馬鈴薯雙單倍體誘導(dǎo)及輔助育種研究進(jìn)展

白繼鵬　王洪洋　李燦輝

摘 要：馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是繼水稻、小麥、玉米之后全球第四大糧食作物。然而生產(chǎn)上種植的馬鈴薯多為四倍體普通栽培種，且由于其復(fù)雜的四體遺傳和高度雜合的基因組等因素，嚴(yán)重阻礙了馬鈴薯遺傳育種和品種改良的進(jìn)程。人工誘導(dǎo)方法尤其是孤雌生殖誘導(dǎo)產(chǎn)生馬鈴薯雙單倍體是解決上述問題的有效途徑。馬鈴薯雙單倍體不僅有助于普通栽培種馬鈴薯遺傳改良，而且還可以二體遺傳模式進(jìn)行農(nóng)藝性狀遺傳解析。概述了馬鈴薯雙單倍體的育種應(yīng)用、誘導(dǎo)方法、影響因素、鑒定方法等方面的研究進(jìn)展，同時(shí)探討了馬鈴薯雙單倍體誘導(dǎo)的研究方向。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯;孤雌生殖誘導(dǎo);雙單倍體，輔助育種

中圖分類號(hào)：S532 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2021）04-001-07

Abstract： Potato （Solanum tuberosum L.） is the world's fourth largest food crop after rice， wheat and maize. However， most of common potato cultivars were tetraploid. And the progress on potato genetic breeding and variety improvement was severely retarded due to its complex tetraploid inheritance and highly heterozygous genome. Artificial induction， especially parthenogenesis， is an effective way to solve the above problems. Potato dihaploid is not only helpful to the genetic improvement of common cultivar potato， but also will be used for the genetic analysis of agronomic traits. Here， we review the research progress on potato dihaploid breeding application， induction method， influencing factors， identification method， and discussed the research direction of potato dihaploid induction.

Key words： Potato; Parthenogenesis induction; Dihaploid; Assistant breeding

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）為茄科（Solanaceac）茄屬（Solanum）一年生草本植物，同水稻、玉米、小麥為世界四大糧食作物[1]。馬鈴薯因其抗逆性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、增產(chǎn)潛力巨大而廣泛種植，被很多國(guó)家當(dāng)作主糧食用[2-3]。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（http：//www.fao.org/faostat/zh/#search/potato）數(shù)據(jù)顯示，截止到2019年，中國(guó)馬鈴薯種植面積約為491.5萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量為9188余萬(wàn)t，均居世界首位。2015年1月，中國(guó)啟動(dòng)馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略，旨在推動(dòng)馬鈴薯消費(fèi)趨勢(shì)和食用方式的轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)國(guó)民消費(fèi)主食多樣化、營(yíng)養(yǎng)多元化[4-5]。

生產(chǎn)上種植的馬鈴薯多為四倍體普通栽培種，由于其復(fù)雜的四倍體遺傳和高度雜合的基因組等因素，嚴(yán)重阻礙了馬鈴薯遺傳育種和品種改良的進(jìn)程。同時(shí)又因?yàn)槿旧w倍性水平和胚乳平衡數(shù)不同造成的性障礙，導(dǎo)致四倍體栽培種與具有優(yōu)良性狀的二倍體野生種或原始栽培種間很難直接雜交或雜交后產(chǎn)生不育的三倍體等情況，從而無法直接利用其中的優(yōu)良基因[6-7]。通過誘導(dǎo)或花藥、花粉、子房等組織離體培養(yǎng)等方式獲得雙單倍體進(jìn)行育種，可有效解決上述問題。同時(shí)通過技術(shù)手段對(duì)獲得的具有優(yōu)良性狀的雙單倍體進(jìn)行染色體加倍處理，從而培育出滿足人類生產(chǎn)需求的四倍體栽培品種[8]，這對(duì)馬鈴薯種質(zhì)資源創(chuàng)新和品種改良具有極大的意義。筆者系統(tǒng)地闡述了馬鈴薯雙單倍體的產(chǎn)生方法、影響因素和鑒定方法，總結(jié)了目前植物尤其是農(nóng)作物領(lǐng)域誘導(dǎo)單倍體方法的一些研究進(jìn)展，并展望了馬鈴薯雙單倍體育種的發(fā)展趨勢(shì)。

