升陷湯及單味藥材水提物對(duì)缺氧/復(fù)氧致心肌損傷的保護(hù)作用

金曉玲，陳 嵐，張 鳳，黃豆豆，廖麗娜，陳萬(wàn)生,3 （. 海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院藥材科，上海 00003；. 空軍杭州特勤療養(yǎng)中心療養(yǎng)三區(qū)藥械科，浙江 杭州 3000；3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，上海 003）

1960 年，Jenning 首次提出了心肌再灌注損傷的概念[1]。心肌缺血/再灌注損傷的主要原因包括氧自由基增多、細(xì)胞內(nèi)鈣超載及微血管損傷等[2-3]，缺血組織細(xì)胞恢復(fù)灌注后發(fā)生的再灌注損傷（MIRI）在恢復(fù)血流的過(guò)程中常會(huì)引起心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[4-5]，往往造成患者預(yù)后不佳[6]。

升陷湯出自張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，該方由黃芪、柴胡、升麻、桔梗、知母組成，主治大氣下陷之證，臨床廣泛用來(lái)防治心肌缺血性疾病[7]、治療老年慢性充血性心力衰竭[8]、治療不穩(wěn)定型心絞痛[9]、治療青少年病毒性心肌炎[10-11]。課題組前期考察了升陷湯及各單味藥對(duì)阿霉素致心肌細(xì)胞的保護(hù)作用[12]，尚未見(jiàn)升陷湯對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型保護(hù)作用的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)基于經(jīng)典的心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型[13]，從細(xì)胞凋亡的角度初步探討升陷湯及單味藥對(duì)心肌缺氧/復(fù)氧的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

純凈水（美國(guó)Millipore 公司）、Fura-3/AM（碧云天生物技術(shù)有限公司）、生理鹽水（海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院）；0.25%胰蛋白酶溶液（Gibco 公司）；DMEM 低糖培養(yǎng)基、培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone 公司）；MTT 工作液（美國(guó)sigma 公司）；二甲基亞砜（德國(guó)GmbH 公司）；PBS 緩沖液（南京滴純生物科技有限公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司）；DCFHDA（碧云天生物有限公司）；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD 公司）；16%甲醛（無(wú)甲醇，賽默飛世爾科技有限公司）；其他試劑為分析純。

倒置熒光顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Multiskan MK3 公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraeus 公司）；低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Heraeus 公司）；臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；熒光顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Forma 公司）；79-1 型磁力攪拌器（江蘇周莊科研儀器廠）；YJ-II 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（上海新芝生物技術(shù)研究所）；海爾低溫冰箱。

1.2 藥物的制備

升陷湯中五味藥材飲片由長(zhǎng)征醫(yī)院藥材科提供。將5 L 水浸泡升陷湯全方提取物或各單味藥材24 h 后，再煎煮，重復(fù)3 次，將濃縮水煎煮液合并至650 ml，干燥得提取物浸膏。其中，升陷湯組方飲片（簡(jiǎn)稱藥物SXT）包括黃芪600 g，知母300 g，柴胡150 g，桔梗150 g 和升麻100 g。SXT、黃芪、知母、柴胡、桔梗和升麻水提液蒸干后的浸膏重量分別為431.2、187.5、89.5、45.2、43.5、28.1 g。將所有提取物分別研細(xì)，于-20°C 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 H9C2 大鼠心肌細(xì)胞株的培養(yǎng)

H9C2 細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS 的高糖DMEM培養(yǎng)液、37 ℃、5% CO2、95% O2飽和濕度的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，棄去培養(yǎng)液，用PBS 緩沖液洗2～3 次后用含0.25%胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓時(shí)立刻停止消化，以1 000 r/min 離心5 min。棄上清液，用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基重懸后，并按1∶3 分瓶，隔天更換培養(yǎng)液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.2 模型的復(fù)制和藥物干預(yù)

