，所有菌株均經(jīng)過生化及血清型(群)鑒定。其中傷寒沙門菌(S.Typhi)10株、甲型副傷寒沙門菌(S.ParatyphiA)4株、乙型副傷寒沙門菌(S.ParatyphiB)2株、丙型副傷寒沙門菌(S.ParatyphiC)20株、豬霍亂沙門菌(S.Cholerasuis)26株、阿貢納沙門菌(S.Agona)3株、腸炎沙門菌(S.Enteritidis)8株、鼠傷寒沙門菌(S.Typhimurium)8株、湯卜遜沙門菌(S.Thompson)4株、德爾卑沙門菌(S.Derby)4株、山夫登堡沙門菌(S.Senftenberg)2株、韋太夫雷登沙門菌(S.Weltevreden)2株、阿伯丁沙門菌(S.Aberdeen)1株、鴨沙門菌(S.Anatum)1株、火雞沙門菌(S.Meleagridis)1株、圣地亞哥沙門菌(S.Sandiego)1株、烏干達(dá)沙門菌(S.Uganda)1株、肯塔基沙門菌(S.Kentukey)1株、夢得維的亞沙門菌(S.Montevideo)1株、斯坦利沙門菌(S.Stanly)1株、波摩那沙門菌(S.Pomona)1株、波茨坦沙門菌(S.Potsdam)1株、姆班達(dá)卡沙門菌(S.Mbandaka)1株、伊斯坦布爾沙門菌(S.Istanbul)1株、非丁伏斯沙門菌(S.Hvittingfoss)1株、利奇菲爾德沙門菌(S.Litchfield)1株、印第安納沙門菌(S.Indiana)1株、蓋茨黑德沙門菌(S.Gateshead)1株、維爾肖沙門菌(S.Virchow)1株、威廉斯堡沙門菌(S.Wilhelmsburg)1株、旺茲沃斯沙門菌(S.Wandsworth)1株、胥伐成格隆沙門菌(S.Schwarzengrund)1株、利文斯通沙門菌(S.Livingstone)1株、利物浦沙門菌(S.Liverpool)1株、斯坦利維爾沙門菌(S.Stanleyville)1株。另外，本研究也選用其他腸道常見病原菌O1、O139血清群霍亂弧菌(V.choleraeserogroup O1，V.choleraeserogroup O139)各2株、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)3株、志賀菌(Shigellaspp.)4株、致瀉性大腸桿菌(DiarrhealE.coli)4株以及引起發(fā)熱并可在血液標(biāo)本中分離到的金黃色葡萄球菌(S.aureus)5株、肺炎鏈球菌(S.peumoniae)1株、伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)1株、鉤端螺旋體(Leptospira)1株、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella)1株、腦膜炎奈瑟菌(N.meningitis)1株、立克次體(Rickettsia)1株、布魯氏菌(Brucella)3株等共29株作為傷寒沙門菌的特異性評(píng)價(jià)檢測菌株。菌株培養(yǎng)所用培養(yǎng)基：肺炎鏈球菌(哥倫比亞血平板)、嗜肺軍團(tuán)菌(GVPC液體培養(yǎng)基)、伯氏疏螺旋體(BSK培養(yǎng)基)、鉤端螺旋體(Korthof培養(yǎng)基)、腦膜炎奈瑟菌(血瓊脂培養(yǎng)基)、立克次體(Vero-E6細(xì)胞培養(yǎng))和布魯氏菌(布氏瓊脂)，其余菌株均用Luria-Bertani培養(yǎng)基。

1.3反應(yīng)體系與擴(kuò)增條件 以提取的病原菌的RNA為模板，參照One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)試劑盒說明書(Takara, code No.RR064A)，采用20 μL反應(yīng)體系：10 μL 2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ(1×)、0.4 μL TaKaRa Ex Taq HS(5 U/μL)、0.4 μL PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ、0.5 μL PCR Forward Primer(10 μmol/L)、0.5 μL PCR Reverse Primer(10 μmol/L)、1 μL 探針引物、RNA模板2 μL、5.2 μL 無RNase 水。使用CFX96熒光PCR儀對(duì)RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及核酸擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：42 ℃ 5 min; 95 ℃ 10 s; 95 ℃ 5 s, 58 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。對(duì)于Ct值≤35的擴(kuò)增結(jié)果判定為陽性。以相應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)，橫坐標(biāo)為細(xì)菌濃度的對(duì)數(shù)值，繪制TaqMan-rRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