1 馬鈴薯雙單倍體育種背景

1.1 雙單倍體的定義

植物單倍體，是指具有胚子染色體數(shù)目的孢子體。像馬鈴薯普通栽培種這樣的同源四倍體，產(chǎn)生的單倍體含有兩組同源染色體，故稱之為雙單倍體（Dihaploid，2n =2x = 24）;二倍體野生種或原始栽培種，包括雙單倍體產(chǎn)生的單倍體稱之為單單倍體（Monohaploid，n = x = 12） [9-10]。

1.2 雙單倍體育種的優(yōu)勢(shì)及相關(guān)研究進(jìn)展

1.2.1 雙單倍體育種的優(yōu)勢(shì) 利用單倍體進(jìn)行作物育種有著極大優(yōu)勢(shì)，傳統(tǒng)四倍體馬鈴薯雜交育種，因其遺傳復(fù)雜性難以獲得具備較多優(yōu)良性狀且能穩(wěn)定遺傳的品種，育種周期很長(zhǎng)，而通過雙單倍體育種，加之人工誘導(dǎo)染色體加倍處理，可以在相對(duì)短期內(nèi)就獲得純合四倍體，在篩選優(yōu)良性狀上更加容易、高效，極大地提高了育種效率[11]。

馬鈴薯雙單倍體與二倍體野生種相比，具有相同的染色體數(shù)目，遺傳行為十分相似，便于遺傳操作，可以直接與二倍體野生種雜交產(chǎn)生后代，彌補(bǔ)了四倍體與二倍體間雜交不親和或產(chǎn)生不育三倍體的缺陷，從而能充分挖掘利用野生種中如抗逆、抗病蟲害、高干物質(zhì)含量等優(yōu)良性狀基因，得到性狀優(yōu)異的理想后代[12-13]。

通過對(duì)雙單倍體進(jìn)行人工誘導(dǎo)染色體加倍后可得到純合四倍體，相互之間可以雜交，進(jìn)而通過雜交后代實(shí)生種子繁殖，有效解決馬鈴薯傳統(tǒng)栽培種植中繁殖系數(shù)低、貯運(yùn)不便、易攜帶病害和高成本等諸多問題。

利用獲得的馬鈴薯雙單倍體品系，可以簡(jiǎn)化其遺傳特征分析，結(jié)合分子標(biāo)記、基因編輯、基因克隆等分子手段，能快速?gòu)幕驅(qū)用鎸?duì)馬鈴薯的抗病蟲害性、抗逆性、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、欣賞價(jià)值等特征特性進(jìn)行精準(zhǔn)改造，實(shí)現(xiàn)分子設(shè)計(jì)育種。

1.2.2 馬鈴薯雙單倍體相關(guān)研究與利用 20世紀(jì)80年代起，國(guó)內(nèi)學(xué)者開始利用孤雌生殖誘導(dǎo)栽培種馬鈴薯，獲得了一系列雙單倍體材料，篩選出誘導(dǎo)率較高的母本材料和誘導(dǎo)系，為二倍體野生種優(yōu)良基因向四倍體栽培種的成功導(dǎo)入及馬鈴薯種質(zhì)資源創(chuàng)新奠定了基礎(chǔ)[14-18]。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院在80年代利用有性多倍化將二倍體野生種中抗病、淀粉含量高等優(yōu)良基因轉(zhuǎn)移到四倍體栽培種中，極大地豐富了育種材料并顯著縮短了育種周期[19]。20世紀(jì)末期，戴朝曦等[20]利用雙單倍體與南美二倍體栽培種、野生種雜交，結(jié)合染色體加倍技術(shù)，選育出具備高產(chǎn)、抗病、高淀粉含量等優(yōu)良性狀的甘農(nóng)薯2號(hào)等四倍體栽培種優(yōu)良品系;同時(shí)他們也通過雙單倍體花藥培養(yǎng)、兩次染色體加倍等技術(shù)手段獲得純合四倍體品系進(jìn)而獲得不分離的馬鈴薯實(shí)生種子，以解決傳統(tǒng)馬鈴薯栽培中存在的種薯貯運(yùn)不便、成本高等問題。近年來，趙明輝等[21]利用二倍體馬鈴薯材料的豐富遺傳變異性，在馬鈴薯耐鹽育種方面取得了重要進(jìn)展，若進(jìn)一步將雙單倍體材料與這些耐鹽品種雜交，可為選育出具有耐鹽優(yōu)良性狀的四倍體栽培種提供更多可能性。Jari等[22]通過花藥培養(yǎng)從四倍體栽培種馬鈴薯Pito中獲得了9個(gè)矮稈?cǎi)R鈴薯雙單倍體品系，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定了馬鈴薯矮稈由隱性基因pito所引起，并測(cè)定了赤霉素（GA）含量。由于赤霉素在馬鈴薯發(fā)芽和莖的伸長(zhǎng)中起著重要作用，因此該項(xiàng)建立在雙單倍體水平上的研究為馬鈴薯重要生理指標(biāo)的基因定位及分子設(shè)計(jì)育種奠定了一定基礎(chǔ)。在Manrique-Carpintero等[23]的研究中，通過構(gòu)建一個(gè)雌核發(fā)育的雙單倍體群體來了解栽培種馬鈴薯的遺傳景觀，試驗(yàn)結(jié)果表明與四倍體馬鈴薯遺傳負(fù)荷相關(guān)的潛在有害突變可以被多個(gè)基因位點(diǎn)緩解。

