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    空氣放電處理誘導(dǎo)尖孢鐮刀菌孢子的凋亡過(guò)程

    2021-06-03 02:37:40劉夢(mèng)蝶姜慧雯嚴(yán)守雷王清章
    食品科學(xué) 2021年9期
    關(guān)鍵詞:負(fù)離子膜電位鐮刀

    劉夢(mèng)蝶,姜慧雯,李 潔,2,3,*,嚴(yán)守雷,2,3,王清章,2,3

    (1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430070;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430070; 3.湖北省水生蔬菜保鮮加工工程技術(shù)研究中心,湖北 武漢 430070)

    蓮藕(Nelumbo nuciferaGaertn.)是我國(guó)重要的水生經(jīng)濟(jì)作物,深受國(guó)內(nèi)外眾多消費(fèi)者青睞。蓮藕在長(zhǎng)期貯藏以及運(yùn)輸中容易發(fā)生腐爛,腐爛是僅次于褐變的影響蓮藕品質(zhì)的重要因素之一。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)是蓮藕采后的主要腐敗菌[1]。

    空氣放電技術(shù)是將風(fēng)機(jī)送入的空氣在高壓靜電處理下,通過(guò)一系列復(fù)雜的電離和結(jié)合過(guò)程,產(chǎn)生放電生成氣的過(guò)程,主要生成臭氧(ozone,O3)和負(fù)離子(包括O2-、O3-、H2O-等)。用一定濃度的放電生成氣對(duì)果品的貯藏環(huán)境進(jìn)行處理,能夠抑制果實(shí)呼吸強(qiáng)度和微生物生長(zhǎng),有助于果蔬的保藏[2]。

    凋亡是由高度進(jìn)化后基因調(diào)控的一種細(xì)胞程序性死亡過(guò)程,普遍存在于動(dòng)物、植物以及微生物中,對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài),衰老和分化等過(guò)程具有重要作用[3-6]。絲狀真菌在生長(zhǎng)的各個(gè)階段經(jīng)常會(huì)有凋亡現(xiàn)象出現(xiàn),如異核體不親和和菌絲自溶,另外多種脅迫因子如紫外線、滲透壓、抗真菌藥物等均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。很多學(xué)者以酵母凋亡通路為例,研究外界刺激下絲狀真菌凋亡特征事件發(fā)生的次序及關(guān)聯(lián),結(jié)果發(fā)現(xiàn),番茄紅素可以誘導(dǎo)尖孢鐮刀菌菌絲凋亡,凋亡細(xì)胞具有DNA斷裂、線粒體膜去極化和活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)累積等特征[7]。實(shí)驗(yàn)室前期研究表明空氣放電處理能顯著抑制尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā),對(duì)尖孢鐮刀菌細(xì)胞活力及其超微結(jié)構(gòu)、生理代謝和細(xì)胞膜等方面產(chǎn)生影響,達(dá)到抑菌作用[2,8-9]。本研究將從空氣放電處理誘導(dǎo)尖孢鐮刀菌孢子凋亡過(guò)程中的各種現(xiàn)象及可能存在的凋亡機(jī)制方面出發(fā),進(jìn)一步完善空氣放電處理抑菌機(jī)理,為空氣放電技術(shù)對(duì)果品腐敗的抑制提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 菌株、材料與試劑

    尖孢鐮刀菌為蓮藕貯藏期病原菌,經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室分離、純化、鑒定后保存?zhèn)溆谩?/p>

    馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、DCFH-DA ROS檢測(cè)試劑盒、Fluo-3 AM熒光探針 上海碧云天生物技術(shù)有限 公司;Rho123線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒 上海貝博生物科技有限公司;Rhod-2 AM Ca2+熒光線粒體探針 美國(guó)AAT Bioquest公司;CaspACE FITC-VAD-FMK染液 美國(guó) Promega公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    MIC-O3臭氧變送器 深圳市藍(lán)月測(cè)控技術(shù)有限 公司;QT2SVP500一體化臭氧發(fā)生器 深圳市松野電器有限公司;TFB-YA278負(fù)離子發(fā)生器 天長(zhǎng)市創(chuàng)普電子有限公司;Guava easyCyte 8流式細(xì)胞儀 美國(guó)Merck Millipore公司;FACSVerse流式細(xì)胞儀 美國(guó)Becton Dicknson公司;F-4600熒光分光光度計(jì) 日本HITACHI公司;ECLIPSE Ti-S倒置熒光顯微鏡 日本Nikon 公司。

