超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定薏仁米中 25種磺酰脲類除草劑殘留

王顯貴，吳小毛，楊曉鳳，劉 煒

(1.貴州大學，貴州貴陽 550025；2.興仁市農業(yè)農村局，貴州興仁 562300； 3.四川省農業(yè)科學院 分析測試中心，四川成都 610066)

磺酰脲類除草劑是全球主流除草劑之一，具有品種較多、高活性、低毒、低劑量、廣譜、高選擇性等特點，屬于內吸傳導型選擇性除草劑，通過對植物體內乙酰乳酸合成酶(ALS)的抑制，抑制植物細胞的分裂，使細胞不能正常生長[1]。

薏苡為禾本科薏苡屬草本植物，其干燥成熟的種仁是一種既有豐富營養(yǎng)又有獨特藥理作用的藥食兩用資源，具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、降血糖、降血壓和提高機體免疫力等多種藥理活性[2-4]。薏苡是多年生草本植物，種植過程中影響其產(chǎn)量、品質的因素很多，病蟲草害是影響產(chǎn)量、品質的重要因素之一。目前化學除草、防治病蟲害是保障薏仁米高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、品質的重要措施?；酋ｋ孱惓輨溙镏性S多一年生或多年生闊葉雜草有較好的防效[5]。隨著該類除草劑的廣泛使用，其在薏仁米中殘留，對人類身體健康造成一定影響。

近幾年，磺酰脲類除草劑的殘留分析方法主要有色譜法[6-8]、色譜-串聯(lián)質譜法[9-14]、毛細管電泳法[15]。目前關于同時檢測薏仁米中多種磺酰脲類除草劑的方法尚未見報道。QuEChERS是一種具有快速(Quick)、簡單(Easy)、成本低(Cheap)、高效(Effective)、穩(wěn)定(Rugged)、安全(Safe)等特點的前處理技術[16]，本研究以QuEChERS前處理技術為基礎，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜 (UPLC-MS/MS) 法，建立了薏仁米中25種磺酰脲類除草劑的檢測方法，旨在為薏仁米中農藥殘留監(jiān)測提供高效技術支持。

1 材料與方法

1.1 藥劑、試劑與儀器

25種磺酰脲類除草劑標準品(質量分數(shù)＞97%，德國Dr. Ehrenstorfer公司)；甲醇、乙腈(質譜純/色譜純，美國Fisher公司)；甲酸、甲酸銨(色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司)；氯化鈉(分析純，四川西隴化工有限公司)；無水硫酸鎂(質量分數(shù)≥98%，德國CNW科技公司)；石墨化炭黑(GCB)、十八烷基鍵合相硅膠(C18)吸附劑、乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine，PSA)吸附劑(上海安譜實驗科技股份有限公司)；試驗用水均為超純水。

Waters ICLASSXEVO TQ XS型超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀配ESI離子源(美國沃特世公司)；高速萬能粉碎機(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；JA3003型分析天平(上海精密科學儀器有限公司)；渦旋振蕩器(美國Scientific Industries公司)；Neofuge 18R型高速離心機(香港力康生物醫(yī)療科技控股集團)；Milli-Q型超純水儀；0.22 μm有機系濾膜(美國安捷倫公司)。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取25種農藥標準品各10.00 mg于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成質量濃度為1 000 mg/L的標準儲備液。臨用時，根據(jù)試驗需要，用乙腈或薏仁米空白基質溶液稀釋混合標準溶液，配成不同質量濃度的標準工作溶液。

1.3 基質效應

薏仁米基體比較復雜，含有大量淀粉等共提取物，在前處理過程中，薏仁米樣品中的共提取物與目標化合物一同進入質譜系統(tǒng)，會對目標化合物的離子化程度產(chǎn)生一定影響，造成響應信號的降低或提高。為了有效減少干擾物，本文采用優(yōu)化前處理方法，采用基質校準曲線的斜率(km)與純溶劑標準曲線的斜率(ks)之比值來評價基質效應，根據(jù)公式ME=km/ks計算基質效應(ME)。當0.8＜ME＜1.2時為弱基質效應，可以接受；當ME＜0.8時為基質抑制效應；當ME＞1.2時為基質增強效應[17]。

1.4 色譜測定條件

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC CSH C18柱(2.1mm×100 mm, 1.7 μm)；柱溫：40 ℃；進樣體積：2.0 μL；流速：0.3 mL/ min。流動相A：水(含0.1%甲酸及10 mmol/L甲酸銨)，流動相B：甲醇；梯度洗脫程序：0~1 min，60%~55% A；1~3 min，55%~50% A；3~6 min，50%~25% A；6~7 min，25%~10% A；7~9 min，60% A；