馬鈴薯雙單倍體除輔助普通栽培種馬鈴薯遺傳改良外，還可采用二體遺傳模式進(jìn)行抗病基因遺傳分析。EI-Kharbotly 等[24]利用孤雌生殖誘導(dǎo)獲得的含抗晚疫病基因Rpi-R1和Rpi-R3的雙單倍體材料，通過構(gòu)建抗、感分離群體并結(jié)合RFLP 分子標(biāo)記，成功將Rpi-R1定位在 5號(hào)染色體上，Rpi-R3定位在11號(hào)染色體末端。Bradshaw等[25]以孤雌生殖誘導(dǎo)獲得的馬鈴薯雙單倍體PDH247為母本（抗?。olanum phureja材料DB226（70）為父本（感?。?gòu)建回交群體，結(jié)合發(fā)病表型、AFLP 和 SSR 標(biāo)記對(duì)該群體120個(gè)子代及親本進(jìn)行分析，最后在4號(hào)染色體上定位到一個(gè)抗晚疫病 QTL。Velásquez等[26]對(duì)利用孤雌生殖誘導(dǎo)獲得的149個(gè)馬鈴薯雙單倍體株系進(jìn)行卷葉病毒抗病鑒定，通過對(duì)抗感病植物的分析在5號(hào)染色體上臂成功定位到一個(gè)抗卷葉病毒基因Rladg。Bartkiewicz等[27]通過孤雌生殖誘導(dǎo)四倍體馬鈴薯Karolin（抗癌腫?。┇@得 215個(gè)雙單倍體株系，并對(duì)其進(jìn)行癌腫病抗病鑒定，結(jié)合12.8 k SolCAP馬鈴薯SNP芯片和集群分離分析法對(duì)雙單倍體群體進(jìn)行遺傳分析，定位到一個(gè)抗病區(qū)間Xla-TNL，最終通過開發(fā)和加密分子標(biāo)記將抗癌腫病基因定位區(qū)間縮小至800 kbp。

綜上所述，利用雙單倍體尤其是孤雌生殖誘導(dǎo)產(chǎn)生雙單倍體在馬鈴薯品種改良、遺傳解析、重要基因定位等方面具有重要意義和巨大潛力。

2 馬鈴薯雙單倍體誘導(dǎo)產(chǎn)生的方法

在無人工干預(yù)的情況下植物自發(fā)形成單倍體的概率極低（0.002%～0.02%），遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足生產(chǎn)中的育種需求，因此需要采用人工誘導(dǎo)的方式來獲得單倍體[28]。目前人工誘導(dǎo)馬鈴薯雙單倍體的方法主要包括兩大類共四種：一是孤雌生殖誘導(dǎo)系誘導(dǎo)的孤雌生殖;二是植物單倍體組織離體培養(yǎng)，包括花藥培養(yǎng)、花粉培養(yǎng)和子房培養(yǎng)。

