青花菜總硫代葡萄糖苷提取工藝的優(yōu)化

賀霞　張子軒　張宇光　張文澤　白瑞　張靜

摘 要：以青花菜中青9號(hào)品種為試材，從滅酶處理、干燥處理和提取條件3個(gè)方面對(duì)青花菜花球中總硫代葡萄糖苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。運(yùn)用氯化鈀分光光度法，比較分析經(jīng)過(guò)不同處理后的青花菜花球總硫代葡萄糖苷含量，以期篩選出總硫苷提取的最佳工藝。結(jié)果表明，不同處理對(duì)青花菜花球中總硫代葡萄糖苷含量的影響有一定差異。加入100 ℃蒸餾水后80 ℃熱處理15 min的滅酶處理，70 ℃鼓風(fēng)干燥，乙醇濃度90%、料液比1∶9、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間30 min的提取條件下測(cè)得青花菜花球中總硫苷含量（b）最高，為414.98 μmol·g-1，此處理為青花菜花球中總硫苷提取最佳工藝。

關(guān)鍵詞：青花菜;總硫代葡萄糖苷;提取工藝;優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S635 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2021）04-062-06

Abstract： In this study， the extraction process of total glucosinolates from broccoli was optimized from three aspects： enzyme-inactivation， drying and grinding， and extraction condition， and the broccoli variety Zhongqing 9 hao was used as material in this study. In order to screen out the best extraction process of total glucosinolates， the total glucosinalates contents of broccoli with different treatments were compared and analyzed by palladium chloride-spectrophotometer. The results showed that the effects of different treatments on the total glucosinolates contents of brocolli were significantly different. Under the conditions of 100 ℃ distilled water， 80 ℃ heat treatment for 15 min， 70 ℃ air drying， 90% ethanol concentration， 1：9 ratio of solid to liquid， 60 ℃ extraction temperature and 30 min extraction time， the content of total glucosinolates in broccoli was the highest （414.98 μmol·g-1）， which was the best extraction process of total glucosinolates from broccoli.

Key words： Broccoli; Total glucosinolates; Extraction process; Optimization

青花菜（Brassica oleracea var. italica）又名綠花菜，是十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種的一個(gè)變種[1]。青花菜營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，主要含有蛋白質(zhì)、脂肪、膳食纖維、糖類、胡蘿卜素和維生素，并且含有豐富的礦物質(zhì)，被稱為高營(yíng)養(yǎng)蔬菜[2-3]。研究表明，青花菜中硫代葡萄糖苷含量豐富，雖然總含量在同科蔬菜中并不是最高，但具有明顯抗癌生物活性的蘿卜硫素含量很高[4-6]。

硫代葡萄糖苷（glucosinolate，GLs，簡(jiǎn)稱硫苷）是一種含硫的植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，在十字花科蔬菜中種類和含量最豐富，目前已發(fā)現(xiàn)120多種[7]。富含硫苷的食物具有特殊風(fēng)味和保健作用，這與硫苷的降解產(chǎn)物有關(guān)，其降解產(chǎn)物在抗菌抑蟲(chóng)、引發(fā)生物抗癌抑癌等方面具有重要的作用[6]。研究表明，當(dāng)植物中含有硫代葡萄糖苷的同時(shí)，也含有降解硫代葡萄糖苷的酶類，這種酶就是黑芥子酶[8]。當(dāng)植物器官被切碎或咀嚼時(shí)，硫代葡萄糖苷會(huì)與植物內(nèi)部的黑芥子酶發(fā)生酶解反應(yīng)，使硫代葡萄糖苷水解，從而產(chǎn)生異硫氰酸、腈等一些對(duì)人類有害的物質(zhì)[9]。此外當(dāng)外界環(huán)境有所改變時(shí)硫苷也會(huì)有一定的非降解反應(yīng)[10]。

目前已有的總硫苷含量檢驗(yàn)方法主要有BaSO4重量法、近紅外光譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法等[11-13]。本試驗(yàn)采用氯化鈀法對(duì)總硫苷含量進(jìn)行測(cè)量，該方法具有操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點(diǎn)，只要保證測(cè)量時(shí)所需的溫度時(shí)間等條件即可，其原理是鈀離子與硫代葡萄糖苷生成一種有色絡(luò)合物，再利用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行吸光值的測(cè)量[13]。