將心肌細(xì)胞隨機(jī)分為以下8 組：對(duì)照組：心肌細(xì)胞正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型組：心肌細(xì)胞用低糖無(wú)血清培養(yǎng)基預(yù)孵育1 h 后，在含95% N2和5%CO2的培養(yǎng)箱中缺氧6 h，再在5% CO2和95%空氣飽和的培養(yǎng)箱復(fù)氧1 h 造成心肌缺血損傷模型組；藥物干預(yù)組：心肌細(xì)胞用低糖無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的藥物預(yù)孵育1 h 后，經(jīng)缺氧6 h-復(fù)氧1 h 處理后即為藥物干預(yù)組。其中，干預(yù)藥物包括SXT、黃芪、知母、柴胡、桔梗和升麻水提液（共6 組）。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 心肌細(xì)胞活力的測(cè)定

培養(yǎng)完成后，將對(duì)照組和模型組組以及藥物干預(yù)組中取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞接種于96 孔板，調(diào)整細(xì)胞的濃度使每孔有5×105個(gè)細(xì)胞，然后向每孔中加入20 μl MTT（5 mg/ml）工作液，孵育一段時(shí)間，后向每孔中加入150 μl DMSO，室溫條件先低速震蕩讓二者充分融合，然后參照MTT 比色法試劑盒說(shuō)明，在490 nm 測(cè)定各孔下的吸光值，分別記錄結(jié)果。模型組、各藥物干預(yù)組與對(duì)照組的比值為細(xì)胞活力相對(duì)值。

1.4.2 活性氧（ROS）含量的變化

培養(yǎng)完成后，分別收集所有組中懸浮細(xì)胞，在各組細(xì)胞中加入150 μl DCFH-DA 溶液，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min。每隔5 min 震蕩1 次，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞洗幾遍，最后用PBS 重懸。采用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 活性（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)525 nm）。

1.4.3 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化

培養(yǎng)結(jié)束后，用0.25%胰酶消化離心，分別將所有組中細(xì)胞用緩沖液PBS 沖洗，再與10 μmol/L鈣離子熒光探針Fura-3/AM（10）共同孵育60 min，然后用緩沖液沖洗2 次，最后用PBS 重懸。將制成的標(biāo)本置于倒置熒光顯微鏡下，用340 nm 紫外光激發(fā)獲得熒光圖像，經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)圖像處理后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出細(xì)胞內(nèi)鈣濃度。

1.4.4 AnnexinV-FITC/PI 雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡

培養(yǎng)完成的細(xì)胞用不含 EDTA 的胰酶消化，離心收集懸浮細(xì)胞，2 000 r/min 離心5 min，棄培養(yǎng)基；用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞；加入100 μl 結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，濃度約為 1 × 106/ml；然后在細(xì)胞懸浮液中加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻后于 4 ℃避光條件下孵育 15 min；再加入 5 μl PI 后輕輕混勻于 4 ℃ 避光條件下孵育5 min；添加PBS 至500 μl并輕輕震搖均勻，于60 min 內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

使用GraphPad Prism v5.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，組內(nèi)兩兩比較采用t-test，當(dāng)P＜ 0.05 時(shí)判定差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷后心肌細(xì)胞活力的影響

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)臨床給藥劑量及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在藥物試驗(yàn)濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 和320.0 μg/ml 的藥物浸膏時(shí)，研究全方及各單味藥對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞活力的影響。MTT 結(jié)果顯示：升陷湯、黃芪、知母、桔梗、升麻在20 μg/ml 時(shí)，細(xì)胞活力最佳，因此確定上述提取物濃度組均為20 μg/ml；由于20 μg/ml 柴胡提取物對(duì)心肌細(xì)胞有一定損傷，經(jīng)試驗(yàn)最終確定藥物濃度為0.3 μg/ml 時(shí)對(duì)缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞活力無(wú)明顯影響（表1）。

表1 升陷湯各單味藥對(duì)缺氧/復(fù)氧造成的心肌細(xì)胞活力的影響

2.2 藥物對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷后心肌細(xì)胞內(nèi)ROS 的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：心肌細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧條件下，細(xì)胞內(nèi)活性氧含量明顯增加，升高至對(duì)照組的2.49 倍（P＜0.01，圖1），表明缺氧/復(fù)氧引起細(xì)胞內(nèi)自由基損傷；給藥后，除柴胡外，升陷湯全方及各單味藥均能明顯降低心肌缺氧/復(fù)氧致心肌損傷模型的細(xì)胞內(nèi)ROS 的熒光強(qiáng)度，升陷湯全方、黃芪、知母、桔梗和升麻處理組分別為對(duì)照組的1.46、1.40、1.79、1.52 和1.83 倍（P＜0.01，圖1）。其中，升陷湯與黃芪作用最強(qiáng)，兩者無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 藥物對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷后心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響