普通PCR反應(yīng)體系：5 μL 10×擴(kuò)增緩沖液(含Mg2+)、4 μL dNTP混合物(每種濃度為2.5 mmol/L)、上游和下游引物分別 1.5 μL(10 μmol/L)、1 μL Pfu(5 U/μL)、2 μL模板DNA(50 ng/反應(yīng))、35 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，35個(gè)循環(huán)：95 ℃ 10 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 5 min，25 ℃ 5 min。

1.4血模擬標(biāo)本的制備及RNA提取 從平板上挑取新鮮培養(yǎng)的單克隆，液體振搖培養(yǎng)5 h，菌液濃度經(jīng)平板計(jì)數(shù)(6.5×108cfu/mL)，將培養(yǎng)液按10倍梯度系列稀釋為101～106cfu/mL，分別用2 mL新鮮的人抗凝血與同體積的各濃度菌液混勻，室溫放置30 min，作為全血模擬標(biāo)本。對(duì)上述模擬標(biāo)本進(jìn)行豬霍亂沙門菌RNA的提取(QIAamp UCP PurePathogen Blood field test Kit，QIAGEN公司)，將不加菌液的血液作為陰性對(duì)照組(NC)。

1.5純培養(yǎng)細(xì)菌的RNA提取 將從平板上挑取的單克隆豬霍亂沙門菌過夜培養(yǎng)，第2天，按1∶100接種到新鮮的培養(yǎng)液里，菌液濃度為OD=0.6左右時(shí)，收集菌液，提取總RNA(RNeasy Minikit，QIAGEN公司)。對(duì)提取的總RNA進(jìn)行濃度測定后，進(jìn)行10倍梯度稀釋，最后選取6個(gè)濃度梯度：0.005、0.05、0.5、5、50和500 pg/μL，每個(gè)濃度的樣本各取2 μL作為模板，分析TaqMan-rRT-PCR反應(yīng)體系的敏感性。

1.6細(xì)菌的DNA提取 挑取平板上的新鮮單克隆，接種到LB液體培養(yǎng)基中，菌液濃度為OD=0.6左右時(shí)，收集菌液，提取總DNA，按照相應(yīng)試劑盒(QIAGEN)說明書操作步驟進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1TaqMan-rRT-PCR檢測體系建立 根據(jù)篩選到的豬霍亂沙門菌的特異基因SC0358，設(shè)計(jì)普通PCR引物(表1)，選取從我國不同地點(diǎn)及時(shí)期分離到的豬霍亂沙門菌，共計(jì)26株，提取DNA為模板，對(duì)SC0358進(jìn)行全基因擴(kuò)增，結(jié)果得到大小為501 bp的目的條帶，隨機(jī)選擇5個(gè)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序、比對(duì)分析，DNA序列一致率為100%，說明SC0358在豬霍亂沙門菌中高度保守。同時(shí)利用34種血清型116株沙門菌及29株非沙門菌進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果均為陰性，說明SC0358是豬霍亂沙門菌的特異、保守的基因，可作為診斷豬霍亂沙門菌感染的分子靶標(biāo)。利用軟件Beacon Designer 設(shè)計(jì)針對(duì)該基因的TaqMan-rRT-PCR引物(表1)，以豬霍亂沙門菌的純菌樣本提取的總RNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，最終確定的反應(yīng)條件、引物用量及退火溫度詳見1.3(反應(yīng)體系與擴(kuò)增條件)。

