山東地區(qū)甜瓜白粉病生理小種的鑒定

莫龍飛　孫建磊　高超　董玉梅　王崇啟　肖守華　吳春燕　焦自高

摘 要：為明確山東地區(qū)甜瓜白粉病病原菌的種類及其生理小種，于2019年夏季在山東省濟南、莘縣、壽光、寒亭、昌樂、東明縣等6個甜瓜主要產(chǎn)區(qū)采集了10份白粉病病原菌進(jìn)行調(diào)查，采用國際通用的13個甜瓜白粉病生理小種的鑒別寄主對山東地區(qū)甜瓜白粉病病原菌的種類及生理小種進(jìn)行鑒定。根據(jù)鑒別寄主抗感反應(yīng)的表現(xiàn)及光學(xué)顯微鏡觀察，確定了導(dǎo)致山東地區(qū)甜瓜白粉病的生理小種均為單囊殼屬白粉菌1號生理小種。試驗結(jié)果不僅初步明確了山東地區(qū)甜瓜白粉病病原菌的種類及其生理小種類型，也為甜瓜白粉病的抗病育種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甜瓜;山東;白粉病;生理小種

中圖分類號：S652 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）04-036-05

Abstract： To clarify the pathogen and physiological races of melon powdery mildew in Shandong province， 10 samples of powdery mildew pathogen were collected from 6 major melon producing areas in Jinan， Shenxian， Shouguang， Hanting， Changle and Dongming counties on the summer of 2019. The species and physiological races of melon powdery mildew pathogen in Shandong province were identified by using manifestation of antisensory reaction of the 13 internationally acknowledged hosts and optical microscope observation. The results showed that all the physiological species causing powdery mildew disease of melon in Shandong area were Sphacrotheca fuliginea races 1. Our results not only preliminarily defined the types and physiological races of the pathogen of melon powdery mildew in Shandong province， but also laid a foundation for the disease resistance breeding of melon.

Key words： Melon; Shandong; Powdery mildew; Physiological race

甜瓜（Cucumis melo L.）屬葫蘆科一年生二倍體植物，在我國已有2000多年的栽培歷史。其果實香脆清甜、風(fēng)味獨特、營養(yǎng)物質(zhì)豐富，是一種世界范圍內(nèi)廣泛種植的經(jīng)濟作物。然而，目前甜瓜主栽品種在生產(chǎn)中極易受到各種病原菌的侵害，尤其是白粉病病害最為嚴(yán)重且分布范圍廣，已成為世界性甜瓜主要病害，是甜瓜綠色生產(chǎn)的主要障礙[1-2]。白粉病菌主要危害部位是甜瓜植株的葉片，該病原菌在與甜瓜發(fā)生親和反應(yīng)后，通過形成吸器獲取寄主的養(yǎng)分，從而使侵染部位失綠干枯，進(jìn)而影響葉片的光合同化作用，同時也危害莖和果實的生長發(fā)育，嚴(yán)重降低甜瓜果實品質(zhì)和產(chǎn)量，造成重大經(jīng)濟損失[3-5]。因此，防治甜瓜抗白粉病是目前甜瓜產(chǎn)業(yè)亟待解決的重要問題。盡管白粉病可以采用化學(xué)方法防治，但是盲目使用不僅達(dá)不到防治效果且難以保證甜瓜無公害生產(chǎn)，容易對環(huán)境造成污染?，F(xiàn)在抗病育種是解決甜瓜白粉病最有效也是最快速的方法，而鑒定生理小種類型并篩選出抗源是抗病育種中的關(guān)鍵步驟，只有充分了解當(dāng)?shù)靥鸸习追鄄〔≡捌渖硇》N，才可以“對癥下藥”，達(dá)到最佳的防治效果，走上高效、高產(chǎn)、資源節(jié)約的農(nóng)業(yè)發(fā)展之路。

甜瓜白粉菌的生理小種在不同地區(qū)類型數(shù)量多，演替快，已有研究表明甜瓜白粉病主要是由單囊殼白粉菌（Sphaerotheca fuliginea）和二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum）引起的。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)11個單囊殼白粉菌生理小種，分別是0、1、2（包括美國生理小種2US，以及法國的生理小種2Fr）、3、4、5和N1、N2、N3、N4;而二孢白粉菌有2個生理小種分別為0和1[6]。白粉病的發(fā)病范圍遍布于全球，不同國家和地區(qū)白粉病生理小種有所不同，在蘇丹[7]和法國[8]單囊殼白粉菌和二孢白粉菌均有發(fā)現(xiàn)，而在美國[9]、伊朗[10]和日本[11]只發(fā)現(xiàn)了單囊殼白粉菌。我國學(xué)者已對中國甜瓜主要生產(chǎn)區(qū)的白粉病菌生理小種作了初步鑒定，在研究中發(fā)現(xiàn)新疆[12]、吉林[13]、三亞[14]、上海[15]等部分地區(qū)生理小種為單囊殼屬白粉菌1和2Fr;在甘肅鑒定出生理小種為單囊殼屬白粉菌1和2Fr，但是在靖遠(yuǎn)縣首次鑒定出新的生理小種7[16]，蘇瑞等[17]研究中初步確定了新疆北疆地區(qū)白粉病菌主要為單囊殼屬白粉菌生理小種1，而南疆地區(qū)白粉病菌為單囊殼屬白粉菌生理小種5。