圖1 藥物對(duì)心肌缺氧/復(fù)氧細(xì)胞凋亡的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：心肌細(xì)胞在常氧下（對(duì)照組），Ca2+熒光強(qiáng)度較低，缺氧/復(fù)氧后，Ca2+熒光強(qiáng)度增加（P＜0.01，圖2），表明心肌細(xì)胞低氧/復(fù)氧時(shí)存在Ca2+超載。升陷湯全方和黃芪、知母藥物干預(yù)后，各組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度與模型組相比，分別降低了15.20%、23.98%和15.79%（P＜0.05，圖2），表明其對(duì)低氧/復(fù)氧時(shí)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載有抑制作用。桔梗、升麻藥物處理后，上述值雖然有降低，但差異不明顯。

圖2 藥物對(duì)心肌缺氧/復(fù)氧細(xì)胞內(nèi)ROS 含量的影響

2.4 藥物對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷后心肌細(xì)胞凋亡的影響

采用Annexin V-FITC/Pl 雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藥物對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷后心肌細(xì)胞凋亡情況。從檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞在常氧下（對(duì)照組），細(xì)胞凋亡較低；缺氧/復(fù)氧后，細(xì)胞凋亡增加；給藥組中升陷湯全方、黃芪、桔?？梢越档图?xì)胞的凋亡率（P＜0.05，圖3）。

圖3 藥物對(duì)心肌缺氧/復(fù)氧細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

3 討論

心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷是模擬MIRI 的病理生理過(guò)程的經(jīng)典模型，心肌細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)缺血再灌注造成的組織細(xì)胞功能代謝發(fā)生障礙及結(jié)構(gòu)功能破壞加重，甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象[14]。Ca2+超載一直被認(rèn)為是心肌缺血再灌注的主要機(jī)制。缺血缺氧時(shí)，心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，線粒體膜的通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放；再灌注恢復(fù)使得心肌細(xì)胞重新攝取O2，產(chǎn)生大量的線粒體內(nèi)活性氧，進(jìn)一步增加線粒體胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度，線粒體的氧化磷酸化進(jìn)而受阻促使心肌細(xì)胞死亡[15-16]。另外，線粒體內(nèi)活性氧觸發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)并加重心肌細(xì)胞的凋亡和壞死[17-19]。由此可見(jiàn)，細(xì)胞內(nèi)ROS 活性和Ca2+濃度是MIRI 重要的檢測(cè)指標(biāo)[20-21]。

本課題組前期采用大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎急性心肌缺血致慢性心力衰竭模型，心肌組織病理學(xué)切片證實(shí)了升陷湯全方對(duì)心肌細(xì)胞損傷和炎癥發(fā)展起到有效的控制作用，通過(guò)藥理指標(biāo)測(cè)定結(jié)合代謝組學(xué)研究證實(shí)了升陷湯對(duì)心衰具有顯著的治療作用。升陷湯通過(guò)改善心肌細(xì)胞損傷，減少炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)左室射血功能，調(diào)節(jié)機(jī)體磷脂代謝和脂肪酸生物合成來(lái)發(fā)揮其保護(hù)心肌作用，從而治療慢性心力衰竭[22-23]。本課題組通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)從缺氧/復(fù)氧致心肌細(xì)胞損傷角度，基于心肌細(xì)胞活力角度考察并證實(shí)了升陷湯的保護(hù)作用，可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、降低細(xì)胞內(nèi)ROS 以及Ca2+的濃度實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)各單味藥也具有一定的保護(hù)作用，但弱于全方的保護(hù)功效，進(jìn)一步證實(shí)了全方治療“大氣下陷”的合理性。升陷湯全方是以黃芪補(bǔ)氣升陷為主藥，知母涼潤(rùn)制主藥之溫燥，柴胡、升麻助黃芪升陷之力，桔梗載藥力上達(dá)胸中，共奏升補(bǔ)大氣之效[24]。藥材柴胡提取液在本實(shí)驗(yàn)中尚未發(fā)現(xiàn)具有保護(hù)缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的作用，在一定程度上證實(shí)了其他藥味配伍的合理有效性。