    1.3 方法

    1.3.1 尖孢鐮刀菌的空氣放電處理

    F. oxysporum接種于PDA平板上,于26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。密閉空氣放電設(shè)備內(nèi)臭氧和負(fù)離子生成氣達(dá)到設(shè)定濃度后將平板分別放入臭氧(6.87 mg/m3)、負(fù)離子(5×106ions/cm3)、臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理 (6.87 mg/m3+5×106ions/cm3)環(huán)境中,分別處理1、2、3、4、5 h,以不做任何處理為對(duì)照,向每個(gè)平板中加入1.5 mL無(wú)菌水,將其產(chǎn)生的分生孢子用無(wú)菌水潤(rùn)洗至試管,然后離心(4 ℃、1000 ×g、5 min)收集孢子。

    1.3.2 尖孢鐮刀菌孢子的凋亡雙染

    用0.1 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)重懸1.3.1節(jié)得到的孢子并計(jì)數(shù),取10 μL孢子懸液用190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸洗滌,使孢子密度約1×106個(gè)/mL,加入用PBS稀釋10 倍后的Annexin V-FITC染色液5 μL,1 μL碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色液輕輕混勻,避光孵育20 min,采用FACSVerse流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

    1.3.3 尖孢鐮刀菌孢子ROS含量測(cè)定

    按照1∶1000體積比用PBS稀釋熒光探針DCFH-DA至濃度為10 μmol/mL。取洗滌后的孢子,重懸于稀釋好的500 μL DCFH-DA中,孢子密度約1×106個(gè)/mL,室溫避光孵育1 h。PBS洗滌后,用Guava easyCyte 8流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS水平成正比,故以熒光強(qiáng)度表征孢子ROS含量。

    1.3.4 尖孢鐮刀菌孢子膜電位的測(cè)定

    按照Rho123線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制染色緩沖液及Rho123染色工作液(質(zhì)量濃度50 μg/mL)。用500 μL Rho123染色工作液將孢子重懸,孢子密度約1×106個(gè)/mL,室溫避光孵育30 min,洗滌離心(4 ℃、3000×g、5 min)收集孢子,用500 μL染色緩沖液將孢子重懸,用Guava easyCyte 8流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),以熒光強(qiáng)度表征膜電位,熒光強(qiáng)度越大,膜電位越高。

    1.3.5 尖孢鐮刀菌孢子胞漿Ca2+濃度的測(cè)定

    Fluo-3 AM是一種可以穿透細(xì)胞膜的熒光染料。Fluo-3 AM 的熒光非常弱,其熒光不會(huì)隨Ca2+濃度升高而增強(qiáng)。Fluo-3 AM 進(jìn)入細(xì)胞后可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo-3, 從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)。Fluo-3可以和Ca2+結(jié)合,且結(jié)合后可以產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光。

    按照1∶10000體積比用PBS稀釋熒光探針Fluo-3 AM, 使終濃度為0.5 μmol/L。取30 μL收集的孢子懸液,重懸于稀釋好的200 μL Fluo-3 AM溶液中,孢子密度約2.5×106個(gè)/mL,室溫避光孵育50 min進(jìn)行熒光探針裝載,PBS洗滌兩次(4 ℃、3000×g、5 min),再孵育20 min后用Guava easyCyte 8流式細(xì)胞儀檢測(cè)[10],以熒光強(qiáng)度表征Ca2+濃度,熒光強(qiáng)度越大,胞漿Ca2+濃度越高。

    1.3.6 尖孢鐮刀菌孢子線粒體Ca2+濃度的測(cè)定

    Rhod-2 AM Ca2+熒光線粒體探針是一種Rhod-2的乙酰甲酯衍生物,進(jìn)入細(xì)胞后被內(nèi)酯酶剪切生成不具膜滲透性的Rhod-2,負(fù)載到細(xì)胞內(nèi)。Rhod-2是一種可見(jiàn)光激發(fā)的高親和力Ca2+指示劑,能有效地將鈣熒光信號(hào)增加幾十倍。Rhod-2具有很強(qiáng)的染料吸收性能,使得更低濃度的探針即可成功檢測(cè)Ca2+濃度變化,從而降低了對(duì)活細(xì)胞的光毒性;由于產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度具有很強(qiáng)的Ca2+依賴性,對(duì)Ca2+濃度檢測(cè)的敏感度也更高,故以熒光強(qiáng)度表征Ca2+濃度。