質譜條件：采用正離子掃描，電噴霧離子源 (ESI)；毛細管電壓：3.0 kV；錐孔反吹氣為氮氣，流速：150 L/h；碰撞氣為氬氣，壓力為 230 kPa；脫溶劑氣體流速：800 L/h；脫溶劑溫度：500 ℃；離子源溫度：150 ℃。多反應監(jiān)測模式 (MRM)，具體質譜參數(shù)見表2。0.05 mg/L混合標準溶液的MRM色譜圖見圖1。

圖1 MRM模式下25種除草劑混合標準溶液(0.05 μg/mL)的總離子流色譜圖

表1 25種除草劑的質譜檢測條件

續(xù)表1

1.5 樣品前處理

稱取已粉碎的薏仁米樣品5.0 g(精確至0.1 g)于50 mL離心管中，加入10.0 mL 水和 20.0 mL的乙腈(含1%甲酸)，渦旋5 min；加入3.0 g 氯化鈉，渦旋 2 min，8 000 r/min離心5 min；取上清液2.0 mL于含有80 mg C18、200 mg無水MgSO4的10 mL離心管中，渦旋2 min，8 000 r/min離心5 min，取上清液過濾膜供UPLC-MS/MS分析。

2 結果與分析

2.1 色譜及質譜條件的選擇

通過比較ESI正/負離子檢測模式下25種除草劑質譜的響應值，進入一級質譜后，25種除草劑在ESI+模式下均可得到穩(wěn)定的[M+H]+離子峰，且其響應值會明顯優(yōu)于負離子模式，SIM模式下掃描，進一步優(yōu)化子離子、錐孔電壓以及碰撞能量等質譜條件，每種除草劑選擇2個響應值高且穩(wěn)定的子離子，其中響應信號較強的子離子作為定量子離子。

分別比較了不同類型的色譜柱(Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)、 Waters ACQUITY UPLC CSH C18柱(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)、Waters ACQUITY UPLC HSST3柱(2.1 mm ×100 mm, 1.8 μm)對目標化合物的分離效果，發(fā)現(xiàn)CSH C18色譜柱的分離效果、峰型、響應值最佳。

由于磺酰脲類除草劑有弱酸性，在流動相中加入適量的甲酸和緩沖鹽，提高電噴霧的離子化效率，增加各組分在固定相上的保留，并改善色譜峰形。本試驗考察了乙腈-水(含0.1%甲酸)、甲醇-水(含0.1%甲酸)、甲醇-水(含0.1%甲酸及2 mmol/L甲酸銨)、甲醇-水(0.1%甲酸及10 mmol/L甲酸銨)流動相體系對25種目標化合物色譜分離的影響。比較乙腈-水(含0.1%甲酸)與甲醇-水(含0.1%甲酸)作為流動相的分離效果，發(fā)現(xiàn)目標化合物在甲醇-水(含0.1%甲酸)中分離效果較好。比較甲醇-水(含0.1%甲酸)、甲醇-水(含0.1%甲酸及2 mmol/L甲酸銨)、甲醇-水(含0.1%甲酸及5 mmol/L甲酸銨)、及甲醇-水(含0.1%甲酸及10 mmol/L甲酸銨)作為流動相的效果，發(fā)現(xiàn)甲醇-水(含0.1%甲酸)、甲醇-水(含0.1%甲酸及2 mmol/L甲酸銨)、甲醇-水(含0.1%甲酸及5 mmol/L甲酸銨)作為流動相時，吡嘧磺隆與環(huán)丙嘧磺隆，啶嘧磺隆與芐嘧磺隆，甲嘧磺隆與甲磺隆之間的分離效果差，在甲醇-水(含0.1%甲酸及10 mmol/L甲酸銨)流動相體系中分離好，色譜峰尖銳且對稱。因此，最終選擇甲醇-水(含0.1%甲酸及10 mmol/L甲酸銨)溶液作為流動相，流速為0.3 mL/min，進行梯度洗脫。

