細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2抑制藥對慢性阻塞性肺疾病小鼠氣道高分泌黏蛋白5ac的作用機制

覃英嬌 周向東，2，3 鐘有清 王杰 劉峰

1海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科（海口570102）；2急救與創(chuàng)傷研究教育部重點實驗室（海口571199）；3中國醫(yī)學科學院海島急救醫(yī)學創(chuàng)新單元（?？?71199）

隨著環(huán)境污染及吸煙人數(shù)的增多，慢性阻塞性肺?。╟hronic obstructive pulmonary diseases，COPD）致病率和病死率逐年上升，嚴重威脅人類身體健康［1］。COPD 作為呼吸科常見的疾病，其發(fā)病機理復雜且多變［2］。有研究［2］表明，該病的主要發(fā)病機制為慢性炎癥引起的肺組織破壞。作為一種慢性炎癥類疾病，該病受多種調(diào)控因素影響，吸煙是導致COPD 的重要危險因素之一，香煙中所含的活性氧類物質(zhì)能夠通過某些通路誘導相關(guān)黏液蛋白的表達，從而促進氣管黏液高分泌［3］。近年來研究表明，muc5ac 是氣管中最主要的分泌性黏蛋白之一，而氣管黏液高分泌是COPD 的重要病理特征之一，它可以加速肺功能下降進程，加重呼吸道氣流阻塞，造成氣管內(nèi)感染，增加COPD 患者的住院率和病死率［4］。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1 和2（extracel?lular?signal regulated kinase1/2，ERK1/2）在COPD 患者機體內(nèi)被激活，在健康人體內(nèi)ERK1/2 水平下調(diào)，但其作用機制尚不清楚［5］。因此，本研究通過建立COPD 模型，觀察ERK1/2 抑制藥對COPD 小鼠氣道高分泌muc5ac 的作用機制，為臨床治療COPD 提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物ICR 小鼠60 只，雄性，體質(zhì)量18～20 g，由濟南金豐實驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）20180006，于清潔通風的環(huán)境中適應性飼養(yǎng)小鼠1 周，保持溫度25 ～28 ℃，濕度60%～65%。

1.1.2 主要試劑和儀器ERK1/2 抑制藥（上海輔仁醫(yī)藥研發(fā)有限公司），沙丁胺醇注射劑（批準文號：國藥準字H31022208，上海禾豐藥業(yè)有限公司），Trizol 試劑（Invitrogen 公司），ELISA 試劑盒（英國Solarbio 公司），白細胞介素4（Interleukin，IL?4）、干擾素γ（Interferon?gamma，IFN?γ）ELISA 試劑盒（北京同立海源生物科技有限公司），兔抗小鼠muc5ac、ERK1/2、p?ERK1/2 單克隆抗體（艾美捷生物科技有限公司），HRP 標記的山羊抗兔IgG（美國Abcam 公司），實時熒光定量PCR 儀、SpectraMax 190 酶標儀（上海美谷分子儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 建模及分組隨機取45 只小鼠，采用鼻腔滴入脂多糖聯(lián)合煙熏的方法建立COPD 小鼠動物模型［6］。分別在第1、14 和34 天向小鼠鼻腔內(nèi)滴入200 μL 脂多糖（脂多糖濃度為1 g/L），第2 ～35 天（除第14、34 天）采取熏香煙法，12 支/次，30 min/次。將建模成功的45 只小鼠隨機分為模型組、抑制藥組、西藥組，各15 只。剩余15 只為對照組，分別于第1、14 和34 天向鼻腔內(nèi)滴入同等量的0.9%氯化鈉溶液。連續(xù)5 周。

1.2.2 干預方法建模成功后5 h 進行干預。抑制藥組：腹腔注射30 mg/kg U0126，西藥組：腹腔注射沙丁胺醇0.4 mg/次（用5%葡萄糖注射液20 mL稀釋注射）。對照組和模型組：腹腔注射等量生理鹽水，其他時間正常飼養(yǎng)。各組小鼠每天干預1次，共7 d。

1.2.3 肺功能測定干預后8 h 進行肺功能測定，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（按50 mg/kg）麻醉小鼠，仰臥位，分離暴露氣管后在頸正中部位將氣管切開，插入連接三通管的氣管插管后固定。測定小鼠0.3 s 用力呼氣量（forced expiratory volume in 0.3 second，F(xiàn)EV0.3），用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）及兩者比值。

1.2.4 小鼠血清制備和IL?4、IFN?γ水平檢測稱取小鼠體質(zhì)量，經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉（按50 mL/kg）麻醉小鼠，腹主動脈取血法從小鼠體內(nèi)取血1 mL，3 000 r/min，離心20 min，離心半徑為10 cm，取血清。按ELISA 試劑盒操作流程檢測小鼠血清中IL?4、IFN?γ的含量。

1.2.5 HE 染色觀察肺組織病理學變化取固定后的小鼠右肺中葉組織，自來水沖洗，放入10%福爾馬林中使肺組織的蛋白變性凝固，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟處理，待石蠟完全浸入組織塊后包埋，冷卻凝固后切片，染色封片，光鏡觀察肺組織病理形態(tài)學變化。