    利用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解Rhod-2 AM配制成質(zhì)量濃度2 mg/mL的儲(chǔ)存液,分裝后于-20 ℃避光干燥密封保存,在使用前回溫至室溫,用PBS稀釋到質(zhì)量濃度5 μg/mL。用稀釋好的300 μL Rhod-2 AM染色液重懸收集的孢子,使孢子濃度約為1×107個(gè)/mL。 室溫避光孵育40 min,PBS洗滌細(xì)胞兩次(4 ℃、3000×g、5 min),加入PBS緩沖液1.5 mL再室溫避光孵育30 min后用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)550 nm、發(fā)射波長(zhǎng)580 nm[11]。

    1.3.7 尖孢鐮刀菌孢子半胱天冬氨酸酶(metacaspase)激活的檢測(cè)

    收集臭氧(6.87 mg/m3)、負(fù)離子(5×106ions/cm3)、 臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理(6.87 mg/m3+5×106ions/cm3) 條件下處理5 h的分生孢子,懸浮在用PBS稀釋的CaspACE FITC-VAD-FMK (10 μmol/L)染液中,室溫避光孵育2 h,PBS洗滌一次(4 ℃、3000×g、5 min)后重懸,取適量在熒光顯微鏡下觀察染色情況[12]。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    所得數(shù)據(jù)用Data Processing System 7.05軟件中的t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析,采用Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表制作,流式細(xì)胞儀圖像由Flowjo 7.6軟件進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 空氣放電處理誘導(dǎo)尖孢鐮刀菌孢子凋亡

    圖 1 空氣放電處理尖孢鐮刀菌孢子FITC/PI雙染凋亡分析Fig. 1 Annexin V-FITC/PI double-staining analysis of apoptosis in F. oxysporum spores after air discharge treatment

    如圖1所示,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),負(fù)離子處理組早期孢子凋亡數(shù)(Q3)增多,處理5 h時(shí),早期孢子凋亡比率從6.43%增加至28.3%,而晚期孢子凋亡數(shù)(Q2)和壞死數(shù)(Q1)基本無(wú)變化。臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組早/晚期孢子凋亡數(shù)和壞死數(shù)都明顯增加,且在每個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組孢子壞死數(shù)都明顯占優(yōu)勢(shì)。

    圖 2 空氣放電處理尖孢鐮刀菌孢子的凋亡率和壞死率Fig. 2 Apoptosis and necrosis rates of F. oxysporum spores after exposure to air discharge

    如圖2所示,負(fù)離子處理組和臭氧處理組孢子凋亡率隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)遞增趨勢(shì),臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組孢子壞死率均在處理2 h時(shí)達(dá)到最大。臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理1 h時(shí),尖孢鐮刀菌孢子已表現(xiàn)出明顯壞死,壞死率明顯高于臭氧單獨(dú)處理。說(shuō)明空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌孢子存在誘導(dǎo)凋亡和壞死雙重作用。

    2.2 空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌孢子ROS含量的影響

    如圖3所示,空氣放電處理后,尖孢鐮刀菌孢子ROS含量增加,在處理過(guò)程中,臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組ROS含量均顯著高于負(fù)離子處理組 (P<0.05)。臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組在處理2 h內(nèi)ROS明顯上升,隨后上升趨勢(shì)減緩。而負(fù)離子單獨(dú)處理組在前3 h內(nèi)ROS含量無(wú)明顯變化,處理4 h后ROS含量明顯升高。

    圖 3 空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌孢子ROS積累的影響Fig. 3 ROS accumulation in F. oxysporum spores after exposure to air discharge

    2.3 空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌孢子線粒體膜電位的影響

    圖 4 空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌孢子線粒體膜電位的影響Fig. 4 Detection of Δψm in F. oxysporum spores after exposure to air discharge

    如圖4所示,隨著空氣放電處理時(shí)間的延長(zhǎng),孢子內(nèi)線粒體膜電位逐漸下降。臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組在處理2 h內(nèi)下降趨勢(shì)明顯,負(fù)離子處理組在處理1 h內(nèi)下降趨勢(shì)明顯,在處理2 h后臭氧處理組和 臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組線粒體膜電位明顯低于負(fù)離子處理組(P<0.05)。