近幾年，對(duì)硫苷的研究多為對(duì)其單體結(jié)構(gòu)的鑒定分析，對(duì)提取工藝的研究較少[14]。不同研究者對(duì)青花菜硫苷提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，李寧[6]通過(guò)單因素試驗(yàn)得到西蘭花干硫苷的最佳提取工藝：90%乙醇作為提取劑，料液比1∶11，提取時(shí)間為1 h，重復(fù)提取4次，得到硫苷純度為15.22 mg·g-1;賈治勇等[15]通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，得到西蘭花莖中提取硫苷的最佳工藝條件為：乙醇濃度75%、料液比為1∶15、提取溫度為70 ℃、提取時(shí)間為30 min，在此條件下提取物中硫苷的提取質(zhì)量摩爾濃度為601.24 μmol·g-1;鄧艷美等[16]通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，得到青花菜干粉中提取硫苷的最佳條件為乙醇濃度75%、料液比為1∶7、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間為20 min，提取液中硫代葡萄糖苷質(zhì)量摩爾濃度達(dá)到33.71 μmol·g-1。不同研究者得到的結(jié)果不同，筆者通過(guò)對(duì)青花菜花球中總硫苷的提取工藝的研究，提高其利用率，尤其在抗癌抑癌方面，旨在為人類健康做一些貢獻(xiàn)，也為后續(xù)硫代葡萄糖苷的相關(guān)研究提供了一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料中青9號(hào)，種子購(gòu)自中蔬種業(yè)科技（北京）有限公司。

1.2 方法

供試材料于2018年7月1日浸種催芽，7月6日播種至50孔穴盤，8月10日左右定植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站試驗(yàn)田，株距為40 cm，行距50 cm，常規(guī)田間管理。10月上旬采收花球，隨機(jī)選取9個(gè)花球，3個(gè)花球混合為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，總共3個(gè)重復(fù)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 滅酶處理 每個(gè)生物學(xué)重復(fù)精確稱取15 g材料，將其放入試管中，加入100 ℃蒸餾水或75 ℃的95%乙醇，按照表1進(jìn)行微波處理或熱處理。

1.3.2 干燥處理 將滅酶處理后的試材紗布過(guò)濾，收集濾渣，包裹標(biāo)記好后采用以下3種干燥方式進(jìn)行干燥處理，微波處理每隔30 s稱重1次，烘干至重量恒重。鼓風(fēng)處理每隔30 min稱重1次，烘干至重量恒重。干燥后研缽研磨至細(xì)粉，100目過(guò)篩。3種干燥處理如下：

（1）微波干燥：低火（V-1）、中低火（V-2）、中火（V-3）、中高火（V-4）和高火（V-5）;

（2）鼓風(fēng)干燥：在烘箱中進(jìn)行，50 ℃（G-1）、60 ℃（G-2）、70 ℃（G-3）、80 ℃（G-4）、90 ℃（G-5）和100 ℃（G-6）;

（3）冷凍干燥：冷凍干燥機(jī)內(nèi)-50.4 ℃，干燥24 h（L-1）。

1.3.3 硫苷提取工藝最優(yōu)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)以前人研究結(jié)果為基礎(chǔ)，因素水平如下所述—A. 提取時(shí)間：4個(gè)水平，0、1、2、3分別代表15、30、45、60 min;B. 提取溫度：4個(gè)水平;0、1、2、3分別代表60、70、80、90 ℃;C. 料液比：4個(gè)水平，0、1、2、3分別代表1∶9、1∶12、1∶15、1∶18;D. 乙醇濃度（φ）：5個(gè)水平，0、1、2、3、4分別代表50%、60%、70%、80%、90%。若實(shí)施全部水平組合，則需安排320個(gè)水平組合，故采用最優(yōu)試驗(yàn)設(shè)計(jì)[17-18]。本試驗(yàn)選取D-最優(yōu)設(shè)計(jì)準(zhǔn)則，即以信息矩陣行列式最大為準(zhǔn)則。本試驗(yàn)列出25個(gè)水平組合（表2）是應(yīng)用SAS9.2軟件分析而獲得的，其選取效率為96%。故采用四因素最優(yōu)設(shè)計(jì)，探索適宜青花菜總硫代葡萄糖苷的提取工藝，用表2方式提取，每個(gè)方式各3次重復(fù)。