2.1 孤雌生殖誘導(dǎo)法

孤雌生殖，也稱為單性生殖，即雌配子體不經(jīng)過受精，在基因控制或其他外界刺激下而引起分裂直接發(fā)育成胚[29]。自然條件下植物發(fā)生孤雌生殖概率極低。孤雌生殖誘導(dǎo)是產(chǎn)生馬鈴薯雙單倍體的主要方式[30]，該法以基礎(chǔ)四倍體材料為母本、二倍體誘導(dǎo)系為父本，在四倍體材料生長(zhǎng)到一定時(shí)期后對(duì)花蕾去雄，用誘導(dǎo)系花粉進(jìn)行授粉，精子不使卵細(xì)胞受精，但刺激卵細(xì)胞分裂并發(fā)育，得到雙單倍體實(shí)生種子。

早在20世紀(jì)50年代，Hougas 和Peloquin [31]首次從四倍體品種 Katahdin與S. phureja 的雜交后代中得到了一株雙單倍體。雙單倍體的形成與四倍體受體和二倍體誘導(dǎo)系之間的相互作用有極大的關(guān)系，所以此后篩選優(yōu)良的受體親本和授粉者就成為了孤雌生殖誘導(dǎo)產(chǎn)生馬鈴薯雙單倍體的關(guān)鍵[32]。目前已經(jīng)得到的應(yīng)用于馬鈴薯雙單倍體研究的一些優(yōu)良授粉者包括P1225682.22、IVP35、IVP48、IVP101等[33-36]。目前來看，孤雌生殖誘導(dǎo)率仍較低，如何從大量的誘導(dǎo)雜交后代中鑒定挑選出雙單倍體也是一個(gè)亟需解決的問題[37]。

2.2 花藥培養(yǎng)法

花藥培養(yǎng)，也稱雄核發(fā)育，是獲得單倍體的重要方法之一，其基本過程就是通過花藥接種并誘導(dǎo)形成愈傷組織，最后發(fā)育成一株完整植株 [1]。

1973年Dunwell和Sunderland[38]首次利用馬鈴薯品種Pentland Crow進(jìn)行花藥離體培養(yǎng)，獲得馬鈴薯再生植株。在我國(guó)馬鈴薯花藥培養(yǎng)的研究可追溯到20世紀(jì)80年代戴朝曦[39]通過四倍體馬鈴薯花藥培養(yǎng)獲得愈傷組織分化形成61株苗，但未進(jìn)行倍性檢測(cè)。誘導(dǎo)率和成苗率較低是目前在馬鈴薯花藥培養(yǎng)中存在的主要問題。2014年賀苗苗[40]利用20個(gè)馬鈴薯品種花藥進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示不同品種的花藥在愈傷組織誘導(dǎo)率方面有著較為顯著的區(qū)別，存在基因依賴性，這與劉輝[41]的研究結(jié)果一致。趙欣[42]的研究指出，通過調(diào)整培養(yǎng)基中NAA和2，4-D等濃度配比、蔗糖濃度等成分，以及加入適宜濃度的硝酸銀、活性炭和馬鈴薯提取液，可以提高愈傷組織誘導(dǎo)率。

2.3 花粉培養(yǎng)法

花粉培養(yǎng)，也稱游離小孢子培養(yǎng)，其基本過程和花藥培養(yǎng)十分類似，是將花藥中的花粉分離培養(yǎng)，最終分化形成完整植株。20世紀(jì)60年代Guha等[43]就通過人工方式誘導(dǎo)曼陀羅產(chǎn)生了胚狀體并推測(cè)這些胚狀體起源于花粉或花藥。1988年報(bào)道了中國(guó)首例花藥離體培養(yǎng)獲得雙單倍體的試驗(yàn)，高秀云[44]利用接種花粉中取得的小孢子進(jìn)行培養(yǎng)，得到了3株雙單倍體。1990年左秋仙等[45]發(fā)現(xiàn)在分離馬鈴薯花粉前對(duì)花藥進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，可以顯著提升其產(chǎn)生愈傷組織的概率。2009年吳旺澤等[46]的研究表明，利用花粉培養(yǎng)獲得愈傷組織存在一定的基因依賴性。唐飛等[47]對(duì)二倍體馬鈴薯品種E172花粉萌發(fā)的具體條件作了研究分析，試驗(yàn)結(jié)論與吳旺澤等[46]的相符。