    2.4 空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌孢子胞漿Ca2+濃度的影響

    圖 5 空氣放電處理尖孢鐮刀菌Fluo-3 AM染色細(xì)胞分布直方圖Fig. 5 Fluo-3 AM stained cell distribution of F. oxysporum spores after exposure to air discharge

    從染色細(xì)胞分布直方圖(圖5)中可以看出,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),相較于臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組,負(fù)離子處理組染色細(xì)胞數(shù)變化不明顯。臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組染色細(xì)胞比率均在處理1 h達(dá)到最大值,分別為34.5%和44.8%。

    圖 6 空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌孢子胞漿Ca2+濃度的影響Fig. 6 Cytosolic Ca2+ levels in F. oxysporum spores after exposure to air discharge

    如圖6所示,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),相較于負(fù)離子處理組尖孢鐮刀菌孢子胞漿Ca2+濃度緩慢上升,臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組Ca2+濃度在處理1 h時(shí)達(dá)到峰值,在處理2 h后有所下降,維持相對(duì)穩(wěn)定的水平。不同處理組在各處理時(shí)間都有顯著性差異(P<0.05),其中臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理胞漿Ca2+濃度最高,其次是臭氧處理,負(fù)離子處理最低。

    2.5 空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌孢子線粒體Ca2+濃度的影響

    圖 7 空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌孢子線粒體Ca2+濃度的影響Fig. 7 Mitochondrial Ca2+ levels in F. oxysporum spores after exposure to air discharge

    如圖7所示,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),負(fù)離子處理組尖孢鐮刀菌孢子線粒體Ca2+濃度緩慢上升,而臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組Ca2+濃度在處理1 h時(shí)已大幅度升高,之后減幅穩(wěn)定上升。臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組與負(fù)離子處理組在各處理時(shí)間都有顯著性差異(P<0.05),處理4 h后臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組與臭氧處理組有顯著性差異(P<0.05)。

    在處理1 h時(shí),臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組胞漿(圖6)及線粒體Ca2+濃度(圖7)均顯著升高 (P<0.05),而處理時(shí)間延長(zhǎng)時(shí),孢子內(nèi)胞漿Ca2+濃度下降,線粒體Ca2+濃度繼續(xù)上升,可以推斷存在胞漿 Ca2+內(nèi)流入線粒體。

    2.6 空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌孢子內(nèi)Metacaspase 活力的影響

    Metacaspase是一類存在于真菌、植物及原生生物中的半胱氨酸依賴蛋白酶,與動(dòng)物細(xì)胞中胱天蛋白酶(caspase)家族具有直接同源性,通過(guò)細(xì)胞內(nèi)ROS的積累和線粒體功能的損傷對(duì)細(xì)胞凋亡起著關(guān)鍵作用[6,13-15]。 Z-VAD-FMK是一種廣泛的Caspase抑制劑,可以使用FITC-VAD-FMK(Z-VAD-FMK的FITC綴合物)檢測(cè)Metacaspase活力,該FITC綴合物被遞送到細(xì)胞中,與凋亡細(xì)胞中活化的Caspase特異性結(jié)合,產(chǎn)生熒光[16-18]。

    如圖8所示,3 種處理組中部分細(xì)胞顯示出明顯的綠色熒光,而對(duì)照組未觀察到熒光,其中臭氧處理組和臭氧+負(fù)離子同時(shí)處理組染色細(xì)胞數(shù)及熒光強(qiáng)度明顯高于負(fù)離子處理組。表明空氣放電處理后,尖孢鐮刀菌孢子內(nèi)Metacaspase活力明顯增強(qiáng)。

    圖 8 空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌孢子內(nèi)Metacaspase活力的影響Fig. 8 Effect of air discharge on the activity of metacaspase in F. oxysporum spores