隨著山東省設(shè)施農(nóng)業(yè)發(fā)展越來越完善，甜瓜的產(chǎn)量也逐年增加，使得甜瓜白粉病病害越來越嚴(yán)重。目前，尚未見到關(guān)于山東省甜瓜白粉病菌生理小種的報道。本試驗通過在山東省甜瓜主產(chǎn)區(qū)采集白粉病病原菌，并對病原菌進(jìn)行生理小種鑒定。首先通過顯微鏡觀察法來初步確認(rèn)甜瓜白粉病菌的病原種，再利用國際通用的13份白粉病生理小種的鑒別寄主對白粉病菌進(jìn)行接種鑒定，來確定山東白粉病菌和生理小種的種類，為篩選和培育抗白粉病優(yōu)良甜瓜品種提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

國際上公認(rèn)的白粉病生理小種鑒別寄主包括Iran H、Vedrantais、Topmark、PMR 5、PMR45、WMR 29、PI 124111、PI 124112、PI 414723、Edisto47、MR 1、PMR 6、Nantais Oblong，鑒別寄主材料由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所國家西瓜甜瓜中期庫提供。所有寄主材料在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自交擴繁，通過接種之后鑒別寄主的抗感反應(yīng)，確定山東省甜瓜白粉病菌的生理小種類型（表1），如果試驗材料的白粉病菌在侵染鑒別寄主Nantais Oblong上也表現(xiàn)為感病，可以證明所采取的白粉病病菌不是二孢白粉菌，都是單囊殼白粉菌[18];而區(qū)別單囊殼白粉菌小種1和2的方法是觀察PMR45是否發(fā)病，PMR45表現(xiàn)為抗病證明甜瓜白粉菌是生理小種1，而感病說明是生理小種2[19]。

1.2 白粉病菌鑒定方法

1.2.1 白粉病葉的采集 2019年夏季在甜瓜果實成熟期，分別從山東省甜瓜主要產(chǎn)區(qū)濟南、莘縣、壽光、寒亭、昌樂、東明縣的大棚內(nèi)分別隨機采集充分發(fā)病的白粉病病葉10份，把采來的病葉分別裝入袋中做好標(biāo)記后帶回實驗室進(jìn)行4 ℃保存。

1.2.2 顯微鏡觀察白粉病菌 用干凈的毛筆把葉片上的白粉輕輕且均勻地涂于載玻片上，輕輕地壓好蓋玻片，加上1滴3% KOH溶液于載玻片上，在10×40倍率的顯微鏡下仔細(xì)觀察視野下的分生孢子上是否含有纖維體。分生孢子中能觀察到有纖維體的為單囊殼白粉菌，否則為二孢白粉菌[20]。

1.2.3 孢子懸浮液的制備 挑選采集的感病嚴(yán)重的白粉病葉片，用無菌水沖洗掉其上的雜質(zhì)，用干凈的刷子將病葉上的濃厚孢子輕輕刷入裝有無菌水的燒杯中，同時加入1滴吐溫20，用力攪拌使燒杯中的一團(tuán)團(tuán)孢子充分散開[11]。將13個病原生理小種鑒別寄主材料在人工培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)種植，播種于50孔穴盤，3次重復(fù)。鑒定所用苗放置于長3 m、寬1 m的架內(nèi)，保持白天29 ℃左右，夜晚20 ℃左右，并在培養(yǎng)室放入加濕器，以保證鑒別寄主生活在高濕度培養(yǎng)環(huán)境中，當(dāng)植株生長至2葉1心時，采用孢子粉噴霧法人工接種白粉菌，使鑒別寄主發(fā)病并觀察發(fā)病情況，作好記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜白粉病病原菌無性階段形態(tài)鑒定

把從濟南、莘縣、壽光、寒亭、昌樂、東明縣等地采集來的新鮮病原菌分別通過顯微觀察，觀察到白粉病菌態(tài)特征為：在視野下分生孢子為橢圓形無分支無色，有大概3個分生隔膜，可以在觀察中發(fā)現(xiàn)較為明顯的纖維狀體（圖2），試驗結(jié)果初步明確葉片上的白粉病菌為單囊殼白粉菌。