2.2TaqMan-rRT-PCR特異性分析 以48種145株細(xì)菌為檢測樣本，進(jìn)一步分析TaqMan-rRT-PCR引物的特異性，其中26株豬霍亂沙門菌檢測結(jié)果均為陽性，沙門菌屬的其余34種血清型90株菌擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，其他常見的腹瀉癥狀致病菌及臨床常見的發(fā)熱病原菌擴(kuò)增均為陰性。同時(shí)將這些樣品進(jìn)行了普通PCR檢測，TaqMan-rRT-PCR與普通PCR檢測結(jié)果一致。結(jié)果說明：根據(jù)SC0358基因序列，設(shè)計(jì)TaqMan-rRT-PCR體系檢測引物，可很好的識(shí)別豬霍亂沙門菌，具有非常高的血清和菌種特異性，目前檢測的菌株基礎(chǔ)上分辨率可達(dá)100%。

2.3以純菌樣本RNA為模板的TaqMan-rRT-PCR敏感性分析 提取豬霍亂沙門菌純培養(yǎng)物的RNA，按10倍梯度稀釋后作為模板，檢測TaqMan-rRT-PCR反應(yīng)的敏感性，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果一致(圖1A)。本研究結(jié)果顯示檢測SC0358基因的敏感性為5 fg/反應(yīng)，大約為10個(gè)拷貝/反應(yīng)。以反應(yīng)Ct值為縱軸，以模板RNA的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫軸，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=-1.53ln(x)+36.196，R2=0.999 6(圖1B)，說明引物的擴(kuò)增效率很高。

A：純菌RNA樣本TaqMan-rRT-PCR敏感性分析，提取的豬霍亂沙門菌總RNA經(jīng)系列梯度稀釋后，作為反應(yīng)的模板。

2.4血液模擬標(biāo)本中TaqMan-rRT-PCR敏感性分析 將豬霍亂沙門菌培養(yǎng)液按10倍梯度稀釋至不同濃度后，與新鮮的血液混勻，室溫放置后，從模擬血標(biāo)本中提取豬霍亂沙門菌的RNA，用50 μL的無RNase的無菌水溶解每個(gè)樣品的RNA產(chǎn)物，取其中2 μL作模板，進(jìn)行TaqMan-rRT-PCR敏感性分析，進(jìn)行了3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果一致。如圖2A所示：以豬霍亂沙門菌特異基因SC0358為靶標(biāo)的TaqMan-rRT-PCR反應(yīng)體系檢測血模擬標(biāo)本的最低檢測下限為25 cfu/mL。以反應(yīng)Ct值為縱軸，模板RNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫軸，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=-1.546ln(x)+37.451，R2=0.989 3(圖2B)，說明引物的擴(kuò)增效率很高。

A：血模擬樣本RNA的TaqMan-rRT-PCR敏感性分析，提取豬霍亂沙門菌血模擬樣本的總RNA經(jīng)系列梯度稀釋后，作為反應(yīng)的模板。a: 2.5×106 cfu/mL；b: 2.5×105 cfu/mL；c: 2.5×104 cfu/mL；d: 2.5×103 cfu/mL；e: 2.5×102 cfu/mL；f: 2.5×101 cfu/mL；NC: 陰性對(duì)照。B: 模板濃度和Ct值之間的相關(guān)系數(shù)分析。

3 討 論

靶標(biāo)的特異性是分子診斷最關(guān)鍵一步?；谌蚪M、多基因和單基因的病原菌檢測技術(shù)都是基于病原菌的遺傳物質(zhì)DNA或RNA的特征識(shí)別。尋找病原微生物的特異基因并據(jù)此設(shè)計(jì)引物，通過熒光定量PCR檢測病原菌仍舊是方便快捷、性價(jià)比高的檢測手段。另外，當(dāng)前基因組測序和生物信息學(xué)分析技術(shù)快速發(fā)展，大量病原微生物進(jìn)行了基因組測序，病原基因組數(shù)據(jù)庫包括的種類和數(shù)量也急劇增加，使得通過基因組數(shù)據(jù)庫的比對(duì)、篩選到某種病原微生物的特異基因序列變得很容易。我們可以不經(jīng)過大量菌株實(shí)驗(yàn)測試，只需將基因組數(shù)據(jù)庫中存儲(chǔ)的各類病原微生物基因組序列進(jìn)行比對(duì)，就可以尋找、判斷一種病原體的特異基因或片段序列。

