自噬相關(guān)蛋白在膿毒癥并發(fā)急性呼吸窘迫綜合征患者中的水平變化及臨床意義

何子純 張佳怡

重慶市紅十字會醫(yī)院（江北區(qū)人民醫(yī)院）呼吸內(nèi)科（重慶400020）

膿毒癥是患者對嚴(yán)重感染反應(yīng)失調(diào)引起的器官功能障礙綜合征，發(fā)病率為38～100/10 萬，病死率為22% ～55%［1］。由于膿毒癥患者全身處于炎癥激活狀態(tài)，其中1/3 的患者可能發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）［2］。盡管近年來在重癥監(jiān)護(hù)及膿毒癥合并ARDS 的基礎(chǔ)與臨床相關(guān)研究方面，取得了一定進(jìn)展，但患者病死率仍較高，其主要原因與膿毒癥并發(fā)ARDS 患者早期診斷率及病情變化評估不足有關(guān)。近年來研究顯示，細(xì)胞自噬參與了調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)，在生理?xiàng)l件下，機(jī)體自噬處于動態(tài)平衡狀態(tài)，對于維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)揮了重要調(diào)控作用［3］。在器官功能損傷或障礙中，如慢性阻塞性肺疾病、糖尿病腎病患者，其自噬水平顯著降低，與患者體內(nèi)炎癥水平呈顯著負(fù)相關(guān)［4-5］。對于膿毒癥并發(fā)ARDS 患者體內(nèi)自噬水平如何，目前相關(guān)研究較少。因此，本研究旨在觀察自噬相關(guān)蛋白在膿毒癥并發(fā)ARDS 患者體內(nèi)水平變化，探討自噬在該類疾病炎癥反應(yīng)中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料以重慶市紅十字會醫(yī)院呼吸內(nèi)科及重癥醫(yī)學(xué)科（2017年1月至2020年8月）就診的膿毒癥患者235 例為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均滿足膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］；年齡≥18 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重肝腎功能不全；惡性腫瘤；自身免疫性疾??；入院24 h內(nèi)死亡的患者。其中男性125例，女性110 例，年齡31 ～79 歲，平均年齡（55.3 ± 9.4）歲。根據(jù)是否合并ARDS，分為ARDS 組（104 例）和非ARDS 組（131 例）。同時選擇我院行健康體檢人群40 例為對照組。ARDS 診斷參照2011年柏林定義標(biāo)準(zhǔn)［7］。根據(jù)ARDS 組患者28 d 預(yù)后水平，分為存活組（66 例）和死亡組（38 例）。該研究獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)，并征得了患者家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)采集記錄患者一般臨床資料，包括性別、年齡、原發(fā)疾病、急性生理與慢性健康狀況評分（APACHE Ⅱ）、乳酸水平及28 d 病死率。

1.2.2 檢測自噬相關(guān)基因mRNA 水平入院即刻收集患者外周血，提取單個核細(xì)胞（PBMC），采用實(shí)時定量PCR 檢測自噬相關(guān)基因mRNA 水平。簡要方法如下，采用TRIzol 試劑（Invitrogen 公司）提取PBMC 中總的RNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄方法按試劑盒說明（Takara 公司）。使用ABI Prism 7000 序列檢測系統(tǒng)（美國Bio?rad 公司）進(jìn)行RT?qP?CR反應(yīng)。本研究中使用的引物序列如下：Beclin?1，正向5′?GGCTGAGAGACTGGATCAGG?3′和反向5′?CTGCGTCTGGGCATAACG?3?3′；LC3?Ⅱ，正向5′?GAGAAGCAGCTTCCTGTTCTGG?3′和反向5′?GTG?TCCGTTCACCAACAGGAAG?3′；p62，正向5′?GCT?CTTCGGAAGTCAGCAAACC?3′和反向5′?GCAGTT?TCCCGACTCCATCTGT?3′；GAPDH，正向5′?GGAC?TGACCTGCCGTCTAG?3′和反向5′?TAGCCCAGGA?TGCCCTTGAG?3′。以GAPDH 為內(nèi)參，使用2-ΔΔCq方法計(jì)算相對mRNA 水平。