2.4 子房培養(yǎng)法

子房培養(yǎng)，主要是對(duì)未受精的子房而言，是將其置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得完整的植株。1964年，Tulecke[48]利用裸子植物銀杏的未受精子房進(jìn)行培養(yǎng)并得到單倍體植物愈傷組織。對(duì)于馬鈴薯，在1985年，陶自榮等[49]就報(bào)道了首例利用馬鈴薯未傳粉子房進(jìn)行離體培養(yǎng)獲得植株的研究，經(jīng)檢測(cè)所獲植株為雙單倍體。相比花藥培養(yǎng)，未受精子房更加容易形成愈傷組織 [1]。影響子房培養(yǎng)產(chǎn)生雙單倍體的因素包括子房的誘導(dǎo)分化能力和子房培養(yǎng)條件[50]。

3 影響馬鈴薯雙單倍體產(chǎn)生的因素

在產(chǎn)生馬鈴薯雙單倍體的幾種方法中，孤雌生殖誘導(dǎo)是目前研究最多、最有效的方法，因此以下主要對(duì)該法進(jìn)行論述。

3.1 母本材料影響馬鈴薯雙單倍體的產(chǎn)生

在進(jìn)行馬鈴薯孤雌生殖誘導(dǎo)時(shí)，選擇合適的母本材料可以提高誘導(dǎo)產(chǎn)生雙單倍體的概率。龐萬(wàn)福等[14]利用中薯2號(hào)、79-6-19和800935等3個(gè)四倍體母本材料與11個(gè)授粉者雜交，發(fā)現(xiàn)中薯2號(hào)的誘導(dǎo)率顯著高于其他兩個(gè)母本材料，說明母性效應(yīng)在馬鈴薯雙單倍體誘導(dǎo)中起著十分重要的作用。李先平等[17]用13個(gè)四倍體栽培種與9個(gè)授粉父本材料進(jìn)行雜交，通過統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)率、雙單倍體誘導(dǎo)率等數(shù)據(jù)，結(jié)果也顯示不同的母本材料誘導(dǎo)率差異十分明顯。

3.2 父本材料影響馬鈴薯雙單倍體的產(chǎn)生

選擇優(yōu)良的父本材料作為授粉者對(duì)植物孤雌生殖誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體來說也極為重要。胡爾良[51]和張強(qiáng)[52]研究玉米孤雌生殖誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體的結(jié)果表明，不同誘導(dǎo)系之間的單倍體誘導(dǎo)率差異極為顯著。同樣在馬鈴薯中，二倍體授粉者主要通過對(duì)胚乳的作用進(jìn)而影響雙單倍體的形成[53]。龐萬(wàn)福等[14]利用11個(gè)父本材料進(jìn)行了授粉實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示S. phureja后代中93002-1-4的誘導(dǎo)率達(dá)到了81.8%，而93002-4-4的誘導(dǎo)率僅有14.6%，作為對(duì)照的IVP35和IVP48誘導(dǎo)率僅為3.8%和4.0%。李先平等[17]通過實(shí)驗(yàn)篩選出了兩個(gè)優(yōu)良的二倍體父本授粉者，并通過對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析證明了授粉者的結(jié)實(shí)率與其誘導(dǎo)產(chǎn)生雙單倍體的誘導(dǎo)率之間并無關(guān)聯(lián)。Hermsen和Verdenius[36]通過研究認(rèn)為優(yōu)良的授粉者應(yīng)該具備以下特征：（1）花粉育性高，這能保證馬鈴薯的雜交結(jié)實(shí);（2）胚斑標(biāo)記基因純合，有利于從雜交產(chǎn)生的大量種子中篩選出雙單倍體種子以及后續(xù)植株，提高雙單倍體的選擇效率;（3）具有較高的雙單倍體誘導(dǎo)率。

3.3 母本、父本之間的互作對(duì)馬鈴薯雙單倍體產(chǎn)生的影響

Frandsen等[54]的試驗(yàn)表明，相同的父本誘導(dǎo)系材料誘導(dǎo)不同的母本材料時(shí)，其誘導(dǎo)率不同，Hermsen等[55]的研究顯示，相同的母本材料接受不同的父本誘導(dǎo)系花粉所產(chǎn)生雙單倍體概率也不同。這些研究表明，母本材料和父本誘導(dǎo)系授粉者之間存在一定互作進(jìn)而影響雙單倍體的產(chǎn)生。