2.2 病情調(diào)查結(jié)果

接種15 d后在植株充分發(fā)病后開始調(diào)查鑒別寄主抗感反應(yīng)，取每株植株從下至上5片真葉分別進(jìn)行觀察記錄與拍照留存。根據(jù)病斑分布情況將葉片的發(fā)病情況分為6級，見圖1。0級：整株沒有病癥;1級：子葉有很少量不明顯白粉;2級：子葉有較多清晰白粉，莖上有很少量白粉;3級：子葉有很多濃厚且連片白粉，莖上有少量白粉;4級：子葉和莖上布滿濃厚白粉;5級：植株死亡。病情指數(shù)=Σ（病級×該病級株數(shù)）/（高病級×調(diào)查總株數(shù)）×100。病情指數(shù)≤45 為抗（R）;45<病情指數(shù)≤100 為感（S）[20]，發(fā)病調(diào)查結(jié)果見表 2。

2.3 甜瓜白粉病生理小種的鑒別

人工接種后的第7天葉片出現(xiàn)小白粉病斑，接種后的第12天大部分葉片布滿白粉病斑，當(dāng)充分發(fā)病達(dá)到3～4級水平時，開始統(tǒng)計鑒別寄主白粉病的發(fā)病程度。從表3可以看到，在山東省6個地區(qū)采取的白粉病菌均能使鑒別寄主Iran H、Vedrantais、Topmark、Nantais Oblong表現(xiàn)為感病，PMR 5、 PMR 45、WMR 29、MR 1和PMR 6均沒有感病現(xiàn)象，全部表現(xiàn)為抗病。在初步確定試驗材料白粉病菌都是單囊殼白粉菌后，進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)試驗中Nantais Oblong也表現(xiàn)為感病，所以可以說明所采取的白粉病病菌也不是二孢白粉菌，可以進(jìn)一步驗證試驗的白粉病菌都是單囊殼白粉菌;而區(qū)別單囊殼白粉菌的小種1和2的方法是觀察PMR45是否發(fā)病，PMR45表現(xiàn)為抗病，證明甜瓜白粉菌是生理小種1，而感病則說明是生理小種2。經(jīng)過參照甜瓜白粉病菌生理小種的鑒別寄主抗感反應(yīng)來最后嚴(yán)謹(jǐn)?shù)卮_定山東省甜瓜白粉病的生理小種為單囊殼白粉菌的生理小種1。

3 討論與結(jié)論

雖然最近幾年在鑒定白粉病生理小種方面的研究取得一些進(jìn)展，但是中國面積遼闊，氣候類型也十分復(fù)雜，還有多樣化的品種和栽培模式，所以為了更加全面和仔細(xì)了解我國甜瓜白粉病的生理小種的分布，還需要一定的時間和研究過程[21]。目前由于生產(chǎn)條件及氣象環(huán)境等因素每年都在不停的變化，雖然在國際上有統(tǒng)一的鑒別寄主來鑒定生理小種，但是感病后病情分級標(biāo)準(zhǔn)仍不統(tǒng)一，在鑒別葉片發(fā)病過程中大大影響了鑒定結(jié)果的可靠性[22]，因此也不能完全排除存在其他生理小種的可能性。甜瓜白粉病的生理小種種類多樣，分化速度快，在美國東南部甜瓜的單囊殼白粉病菌由生理小種2向生理小種1發(fā)生演替[23]，甚至在日本、西班牙等全球范圍內(nèi)也發(fā)現(xiàn)生理小種的快速演替的問題[24]。這種演替現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是生理小種對抗性產(chǎn)生適應(yīng)性、接種時間不一致或者鑒別寄主接種后環(huán)境差異影響了寄主的抗感反應(yīng)，導(dǎo)致最后鑒定結(jié)果存在不準(zhǔn)確性。目前美國和法國等國家有規(guī)定的農(nóng)業(yè)試驗站，可以長時間而且較大范圍地對白粉病的生理小種進(jìn)行檢測和指導(dǎo)[25]，不過與國外的進(jìn)展相比我國在這方面的研究開始時間較晚，在鑒定甜瓜白粉病菌的生理小種、抗源的鑒定和篩選等方面，需要尋找到一種省時省力而且結(jié)果精準(zhǔn)的接種方法。

筆者在山東省6個甜瓜主產(chǎn)區(qū)采集白粉病病原菌，基本可以代表山東省甜瓜種植區(qū)域多發(fā)白粉病的相關(guān)研究需求，并對病原菌進(jìn)行生理小種鑒定。首先通過顯微鏡觀察初步鑒定了造成山東省甜瓜白粉病的白粉菌為單囊殼屬白粉菌，再利用國際通用的甜瓜白粉病生理小種鑒別寄主來確定山東白粉病菌為單囊殼屬白粉菌1號生理小種，鑒定結(jié)果與全國其他地區(qū)的病原種基本一致，可為篩選和培育抗白粉病優(yōu)良甜瓜品種提供幫助。綜上所述，山東省甜瓜白粉病的白粉菌主要是單囊殼白粉菌中的生理小種1。

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