1.2.3 檢測自噬相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平提取PBMCs 總蛋白，使用Bradford 方法測定蛋白濃度。每孔加入等量蛋白，通過10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移置硝基纖維素膜。采用牛血清白蛋白封閉，然后與稀釋的一抗進(jìn)行孵育，抗Beclin?1抗體（1∶500）、抗LC3 抗體（1∶500）抗p62 抗體（1∶400）及抗GAPDH 抗體（1∶800）。次日孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶10 000）。以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算目的條帶與GAPDH 灰度比值。

1.2.4 檢測外周血細(xì)胞因子及乳酸水平采用ELISA 法測定不同組間外周血IL?1β、TNF?α、IL?6和IL?10 水平，具體操作依據(jù)試劑盒說明書（武漢博士德生物公司）進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。采用Spearman 相關(guān)性分析。運(yùn)用Graphpad 軟件做ROC 曲線分析，計(jì)算ROC 曲線下面積（AUC）、最佳工作點(diǎn)（OOP）、敏感性及特異性，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料比較ARDS 組患者血乳酸、APACHE Ⅱ評分及28 d 病死率顯著高于非ARDS組（P＜0.05）。ARDS 組和非ARDS 組患者在性別、年齡、采血時間、原發(fā)病等方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 各組間自噬相關(guān)蛋白及細(xì)胞因子水平比較與對照組比較，肺內(nèi)疾病并發(fā)的ARDS 組、肺外疾病并發(fā)的ARDS組和非ARDS組PBMCs 中Beclin?1、LC3?II mRNA 及蛋白表達(dá)和外周血IL?10 水平顯著降低，而p62 mRNA 及蛋白表達(dá)和外周血IL?1β、TNF?α及IL?6水平顯著升高（P＜0.05）。與非ARDS組比較，肺內(nèi)疾病并發(fā)的ARDS 組、肺外疾病并發(fā)的ARDS 組PBMCs 中Beclin?1、LC3?II mRNA 及蛋白表達(dá)和外周血IL?10 水平顯著降低，而p62 mRNA 及蛋白表達(dá)和外周血IL?1β、TNF?α及IL?6水平顯著升高（P＜0.05）。肺內(nèi)疾病并發(fā)的ARDS組和肺外疾病并發(fā)的ARDS 組上述指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2 及圖1。

表1 各組患者一般臨床資料比較Tab.1 Comparison of general clinical data in each group ±s，例（%）

表1 各組患者一般臨床資料比較Tab.1 Comparison of general clinical data in each group ±s，例（%）

注：與非ARDS 組比較，*P ＜0.05

指標(biāo)性別（男/女）平均年齡（歲）采血時間（min）原發(fā)?。ɡ┲匕Y肺炎重癥胰腺炎腹腔感染膽道感染外科創(chuàng)傷其他乳酸（mmol/L）APACHEⅡ評分（分）28 d 病死率（%）對照組（40 例）21/19 55.10±7.28 1.20±0.34---------ARDS 組（104 例）55/49 55.65±8.19 2.60±0.48 25（24.1）21（20.2）20（19.2）15（14.4）13（12.5）10（9.6）8.92±1.81*18.94±3.13*38（36.5）*非ARDS 組（131 例）70/61 54.90±9.60 2.68±0.51 32（24.4）26（19.8）25（19.1）18（13.7）15（11.5）15（11.5）5.20±1.47 13.48±2.05 30（22.9）t，F(xiàn)/χ2值0.014 0.216 157.200 0.005 0.004 0.001 0.022 0.061 0.205 17.390 16.090 5.244 P 值0.993 0.806＜0.001 0.945 0.948 0.977 0.811 0.805 0.650＜0.001＜0.001 0.022

表2 各組患者自噬相關(guān)基因mRNA 及細(xì)胞因子水平比較Tab.2 Comparison of autophagy?related gene mRNA and cytokine levels in each group ±s

表2 各組患者自噬相關(guān)基因mRNA 及細(xì)胞因子水平比較Tab.2 Comparison of autophagy?related gene mRNA and cytokine levels in each group ±s