1.2.6 RT?PCR 檢測肺組織中muc5ac、ERK1/2 mRNA 的表達取保存在液氮中的肺組織80 mg，于冰上充分研磨，提取總RNA。檢測RNA的純度和濃度，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行熒光定量PCR，總反應體系為20 μL：cDNA 2 μL，上游引物1.5 μL，下游引物1.5 μL，Taq DNA 聚合酶10 μL，雙蒸水5 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸15 s，共40 個循環(huán)。以β?actin 為內(nèi)參基因，采用2?△△CT法計算。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.7 Western blot 檢測肺組織muc5ac、ERK1/2、p?ERK1/2 蛋白表達取液氮中的肺組織70 mg，BCA 法提取總蛋白并定量，100 ℃水浴使蛋白變性。進行SDS?PAGE 電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入1∶2 000 稀釋的muc5ac、ERK1/2、p?ERK1/2、β?actin 一抗，4 ℃過夜孵育，1×TBST 洗膜5 min×6 次，加入HRP 標記的山羊抗兔二抗（1∶10 000），室溫孵育2 h，1×TBST洗膜5 min×6 次，加入ECL 顯影液顯影，采用Image J 軟件分析圖像，結(jié)果以目的蛋白/β?actin 表示。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以表示，資料符合正態(tài)分布，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，樣本兩兩比較采用LSD?t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各肺功能指標檢測比較與對照組比較，模型組、抑制藥組和西藥組的FEV0.3、FVC 以及FEV0.3/FVC 明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，抑制藥組和西藥組的FEV0.3、FVC 以及FEV0.3/FVC 明顯升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠肺功能指標檢測比較Tab.2 Comparison of pulmonary function indexes of mice in each group ±s

表2 各組小鼠肺功能指標檢測比較Tab.2 Comparison of pulmonary function indexes of mice in each group ±s

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05

組別對照組模型組抑制藥組西藥組F 值P 值FEV0.3（mL）5.38±0.54 3.21±0.33a 4.13±0.42ab 4.16±0.42ab 63.120＜0.001 FVC（mL）5.74±0.58 3.73±0.38a 4.62±0.47ab 4.64±0.48ab 43.585＜0.001 FEV0.3/FVC（%）93.73±9.77 86.06±8.64a 89.39±9.23ab 89.65±9.21ab 4.183 0.01

2.2 各組小鼠血清中IL?4、IFN?γ水平比較與對照組比較，模型組、抑制藥組和西藥組的IL?4 水平降低，IFN?γ水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，抑制藥組和西藥組的IL?4 水平升高，IFN?γ水平降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠血清中IL?4、IFN?γ水平比較Tab.3 Comparison of IL?4 and IFN?γ levels in serum of mice in each group ±s

表3 各組小鼠血清中IL?4、IFN?γ水平比較Tab.3 Comparison of IL?4 and IFN?γ levels in serum of mice in each group ±s

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05

組別對照組模型組抑制藥組西藥組F 值P 值IL?4（pg/mL）34.16±3.51 24.35±2.50a 31.22±3.22ab 32.13±3.30ab 27.311＜0.001 IFN?γ（pg/mL）39.31±4.11 66.53±6.71a 45.36±4.62ab 43.22±4.41ab 87.087＜0.001

2.3 肺組織病理學變化對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)未見明顯異常。模型組小鼠肺泡不規(guī)則擴大，部分肺泡壁塌陷，纖毛黏縮，肺間質(zhì)內(nèi)有炎性細胞浸潤。抑制藥組和西藥組小鼠肺組織仍有肺大泡形成，但肺組織和氣道炎性細胞浸潤相對減少，纖毛排列相對整齊。見圖1。

圖1 肺組織病理學變化（HE×200）Fig.1 Pathological changes of lung tissue（HE×200）

2.4 各組小鼠肺組織中muc5ac、ERK1/2 mRNA的表達比較與對照組比較，模型組、抑制藥組和西藥組muc5ac mRNA 的表達量升高（P＜0.05）。與模型組比較，抑制藥組和西藥組muc5ac mRNA的表達量降低（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠肺組織中muc5ac、ERK1/2 mRNA 水平比較Tab.4 Comparison of muc5ac and ERK1/2 mRNA levels in lung tissue of Mouses in each group ±s

表4 各組小鼠肺組織中muc5ac、ERK1/2 mRNA 水平比較Tab.4 Comparison of muc5ac and ERK1/2 mRNA levels in lung tissue of Mouses in each group ±s

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05

組別對照組模型組抑制藥組西藥組F 值P 值muc5ac 1.00±0.11 3.12±0.35a 1.78±0.18ab 1.75±0.18ab 234.170＜0.001 ERK1/2 2.22±0.25 2.31±0.24 2.24±0.24 2.26±0.23 0.388 0.762