目前，已建立通過檢測編碼特異抗原的基因鑒別病原菌的檢測方法[13, 20-23]，也有根據(jù)病原菌特有保守的非抗原基因的檢測方法[24-25]。分子檢測所選的靶基因應(yīng)為待檢病原微生物的特有識(shí)別序列，這是建立特異分子檢測方法的基本要求。根據(jù)沙門菌毒力島(SPI-1)三型分泌系統(tǒng)中編碼伴侶分子的invB基因序列，設(shè)計(jì)檢測豬霍亂沙門菌的PCR引物，雖然豬霍亂沙門菌可擴(kuò)增出陽性目的條帶，但擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性比較低，此序列與NC006905、AE008832、STU08279和AE017220序列同源性高達(dá)99%～100%[17]，所以利用invB基因并不能直接區(qū)分豬霍亂沙門菌與其他血清型沙門菌，還需其他的血清學(xué)及生化實(shí)驗(yàn)輔助。

目前為止，經(jīng)數(shù)據(jù)庫序列比對(duì)，經(jīng)本研究所用沙門菌屬及臨床癥狀類似的非沙門菌致病菌的核酸擴(kuò)增篩選，確定SC0358基因是豬霍亂沙門菌的特異基因，SC0358編碼DNA穩(wěn)定蛋白。根據(jù)SC0358全基因序列，設(shè)計(jì)TaqMan-rRT-PCR的引物，能很好地區(qū)分豬霍亂沙門菌與其他常見的沙門菌血清型，此方法可應(yīng)用于發(fā)熱病原的鑒別診斷。

以TaqMan技術(shù)為基礎(chǔ)建立的rRT-PCR方法檢測豬霍亂沙門菌有明顯的優(yōu)勢。首先，除內(nèi)外引物外，還有探針序列，3條序列覆蓋的3個(gè)區(qū)域可增加檢測的特異性。其次，在臨床和疫情現(xiàn)場，判斷病例樣本中是否存在活菌或處于應(yīng)急感染期至關(guān)重要。TaqMan-rRT-PCR反應(yīng)體系所用的模板為RNA，陽性結(jié)果表明處于感染期，致病菌處于活的狀態(tài)，可排除死菌殘留DNA的假陽性結(jié)果。另外，細(xì)菌染色體DNA為單拷貝，而基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA具有明顯多的拷貝數(shù)，因此，對(duì)于細(xì)菌相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的mRNA進(jìn)行檢測，具有提高方法敏感性和明確活菌感染的優(yōu)勢。最后，我們以豬霍亂沙門菌特有基因SC0358建立的TaqMan-rRT-PCR反應(yīng)體系分析純菌、血模擬樣本的敏感性分別為5 fg/反應(yīng)(大約為10個(gè)拷貝/反應(yīng))、25 cfu/mL，優(yōu)于之前的檢測體系[18-19]。

鑒于豬霍亂沙門菌是一類重要的人獸共患菌，也是食品安全中需要防范的病原菌；另外，豬霍亂沙門菌也可致血流感染，因此以發(fā)熱和血液為標(biāo)本進(jìn)行病原微生物檢測時(shí)，應(yīng)作為一種篩查的病原體；又因?yàn)樨i霍亂沙門菌在沙門菌血清型鑒定上難與丙型副傷寒沙門菌進(jìn)行血清凝集鑒別，本研究建立的TaqMan-rRT-PCR檢測豬霍亂沙門菌的反應(yīng)體系，為解決上述問題提供很好的方法。本研究特異性和敏感性數(shù)據(jù)均來自豬霍亂沙門菌純培養(yǎng)及血液模擬標(biāo)本，將來需要進(jìn)一步收集來自食品、臨床病人或者動(dòng)物的實(shí)際標(biāo)本，對(duì)本研究建立的豬霍亂沙門菌TaqMan-rRT-PCR檢測體系進(jìn)一步驗(yàn)證和完善。

利益沖突：無