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與非ARDS 組比較，#P ＜0.05

組別對照組非ARDS 組肺內(nèi)疾病并發(fā)ARDS 組肺外疾病并發(fā)ARDS 組F 值P 值例數(shù)40 131 25 79 Beclin?1 mRNA 1.03±0.13 0.83±0.10*0.64±0.19*#0.62±0.17*#94.95＜0.001 LC3?II mRNA 1.05±0.10 0.86±0.13*0.70±0.18*#0.68±0.15*#74.70＜0.001 p62 mRNA 1.02±0.11 1.79±0.15*2.14±0.22*#2.18±0.18*#491.00＜0.001 IL?1β（pg/mL）10.20±3.28 28.82±5.65*39.10±6.83*#40.02±7.24*#238.80＜0.001 TNF?α（pg/mL）8.40±2.60 22.12±4.80*30.26±6.04*#30.64±5.50*#202.10＜0.001 IL?6（pg/mL）14.12±3.50 30.40±4.58*36.65±5.10*#37.04±6.03*#204.10＜0.001 IL?10（pg/mL）29.50±4.20 18.90±3.10*13.60±3.28*#13.35±2.97*#236.60＜0.001

2.3 不同ARDS 預(yù)后組間自噬相關(guān)蛋白及細(xì)胞因子水平比較與存活組比較，死亡組PBMCs 中Beclin?1、LC3?ⅡmRNA 及蛋白表達(dá)和外周血IL?10水平顯著降低，而p62 mRNA 及蛋白表達(dá)和外周血IL?1β、TNF?α及IL?6水平顯著升高（P＜0.05），見表3。

2.4 相關(guān)性分析ARDS組患者Beclin?1mRNA與外周血IL?1β和TNF?α水平呈負(fù)相關(guān)（IL?1β：r=-0.846，P＜0.001；TNF?α：r=-0.735，P＜0.001）；LC3?II mRNA 與外周血IL?1β和TNF?α水平也呈負(fù)相關(guān)（IL?1β：r=-0.416，P＜0.001；TNF?α：r=-0.359，P＜0.001），p62 mRNA 與外周血IL?1β和TNF?α水平也呈正相關(guān)（IL?1β：r=0.856，P＜0.001；TNF?α：r=0.524，P＜0.001），見圖2。

2.5 ROC 曲線分析ROC 曲線分析表明，Beclin?1 mRNA 區(qū)分ARDS 組存活和非存活患者的AUC 為0.818（95%CI：0.743 ～0.913），敏感性和特異性分別為75.96%和80.49%，最佳的臨界點(diǎn)是0.54。而LC3?ⅡmRNA 區(qū)分ARDS 組存活和非存活患者的AUC 為0.829（95%CI：0.738 ～0.921），敏感性和特異性分別為81.82%和75.61%，最佳的臨界點(diǎn)是0.57。p62 mRNA 區(qū)分ARDS 組存活和非存活患者的AUC 為0.794（95%CI：0.705 ～0.883），敏感性和特異性分別為71.19%和71.23%，最佳的臨界點(diǎn)是2.23，見圖3。

3 討論

圖1 各組患者自噬相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平比較Fig.1 Comparison of protein expression levels of autophagy?related genes in each group

膿毒癥為患者機(jī)體對感染的反應(yīng)失調(diào)引起的器官功能障礙，其主要特征為機(jī)體合成與釋放大量炎性細(xì)胞因子［8］。過度的炎癥反應(yīng)和活性氧，導(dǎo)致線粒體功能障礙，隨后引起器官功能衰竭［9］。肺是膿毒癥損傷的主要靶器官之一，一旦并發(fā)ARDS，患者病死率會顯著升高［10］。目前，對于膿毒癥并發(fā)ARDS的早期識別和預(yù)后評估的生物標(biāo)志物較少。有部分研究顯示，如與單獨(dú)使用肺損傷預(yù)測評分相比，聯(lián)合血漿血管生成素?2可有效的提高早期ARDS 的預(yù)測值［11］；尿酸與ARDS 患者病死率呈正相關(guān)，通過檢測尿酸水平，對于預(yù)后的評估有一定價值［12］。但目前這些生物標(biāo)記物的相關(guān)臨床研究證據(jù)仍偏少，并未在臨床得到廣泛開展與運(yùn)用。