1.4 硫苷總量測(cè)定

每份材料經(jīng)過(guò)不同處理后，將濾液收集到10 mL帶塞玻璃試管中，用蒸餾水定容至10 mL，搖勻。移取上清液1 mL，并放入另一個(gè)試管中，再加入2 mL氯化鈀顯色液，搖勻，在室溫下靜置2 h。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作參照邱海榮[7]的方法。

1.4.1 吸光值測(cè)定 用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)540 nm下測(cè)定待測(cè)液的吸光值，將吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到硫苷含量。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 在20 mL燒杯中加入稱取準(zhǔn)確量0.039 7 g標(biāo)準(zhǔn)品2-丙烯基硫苷（分子質(zhì)量為397.46），然后加入適量蒸餾水進(jìn)行溶解，溶解后將該溶液用蒸餾水定容至20 mL，制得硫苷標(biāo)準(zhǔn)液。用移液槍分別取1、2、3、4、5 mL硫苷標(biāo)準(zhǔn)液于5個(gè)10 mL帶塞玻璃試管中，蒸餾水分別定容至10 mL。定容完畢后，采取與試驗(yàn)材料相同的步驟進(jìn)行吸光值的測(cè)定[7]。

圖1為標(biāo)準(zhǔn)品2-丙烯基硫苷制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程式：y =0.003 8x-0.002 4，R?=0.997 8。式中：y表示溶液在分光光度計(jì)中測(cè)定的吸光值;x表示硫苷含量。將上述待測(cè)溶液的吸光值代入即可求得所對(duì)應(yīng)的硫苷含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與圖表制作，用SAS（Statistics Analysis System）軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅酶處理對(duì)青花菜總硫苷含量的影響

由圖2可以看出，不同滅酶處理對(duì)青花菜總硫苷含量的影響不同。其中，100 ℃蒸餾水80 ℃熱處理15 min提取的青花菜總硫苷含量最高，75 ℃ 95%乙醇80 ℃熱處理15 min提取的青花菜總硫苷含量最低;100 ℃蒸餾水80 ℃熱處理3個(gè)不同處理時(shí)間下提取的青花菜總硫苷含量均顯著高于其他處理方式下提取的青花菜總硫苷含量;75 ℃ 95%乙醇80 ℃熱處理3個(gè)處理時(shí)間下提取的青花菜總硫苷含量均顯著低于其他處理。

2.1.1 不同處理試劑對(duì)青花菜總硫苷含量的影響 相同微波處理時(shí)間條件下加入不同試劑，青花菜總硫苷含量差異顯著。其中，微波處理30 s和60 s，100 ℃蒸餾水微波處理提取的硫苷含量均顯著高于75 ℃95%乙醇微波處理。微波處理時(shí)間為90 s時(shí)，75 ℃95%乙醇微波處理提取的總硫苷含量顯著高于100 ℃蒸餾水微波處理。

相同熱處理時(shí)間條件下加入不同試劑，青花菜總硫苷含量差異顯著。100 ℃蒸餾水處理所提取出的總硫苷含量均顯著高于75 ℃95%乙醇所有熱處理。由此可知，在熱處理?xiàng)l件下，使用100 ℃蒸餾水作為試劑提取效果更好。

2.1.2 不同處理方式對(duì)青花菜總硫苷含量的影響 加入100 ℃蒸餾水時(shí)，熱處理提取出的總硫苷含量顯著高于微波處理。加入100 ℃蒸餾水時(shí)，微波處理30 s和60 s提取的青花菜總硫苷含量差異不顯著;微波處理90 s提取的青花菜總硫苷含量則顯著低于30 s和60 s處理。加入100 ℃蒸餾水時(shí)，熱處理80 ℃ 15 、20 和25 min，青花菜總硫苷含量差異顯著，提取的總硫苷含量隨熱處理時(shí)間增加而呈現(xiàn)遞減態(tài)勢(shì)。