3.4 環(huán)境因素影響馬鈴薯雙單倍體的產(chǎn)生

除了以上馬鈴薯本身的3個(gè)因素外，環(huán)境因素，如氣候、溫度等對(duì)雙單倍體的產(chǎn)生也有一定的影響。Liu等[56]分別在1989年秋、1990年春和1990秋對(duì)8個(gè)品種進(jìn)行孤雌生殖誘導(dǎo)，結(jié)果表明不同年份的同一季節(jié)、同一年份的不同季節(jié)之間氣候的差異，對(duì)誘導(dǎo)率產(chǎn)生了影響。同時(shí)，給母本材料授粉時(shí)的溫度、濕度也會(huì)對(duì)誘導(dǎo)率產(chǎn)生影響[53]。據(jù)金黎平等[57]的研究，晝溫21～24 ℃、夜溫13～16 ℃、濕度80%左右時(shí)進(jìn)行授粉誘導(dǎo)率最高。呂文河等[18]對(duì)室內(nèi)花枝水培技術(shù)進(jìn)行研究，結(jié)果表明該技術(shù)可以提高馬鈴薯植株坐果率，進(jìn)而提高誘導(dǎo)效果。

4 馬鈴薯雙單倍體的鑒定方法

4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

細(xì)胞內(nèi)染色體倍性降低，會(huì)使植物細(xì)胞和植株的各器官相應(yīng)減小，所以可根據(jù)馬鈴薯植株形態(tài)及莖、葉、花等器官在各倍性之間的差異來進(jìn)行倍性鑒定。一般來說，雙單倍體植株較四倍體植株長(zhǎng)勢(shì)普遍較弱、葉片較小、所結(jié)薯塊較小。利用形態(tài)學(xué)鑒定方法判斷馬鈴薯二倍體植株是最簡(jiǎn)單直觀的方式，但受種薯質(zhì)量、種植環(huán)境、病蟲害、個(gè)人主觀經(jīng)驗(yàn)意識(shí)等影響較大，且馬鈴薯各品種的長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)不一致，因此也存在一定的判斷難度。

4.2 流式細(xì)胞儀鑒定

流式細(xì)胞儀，或稱倍性分析儀，可以定量測(cè)定細(xì)胞中DNA、RNA等分子的質(zhì)量。隨著細(xì)胞倍性的增加，各指標(biāo)也會(huì)呈倍性增加，故可用該儀器來進(jìn)行馬鈴薯植株倍性的鑒定。通過該法進(jìn)行倍性鑒定，一般幾分鐘就可得到結(jié)果，快速、簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確率高，缺點(diǎn)是儀器較為昂貴，實(shí)驗(yàn)室裝備率低。

4.3 花粉粒大小鑒定

四倍體栽培種馬鈴薯所產(chǎn)生的花粉粒中含有兩組同源染色體，雙單倍體馬鈴薯產(chǎn)生的花粉粒中僅含有一組染色體，前者比后者多了一倍的染色體，原生質(zhì)也相對(duì)比較豐富，故四倍體植株花粉粒比雙單倍體植株花粉粒體積更大，通過對(duì)花粉粒的鏡檢可以對(duì)其倍性進(jìn)行鑒定。

4.4 全基因組單核苷酸多態(tài)性（SNPs）基因分型鑒定

2018年Ellis等[58]使用了SNP基因分型方法對(duì)國(guó)際馬鈴薯中心基因庫(kù)的倍性水平進(jìn)行分類，確認(rèn)材料的遺傳同一性并評(píng)價(jià)馬鈴薯種質(zhì)的遺傳多樣性。2019年Alsahlany等[59]使用SNP基因分型來鑒定馬鈴薯倍性，結(jié)果表明，SNP基因分型鑒定、流式細(xì)胞儀鑒定和下文要介紹的葉綠體計(jì)數(shù)方法對(duì)其所鑒定的材料來說效果是一致的。

4.5 保衛(wèi)細(xì)胞大小、保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)目及單位面積氣孔數(shù)鑒定