相關(guān)研究［13-14］顯示，自噬參與了炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，對于疾病的診斷及病情的評估有一定的運(yùn)用前景。自噬是一種細(xì)胞內(nèi)降解途徑，細(xì)胞通過該途徑回收細(xì)胞質(zhì)并降解過量或缺陷的細(xì)胞器，維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)［15］。動物研究［16］結(jié)果表明，自噬在感染性損傷后會短暫性的升高，但隨后表達(dá)及活性水平顯著受到抑制。在膿毒癥引起的肝損傷中，自噬水平與肝功能障礙、肝細(xì)胞損傷及細(xì)胞凋亡程度密切相關(guān)，自噬水平的降低可能是導(dǎo)致膿毒癥肝衰竭的主要原因之一［17］。因此，自噬成為炎癥性疾病治療的重要靶標(biāo)，通過維持或增加體內(nèi)自噬水平，同時消除抑制自噬的因素是重要的治療策略［18］。對于膿毒癥并發(fā)ARDS 患者中，自噬表達(dá)水平如何，相關(guān)研究較少。本研究結(jié)果顯示，與膿毒癥組比較，膿毒癥并發(fā)ARDS 患者體內(nèi)自噬水平顯著降低，而炎癥指標(biāo)顯著升高，提示膿毒癥并發(fā)ARDS患者體內(nèi)自噬處于抑制狀態(tài)。在臨床實(shí)踐中，生物標(biāo)志物不僅用于疾病的早期診斷及病情嚴(yán)重性評估，還可預(yù)測臨床結(jié)局。對于膿毒癥并發(fā)ARDS 患者預(yù)后水平的預(yù)測，相關(guān)臨床研究也提出了部分生物學(xué)標(biāo)記物，如C?反應(yīng)蛋白、降鈣素原等，但特異性均偏低。本研究結(jié)果顯示，死亡組患者體內(nèi)自噬水平顯著低于存活組患者，ROC 曲線發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)蛋白對于膿毒癥并發(fā)ARDS患者預(yù)后評估的敏感性和特異性均較高，表明其可能成為預(yù)測膿毒癥并發(fā)ARDS患者預(yù)后不佳的有效指標(biāo)。較低的自噬水平，促進(jìn)了炎癥反應(yīng)的放大。研究顯示，表觀遺傳學(xué)機(jī)制包括基因甲基化、組蛋白修飾、mi?croRNA等參與了調(diào)控自噬［19-20］，對表觀遺傳學(xué)在自噬調(diào)控方面的深入研究，將有助于探索出針對炎癥性疾病如膿毒癥并發(fā)ARDS 患者新的治療策略。本研究局限性在于：（1）可能存在膿毒癥并發(fā)ARDS確診偏低的情況，有患者ARDS癥狀不明顯，存在漏診發(fā)生可能；（2）樣本量偏低，對研究結(jié)果產(chǎn)生偏倚；（3）所有患者均來自同一醫(yī)院，多中心隨機(jī)雙盲研究將有助于更好的進(jìn)行評估。

表3 兩組患者自噬相關(guān)基因mRNA 及細(xì)胞因子水平比較Tab.3 Comparison of autophagy?related gene mRNA and cytokine levels between the two groups ±s

表3 兩組患者自噬相關(guān)基因mRNA 及細(xì)胞因子水平比較Tab.3 Comparison of autophagy?related gene mRNA and cytokine levels between the two groups ±s

注：與存活組比較，*P ＜0.05

組別存活組死亡組t 值P 值例數(shù)66 38 Beclin?1 mRNA 0.63±0.11 0.54±0.10*4.151＜0.001 LC3?ⅡmRNA 0.69±0.12 0.58±0.09*4.908＜0.001 p62 mRNA 2.10±0.18 2.26±0.20*4.190＜0.001 IL?1β（pg/mL）38.82±4.62 42.10±5.10*3.356 0.001 TNF?α（pg/mL）26.20±4.02 32.58±4.95*7.153＜0.001 IL?6（pg/mL）35.80±4.30 39.26±4.60*3.382＜0.001 IL?10（pg/mL）13.82±2.10 11.70±2.36*4.737＜0.001

圖2 相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis

圖3 各指標(biāo)ROC 曲線分析Fig.3 ROC curve analysis of each indicator

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，自噬水平的降低參與了膿毒癥并發(fā)ARDS的發(fā)生及發(fā)展，通過檢測自噬水平，對患者預(yù)后不佳的評估具有一定臨床價值。