加入75 ℃95%乙醇，微波處理提取出的總硫苷含量顯著高于熱處理，兩種處理方式提取的總硫苷含量都隨處理時(shí)間增加呈現(xiàn)遞增態(tài)勢(shì)。微波處理90 s提取的青花菜總硫苷含量顯著高于30 s和60 s，熱處理不同時(shí)間提取的總硫苷含量差異不顯著。

2.2 不同干燥處理對(duì)青花菜總硫苷含量的影響

由圖3可以得出，不同干燥處理對(duì)青花菜花球總硫苷含量的影響不同。其中冷凍干燥處理青花菜花球測(cè)得的總硫苷含量最低;70 ℃鼓風(fēng)干燥處理青花菜花球測(cè)得的總硫苷含量最高;微波干燥處理梯度間差異相對(duì)于鼓風(fēng)干燥處理梯度間差異較大，微波干燥處理下測(cè)得青花菜總硫苷含量（b，后同）最大值和最小值相差34.92 μmol·g-1，而鼓風(fēng)干燥處理下測(cè)得青花菜總硫苷含量最大值和最小值相差30.48 μmol·g-1。

2.2.1 微波干燥處理對(duì)青花菜總硫苷含量的影響 在微波干燥處理中，微波中高火處理?xiàng)l件下青花菜總硫苷含量顯著高于其他火力處理;除微波中火處理外，微波低火處理?xiàng)l件下青花菜總硫苷含量顯著低于其他火力處理;微波低火與微波中火、微波中低火與微波中火、微波中低火與微波高火間均沒(méi)有顯著性差異。

2.2.2 鼓風(fēng)干燥處理對(duì)青花菜總硫苷含量的影響 在鼓風(fēng)干燥處理中，鼓風(fēng)干燥70 ℃顯著高于其他鼓風(fēng)干燥處理;除鼓風(fēng)干燥60 ℃外，鼓風(fēng)干燥50 ℃和鼓風(fēng)干燥100℃顯著低于其他鼓風(fēng)干燥處理;鼓風(fēng)干燥50 ℃、60 ℃和100 ℃沒(méi)有顯著性差異;鼓風(fēng)干燥60 ℃和鼓風(fēng)干燥80 ℃沒(méi)有顯著性差異;鼓風(fēng)干燥80 ℃和鼓風(fēng)干燥90 ℃沒(méi)有顯著性差異。

2.3 不同提取條件對(duì)青花菜總硫苷含量的影響

由表3可知，不同提取方式對(duì)青花菜總硫苷含量的影響不同。在乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度有差異時(shí)，青花菜中提取到的總硫苷含量也有差異。在25個(gè)處理中，在A1B0C0D4、A3B2C3D4、A0B0C3D3 處理下所提取出來(lái)的青花菜花球總硫苷含量分別為414.98、391.03、323.92 μmol·g-1，均顯著高于其他處理所提取出來(lái)的總硫苷含量。而在A0B3C2D0、A1B3C3D1、A2B3C3D0、A3B3C0D1處理下所提取出來(lái)的青花菜總硫苷的量均顯著低于其他處理，且提取出的總硫苷含量都低于在100 μmol·g-1，且這4組的溫度都為90 ℃，表明提取溫度90 ℃太高會(huì)影響硫苷含量的提取。乙醇濃度90%、料液比為1∶9、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間為30 min提取得到的總硫苷含量最高。