植物的葉片中保衛(wèi)細(xì)胞大小、氣孔大小、保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)目和單位面積氣孔數(shù)與染色體倍性有關(guān)[60]，所以可通過檢測(cè)比較不同倍性馬鈴薯品種之間上述指標(biāo)的差異進(jìn)行倍性鑒定。Ellis等 [58]試驗(yàn)表明，通過葉綠體計(jì)數(shù)是區(qū)分二倍體、四倍體馬鈴薯的一種有效而廉價(jià)的方式。

4.6 胚斑標(biāo)記鑒定

誘導(dǎo)系中一般含有顯性純合胚斑標(biāo)記基因（BB），后代雜種四倍體或三倍體種子的胚基部會(huì)呈現(xiàn)深紫色，無胚斑標(biāo)記的種子為雙單倍體，故可據(jù)此篩選出雙單倍體種子。但遺傳背景不同和劑量效應(yīng)也給胚斑標(biāo)記的識(shí)別帶來一定難度[61] ，因此僅可用來剔除一部分雜種。此外誘導(dǎo)系的紫色胚軸標(biāo)記基因會(huì)使后代植物上胚軸等部位產(chǎn)生紫色色素積累，也可據(jù)此剔除一部分雜株[14]。

4.7 細(xì)胞染色體壓片觀察法鑒定

細(xì)胞染色體壓片觀察法，直接通過顯微鏡對(duì)細(xì)胞染色體觀察計(jì)數(shù)，對(duì)于倍性鑒定來說最為準(zhǔn)確。該法通常是取馬鈴薯匍匐莖尖或根尖材料進(jìn)行預(yù)處理、固定、解離、染色，最后進(jìn)行鏡檢計(jì)數(shù)。但該法實(shí)際操作起來對(duì)實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)要求較高，制片過程容易受到多種因素影響，要想獲得一張能夠?qū)θ旧w進(jìn)行清晰準(zhǔn)確計(jì)數(shù)的壓片，需要對(duì)試驗(yàn)流程進(jìn)行大量摸索。

5 其他植物單倍體誘導(dǎo)研究進(jìn)展及啟示

在孤雌生殖誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體的過程中，父本誘導(dǎo)系的選擇是單倍體保證誘導(dǎo)率的關(guān)鍵。董昕[62]在對(duì)玉米的單倍體誘導(dǎo)QTL qhir1中作了精細(xì)定位，明確指出誘導(dǎo)系是否攜帶該基因是誘導(dǎo)率高低的關(guān)鍵;同時(shí)通過該基因開發(fā)了相應(yīng)的分子輔助標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)玉米單倍體誘導(dǎo)系的高效選育。2019年ZHONG等[63]克隆了玉米單倍體誘導(dǎo)中的另一個(gè)關(guān)鍵QTL qhir8，并指出突變qhir8中的ZmDMP基因能夠增強(qiáng)玉米單倍體的誘導(dǎo)率。馬鈴薯由于其同源四倍體的遺傳復(fù)雜性，要實(shí)現(xiàn)類似誘導(dǎo)基因的定位存在一定難度，但也可通過目前已獲得的孤雌生殖誘導(dǎo)雙單倍體材料進(jìn)行探索。

陳琦[64]的研究表明，單倍體玉米愈傷組織細(xì)胞壁厚度大于二倍體，這可對(duì)馬鈴薯進(jìn)行探索，從而開拓其新的雙單倍體鑒定方式。

目前已有諸多植物孤雌生殖誘導(dǎo)機(jī)制方面的研究。山東大學(xué)GAO等[65]以棉花為試驗(yàn)對(duì)象，采用RNA干擾技術(shù)和體外噴施抑制劑CYC的方法來模擬誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體的過程。該研究表明，無論是通過RNA干擾技術(shù)或是用化學(xué)抑制劑在體外抑制組蛋白CenH3的表達(dá)，都可產(chǎn)生大量有缺陷的空核小孢子，這種假雄配子可通過與正常雌配子結(jié)合，以模擬有性生殖的形式產(chǎn)生植物單倍體。在此之前Amundson等[66]對(duì)167個(gè)雙單倍體馬鈴薯基因組進(jìn)行分析，結(jié)果表明孤雌生殖誘導(dǎo)產(chǎn)生的大多數(shù)雙單倍體不存在誘導(dǎo)系DNA。