2.5 各組小鼠肺組織中muc5ac、ERK1/2、p?ERK1/2蛋白表達比較與對照組比較，模型組、抑制藥組和西藥組的muc5ac、p?ERK1/2 蛋白表達量升高（P＜0.05）。與模型組比較，抑制藥組和西藥組的muc5ac、p?ERK1/2 蛋白表達量降低（P＜0.05）。見表5，圖2。

3 討論

COPD 是由空氣中的有害顆粒物造成氣道或肺泡異常所引起的疾?。?］。我國20 歲以上人群COPD 患病率為49.3%，且年齡越大，患病率越高［8-10］。研究表明，COPD 與呼吸道炎癥密切相關(guān)，炎癥反應導致呼吸道黏液大量分泌，細菌大量滋生，形成惡性循環(huán)，加重氣流阻塞和炎癥反應［11］。ERK1/2抑制藥通過調(diào)節(jié)muc5ac的分泌，參與COPD疾病發(fā)展過程，為臨床治療COPD提供參考。

ERK1/2 是一類脯氨酸導向的蘇氨酸/絲氨酸激酶，可以磷酸化與脯氨酸相鄰的蘇氨酸/絲氨酸［12-13］。研究［14-15］顯示，ERK1/2 是生物體內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導分子，參與炎癥反應及細胞分化、凋亡等過程。研究［16］證明，人腎癌細胞內(nèi)ERK 的激活可誘導血紅素氧合酶?1 表達增多，保護肺組織。已有研究［17］表明，在慢性支氣管哮喘小鼠氣道平滑肌細胞中，ERKl/2 能夠促進氣道平滑肌細胞的增殖，并且在哮喘氣道重建中發(fā)揮著重要作用。此外，在高血壓、糖尿病血管病變以及血管重建術(shù)后再狹窄等血管疾病中，通過激活ERKl/2 信號分子，誘導血管平滑肌細胞增殖，促進疾病發(fā)生［18］。U1026是ERK1/2上游激酶抑制劑，可以抑制ERK1/2 活化并阻斷ERK1/2 信號轉(zhuǎn)導通路［19］。本研究結(jié)果顯示，抑制藥組和西藥組的FEV0.3s、FVC 以及FEV0.3s/FVC 明顯升高，IL?4 水平升高，IFN?γ水平降低，HE染色結(jié)果也表明，抑制藥組的肺組織病理學變化改善，提示U1026能改善小鼠COPD癥狀。

表5 各組小鼠肺組織中muc5ac、ERK1/2、p?ERK1/2 蛋白水平比較Tab.5 Comparison of muc5ac，ERK1/2 and p?ERK1/2 protein levels in lung tissues of mice in each group±s

表5 各組小鼠肺組織中muc5ac、ERK1/2、p?ERK1/2 蛋白水平比較Tab.5 Comparison of muc5ac，ERK1/2 and p?ERK1/2 protein levels in lung tissues of mice in each group±s

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05

組別muc5acERK1/2p?ERK1/2對照組0.89±0.121.42±0.180.90±0.12模型組1.43±0.18a1.43±0.191.32±0.19a抑制藥組西藥組F 值P 值1.02±0.13ab 1.00±0.13ab 64.015＜0.001 1.42±0.18 1.44±0.18 0.041 0.989 1.03±0.14ab 1.01±0.14ab 69.028＜0.001

圖2 肺組織中muc5ac、ERK1/2、p?ERK1/2 蛋白表達水平比較Fig.2 Comparison of muc5ac，ERK1/2 and p?ERK1/2 protein expression levels in lung tissue

黏液的主要成分是黏蛋白，muc5ac 是氣管主要的分泌性黏蛋白［20］，也是衡量氣道上皮黏液分泌的指標之一，且黏蛋白的數(shù)量和質(zhì)量決定了氣道黏液的理化性質(zhì)［21-22］。既往研究表明，COPD 患者氣道上皮muc5ac mRNA 明顯高于正常健康人，并且指出COPD 患者的肺功能與muc5ac 的基因表達量呈負相關(guān)，說明muc5ac 表達增加是氣道黏液高分泌的重要因素［23］。研究［17］證實，ERK1/2 信號通路對粘液分泌的下游信號起調(diào)控作用，過表達p?ERK1/2，會引起黏液高分泌。本研究發(fā)現(xiàn)，COPD 小鼠注射ERK1/2 抑制藥U1026 可以降低p?ERK1/2蛋白表達量，muc5ac mRNA和蛋白表達量，提示U1026 通過抑制ERK1/2 信號通路，下調(diào)muc5ac 表達，減少黏液，減輕炎癥，緩解COPD癥狀。

綜 上所述，ERK1/2 抑制 藥U0126 對COPD 小鼠的狀況有明顯改善作用，可能是通過抑制ERK1/2 信號通路，下調(diào)muc5ac 表達，改善COPD 癥狀，為臨床COPD 治療提供理論指導。然而，ERK1/2 信號通路作用機制復雜，ERK1/2 和muc5ac的具體關(guān)系，以及ERK1/2 信號通路相關(guān)基因是如何表達的還不清楚，需要進一步證實。