2.2 前處理方法的選擇

考慮到薏仁米樣品中含水量低這一特點，為了改善提取和凈化效果，預先向已粉碎的薏仁米樣品中加入適量的水，以利于極性的磺酰脲類除草劑的提取，從而提高農藥的回收率。比較加水量5.0、10.0、15.0 mL對回收率的影響，結果表明，加水量為10.0 mL最合適?；酋ｋ宄輨┏嗜跛嵝?，在酸性環(huán)境易從水中萃取到有機溶劑中，在提取溶劑的選擇上，比較了乙腈、甲醇、乙腈(含1%甲酸)對目標化合物的提取效率。以甲醇為提取溶劑時，25種目標化合物的回收率為52.0%~80.0%；以乙腈為提取溶劑時，目標化合物的回收率為84.0%~93.2%；以乙腈(含1%甲酸)為提取溶劑時，目標化合物的回收率為85.0%~ 103%，乙腈中加入1%(體積分數(shù))甲酸，可提高對堿性敏感農藥(如單嘧磺隆)的回收率。因此，最終選擇乙腈(含1%甲酸)作為提取試劑。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

薏仁米基質較為復雜，含有較多的淀粉和油脂，提取目標化合物的同時，也提取出大量的油脂色素等雜質，因此提取液需要進一步純化。GCB、PSA及C18是QuEChERS方法中常用的凈化劑，GCB可以去除葉綠素等大分子雜質，但會吸附某些具有環(huán)狀結構的農藥；C18對非極性物質，有較高的容量，對色素、甾醇和維生素的去除能力較強；PSA可以有效地去除樣品中的極性有機酸、脂類和糖類。試驗對比了GCB、PSA及C18凈化的效果。發(fā)現(xiàn)當使用PSA、GCB時，提取液的凈化效果較好，但目標化合物的回收率較低；使用C18時，提取液的凈化效果及回收率較好。對比了不同質量(40、60、80、100 mg) C18對目標化合物回收的影響，發(fā)現(xiàn)C18在40~80 mg范圍內，各目標化合物回收率隨著C18用量的增加緩慢升高，回收率達到83%~102%；當C18用量為80~100 mg時，各目標化合物的回收率下降。綜合考慮，選用80 mg C18作為凈化劑，凈化效果和回收率均能滿足殘留試驗要求。

2.4 方法的線性關系、定量限及基質效應

用空白基質提取液配制系列基質匹配標準工作溶液，按1.3節(jié)條件，經(jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定后，以目標化合物的峰面積(y)與對應的質量濃度(x)繪制標準曲線。以10倍信噪比計算方法的定量限(LOQ)。目標物的線性相關系數(shù)(r)為0.998 6~0.999 4，定量限為0.017~1.41 μg/kg，能夠滿足薏仁米中磺酰脲除草劑定量分析的基本要求。ME為0.83~1.13，基質效應不明顯，可以忽略，具體結果見表2。

2.5 方法的準確度和精密度

選取薏仁米空白樣品，添加不同水平的3個濃度進行添加回收試驗，每個添加水平重復7次，按上述所述前處理方法及條件進行測定，計算25種磺酰脲類除草劑的平均添加回收率及相對標準偏差(RSD)，結果見表3?？梢姡?5種磺酰脲類除草劑的平均添加回收率為89.5%~103.2%，相對標準偏差(RSDs) 1.7%~7.5%，說明該分析方法準確性和精密度滿足薏仁米中25種磺酰脲類除草劑殘留分析的要求。

2.6 實際樣品測定

采用本研究建立的方法對100份實際薏仁米樣品進行檢測，結果表明樣品均無除草劑檢出，此方法適用于薏仁米中磺酰脲類除草劑多殘留的篩查。

表2 25種除草劑的線性關系、定量限及基質效應

表3 25種磺酰脲類除草劑在薏仁米中的平均添加回收率和相對標準偏差(RSDS)(n=7)

續(xù)表3

3 結 論

建立了一種應用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜技術結合QuEChERS前處理技術，同時快速測定薏仁米中25種磺酰脲類除草劑的分析方法。該方法通過色譜柱、流動相、提取溶劑的優(yōu)化，使磺酰脲類除草劑分離效果更好、響應值更高及峰形更好；在薏仁米樣品中加入適量超純水，保證了薏仁米中各磺酰脲類除草劑殘留的充分提取，提高了提取效率；選用 UPLC-MS/MS多反應監(jiān)測模式(MRM)實現(xiàn)了檢測的高靈敏度和高準確度。說明本研究建立的該方法具有前處理簡單、分析時間短、準確度和靈敏度高以及基質效應不明顯等特點，適于薏仁米樣品中磺酰脲類除草劑的實際檢測需要。