隨著基因編輯技術(shù)CRISPR在植物領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，越來越多的作物可以通過該技術(shù)來產(chǎn)生單倍體，如董樂[67]通過該技術(shù)對(duì)玉米ZmMTL/ZmPLA1基因的定點(diǎn)敲除，獲得了具備較高效率的單倍體誘導(dǎo)系，從而提高了玉米單倍體誘導(dǎo)效率。2020年LIU等[68]報(bào)道了通過基因編輯CRISPR技術(shù)敲除小麥體內(nèi)與玉米MTL/ZmPLAT/NLD基因同源的TaPLA基因，誘導(dǎo)其產(chǎn)生單倍體，并分析了可以提高誘導(dǎo)率的一些方法。該項(xiàng)研究表明在多倍體中通過基因編輯的手段來實(shí)現(xiàn)植物的單倍體誘導(dǎo)是可行的，且由于基因序列和功能的保守性，該法也可以推廣到如馬鈴薯等其他作物上。但在該報(bào)道中，小麥的單倍體誘導(dǎo)率為5.88%～15.66%，與傳統(tǒng)的誘導(dǎo)方式相比，誘導(dǎo)率提升并不顯著。組蛋白CenH3在真核細(xì)胞著絲粒上起著較為重要的作用，使用包括CRISPR技術(shù)、EMS誘導(dǎo)等方式對(duì)其進(jìn)行修飾、編輯也能誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體，同時(shí)改變CenH3的2個(gè)氨基酸組合可以提高單倍體誘導(dǎo)率[69-70]。

6 總結(jié)與展望

隨著馬鈴薯主糧化的推廣，未來市場(chǎng)對(duì)馬鈴薯的需求逐漸擴(kuò)大，馬鈴薯的種植面積將再創(chuàng)新高。然而如何根據(jù)市場(chǎng)需求和種植條件選育理想的馬鈴薯品種，仍是一個(gè)亟待解決的問題。傳統(tǒng)的馬鈴薯栽培種為同源四倍體，存在著很多不足，而通過一些技術(shù)手段獲得馬鈴薯雙單倍體，無論是對(duì)種質(zhì)資源創(chuàng)新、提高育種效率，還是對(duì)解析馬鈴薯遺傳規(guī)律，都是極有價(jià)值的。

對(duì)馬鈴薯孤雌生殖誘導(dǎo)分子機(jī)制的探究是馬鈴薯雙單倍體育種的關(guān)鍵。在獲取馬鈴薯雙單倍體的方法中，孤雌生殖誘導(dǎo)是目前來看最具潛力的誘導(dǎo)方式，但因其誘導(dǎo)分子機(jī)制尚不明確，所以該方式往往存在隨機(jī)性和盲目性，加之其低誘導(dǎo)率、難以從大量誘導(dǎo)出的雜種中快速準(zhǔn)確地對(duì)雙單倍體進(jìn)行有效鑒定，因此嚴(yán)重阻礙該法在育種上的有效應(yīng)用。目前其他植物如棉花也有對(duì)其孤雌生殖誘導(dǎo)機(jī)制研究的報(bào)道，這對(duì)探究馬鈴薯孤雌生殖誘導(dǎo)機(jī)制有一定的借鑒作用。

同時(shí)，也不能忽略其他方法。CRISPR等技術(shù)打破了細(xì)胞壁的壁壘，將基因編輯手段應(yīng)用于植物細(xì)胞，并在小麥等多倍體作物上得以成功誘導(dǎo)單倍體產(chǎn)生，這為同源四倍體的馬鈴薯單倍體誘導(dǎo)指明了一個(gè)新的研究方向。但目前CRISPR基因編輯誘導(dǎo)率仍有待提高。如何找到誘導(dǎo)單倍體產(chǎn)生的關(guān)鍵基因、不斷摸索提高誘導(dǎo)率的方法、探究最適宜的誘導(dǎo)條件以產(chǎn)生更多能用于農(nóng)業(yè)育種的雙單倍體應(yīng)該是下一步的研究重點(diǎn)。如何高效獲得馬鈴薯雙單倍體，是縮短馬鈴薯育種周期、提高效率、創(chuàng)新種質(zhì)資源，以及輔助解析四倍體栽培種馬鈴薯優(yōu)良性狀調(diào)控機(jī)制的又一發(fā)展方向。

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