    3 討 論

    誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的兩個(gè)關(guān)鍵分子信號(hào)為ROS和Ca2+[19-20]。 細(xì)胞Ca2+超載或胞內(nèi)Ca2+區(qū)域化分布的擾動(dòng)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性并能引發(fā)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞壞死[21]。有研究發(fā)現(xiàn),胞漿內(nèi)增多的Ca2+可促使ROS過(guò)量產(chǎn)生而引起膜脂質(zhì)過(guò)氧化,破壞細(xì)胞膜及線粒體的結(jié)構(gòu)與功能,激活內(nèi)源性核酸酶等多種酶,引起核DNA降解而誘導(dǎo)凋亡 發(fā)生[22-23]。本實(shí)驗(yàn)中空氣放電處理后胞漿和線粒體內(nèi) Ca2+濃度均迅速上升,因此,推測(cè)Ca2+超載是空氣放電誘導(dǎo)尖孢鐮刀菌孢子凋亡的原因之一。這與沈青山[24]的 研究發(fā)現(xiàn)麝香草酚是通過(guò)激活電壓門(mén)控鉀離子通道導(dǎo)致K+外流,最終導(dǎo)致黃曲霉孢子細(xì)胞凋亡不同。線粒體作為細(xì)胞能量代謝的中心,對(duì)細(xì)胞凋亡起到了關(guān)鍵作用[25],是ROS產(chǎn)生的主要來(lái)源[26]。ROS在凋亡過(guò)程作為非常重要的信號(hào)和效應(yīng)器,其積累可導(dǎo)致孢子內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)損傷,從而激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián),誘導(dǎo)凋亡 發(fā)生[27-28]。侯穎等[29]研究了不同致死濃度ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)對(duì)釀酒酵母細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制,結(jié)果表明ε-PL能夠誘導(dǎo)釀酒酵母細(xì)胞ROS迸發(fā),使細(xì)胞進(jìn)入凋亡早期階段。Savi等[30]在研究臭氧氣體破壞禾谷鐮刀菌(F. graminearum)和輪枝鐮孢菌 (F. verticillioides)菌絲形態(tài)造成細(xì)胞死亡的原因之一是細(xì)胞內(nèi)ROS的異常產(chǎn)生積累,推斷存在細(xì)胞凋亡。ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷已被證明是念珠菌屬真菌常見(jiàn)的抗真菌機(jī)制,也有少量研究集中在一些絲狀真菌如曲霉菌[31]、絲核菌[32]和鐮刀菌[33]中。

    在多種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡期間,線粒體膜電位的崩解是線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的重要事件,被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高的結(jié)果[34];劉晶[35]以H2O2作為氧化損傷刺激物,研究從3 種乳酸桿菌中分離的S-層蛋白對(duì)HT-29細(xì)胞的線粒體凋亡通路的影響,發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ROS過(guò)度觸發(fā)引起線粒體膜電位的下降,并且3 種菌株的S-層蛋白能顯著地降低HT-29細(xì)胞的線粒體膜電位。這種破壞造成線粒體膜孔的打開(kāi),導(dǎo)致凋亡因子和細(xì)胞色素c(cytochrome c,Cyt c)從線粒體釋放到胞質(zhì)[36-37]。Cyt c是位于線粒體膜間隙的一種血紅素蛋白質(zhì),不僅在線粒體呼吸鏈中起重要作用,在復(fù)合酶III和復(fù)合酶IV之間傳遞電子,也作為一種多功能蛋白酶參與細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡[38]。細(xì)胞凋亡進(jìn)程中下游Caspase的激活必須經(jīng)由Cyt c與Caspase的結(jié)合[39]。Metacaspase是Caspase的同系物,被認(rèn)定是存在于真菌、植物和原生生物凋亡過(guò)程中的引發(fā)物[18]。在真菌中,細(xì)胞凋亡途徑有Metacaspase獨(dú)立型和依賴型兩種[40],本實(shí)驗(yàn)表明空氣放電誘導(dǎo)尖孢鐮刀菌凋亡過(guò)程中會(huì)引起Metacaspase的激活,屬于Metacaspase依賴型;而毛霉素VI誘導(dǎo)尖孢鐮刀菌凋亡過(guò)程中,Metacaspase未激活[41],屬于Metacaspase獨(dú)立型。

    綜上研究結(jié)果表明,空氣放電誘導(dǎo)尖孢鐮刀菌孢子的凋亡過(guò)程是以線粒體為核心的凋亡機(jī)制,即空氣放電首先引起胞內(nèi)Ca2+濃度的增加和ROS的積累,線粒體膜電位的去極化由線粒體ROS的產(chǎn)生引起,導(dǎo)致Cyt c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì),激活Metacaspase,最終導(dǎo)致孢子凋亡。

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