3 討論與結(jié)論

在最近幾年中，硫苷的提取鑒定引起了研究人員的極大興趣。在《青花菜抗癌原理被發(fā)現(xiàn)》[19]一文中，青花菜的抗癌功效被證實(shí)，越來(lái)越多的人開(kāi)始關(guān)注青花菜。沈蓮清等[20]通過(guò)對(duì)西蘭花種子中的硫苷進(jìn)行了提取，驗(yàn)證了蘿卜硫素對(duì)5種腫瘤細(xì)胞株均有顯著的體外增殖抑制活性。黑芥子酶是降解硫苷的主要酶源，因此成為了抗癌研究的新方向[19]，丁艷等[22]通過(guò)對(duì)油菜籽餅粕中硫苷的酶解條件優(yōu)化的研究，表明了黑芥子酶在不同條件下對(duì)硫苷的降解產(chǎn)物生成量存在差異。因此，想要在植物中提取高含量的硫苷，首先應(yīng)該進(jìn)行滅酶處理，以防硫苷酶解生成其他有害物質(zhì)。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，不同滅酶處理提取出的總硫苷含量存在差異，以100 ℃蒸餾水熱處理提取效果最好。其中，試劑不同，相同處理方式提取的總硫苷含量不同，100 ℃蒸餾水提取的硫苷含量比75 ℃95%乙醇提取的總硫苷含量要高;相同的試劑，不同的滅酶處理方式提取的總硫苷含量也不同，100 ℃蒸餾水熱處理提取硫苷含量顯著高于微波處理提取總硫苷含量，75 ℃95%乙醇微波處理提取的總硫苷含量要高于熱處理。

韓夢(mèng)凡[23]研究表明結(jié)球甘藍(lán)在干燥過(guò)程中顯著抑制硫苷成分的降解，減少了有害產(chǎn)物的生成量，表明干燥處理對(duì)硫苷含量的提取有影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，鼓風(fēng)干燥條件下，溫度為50 ℃、60 ℃時(shí)干燥較慢，時(shí)間略長(zhǎng)，使硫苷在干燥過(guò)程中發(fā)生降解，雖然80 ℃、90 ℃、100 ℃時(shí)青花菜花球水分散失較快，但高溫還會(huì)使硫苷發(fā)生降解，所以70 ℃時(shí)干燥處理效果最好。相對(duì)于鼓風(fēng)干燥而言，微波干燥迅速，時(shí)間短，并且受熱均勻，火力中高火時(shí)效果最好，但為了防止過(guò)度受熱使硫苷發(fā)生降解，需要在干燥過(guò)程中多次測(cè)量散失水分的質(zhì)量，可能導(dǎo)致所需火力不能一直保持，增加了干燥時(shí)間，使得硫苷發(fā)生了降解。

李寧[6]在西蘭花干硫苷的提取中，發(fā)現(xiàn)提取硫苷最佳的工藝條件為乙醇濃度為70%、料液比1∶10、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間為40 min;賈治勇等[15]在西蘭花莖中硫苷的提取工藝研究中發(fā)現(xiàn)提取硫苷的最佳的工藝條件為乙醇濃度75%、料液比1∶9、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間30 min;鄧艷美[16]在青花菜硫代葡萄糖苷的提取工藝中發(fā)現(xiàn)提取硫苷的最佳的工藝條件為乙醇濃度75%、料液比1∶7、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間30 min。本試驗(yàn)結(jié)果表明，提取硫苷的最佳的工藝條件為乙醇濃度90%、料液比1∶9、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間30 min，其中最佳提取時(shí)間和料液比與前人的研究基本保持一致，但乙醇濃度和提取溫度有所偏差。本試驗(yàn)最佳提取溫度為60 ℃，這與李寧[6]研究得出的隨著溫度的提高硫苷提取含量增加的結(jié)論有差異，可能與試驗(yàn)材料品種等因素有關(guān)。本試驗(yàn)提取最佳乙醇濃度為90%，這與賈治勇等[15]研究得出的隨著乙醇濃度增大硫苷提取量增大，但在75%達(dá)到最大值的結(jié)論有差異，可能是與測(cè)定的部位等因素有關(guān)。

綜上所述，加入100 ℃蒸餾水后80 ℃熱處理15 min滅酶處理，70 ℃鼓風(fēng)干燥，乙醇濃度90%、料液比1∶9、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間30 min的提取條件下測(cè)得青花菜花球中總硫代葡萄糖苷含量最高，為414.98 μmol·g-1，其為花青菜花球中總硫苷提取的最佳工藝。

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