高產(chǎn)生物膜乳酸菌抗逆性及其抗氧化特性

張 悅，賀銀鳳，顧 悅，王 艷，鄭硯學(xué)

高產(chǎn)生物膜乳酸菌抗逆性及其抗氧化特性

張 悅，賀銀鳳※，顧 悅，王 艷，鄭硯學(xué)

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特 010018）

為了揭示乳酸菌生物膜抵抗不良環(huán)境的作用機(jī)制，該研究以2株乳酸片球菌RJ2-1-4、TG1-1-10和2株植物乳桿菌RJ1-1-4、RM1-1-11（菌株均高產(chǎn)生物膜）為研究對象，探究浮游態(tài)、被膜態(tài)菌株對酸、堿、膽鹽、模擬人工胃腸液的耐受能力以及抗氧化能力。結(jié)果表明：在極酸條件下，菌株生長受到抑制，但是pH值3.0時(shí)，被膜態(tài)RM1-1-11生長量顯著高于浮游態(tài)（0.05）。隨著pH值遞增，菌體密度增加，在pH值7.0-9.0時(shí)，堿性環(huán)境對除TG1-1-10外其他3株菌的生長有一定抑制作用；當(dāng)膽鹽濃度為0～0.03%時(shí)，菌株生長有小幅度上升，且被膜態(tài)菌株RJ2-1-4、TG1-1-10生長量顯著低于浮游態(tài)（0.05）；但隨著膽鹽濃度繼續(xù)增加，菌株生長受到抑制，除浮游態(tài)菌株TG1-1-10外，其余3株菌被膜態(tài)菌株生長量均顯著高于浮游態(tài)；菌株在模擬人工胃腸液中處理3 h后發(fā)現(xiàn)，相比于浮游態(tài)菌株，被膜態(tài)各菌株在胃、腸液中的存活率均有所提高。4株菌對于不同種類自由基均有一定清除能力，清除率從高到低分別為HO·、DPPH·、脂質(zhì)過氧化、超氧陰離子，其中RJ1-1-4浮游態(tài)菌懸液對DPPH·清除率為214.12g/mL，RJ2-1-4被膜態(tài)無細(xì)胞提取物、TG1-1-10浮游態(tài)無細(xì)胞提取物對HO·清除率分別為713.81g/mL和637.01g/mL，RJ2-1-4浮游態(tài)無細(xì)胞提取物對超氧陰離子清除率為93.80g/mL，RM1-1-11被膜態(tài)菌懸液對脂質(zhì)過氧化物的清除率為122.82g/mL。結(jié)果表明：生物被膜狀態(tài)下的乳酸菌對于酸、堿、膽鹽、模擬人工胃腸液均有一定的保護(hù)作用，但是菌株間存在特異性，即使是同一種屬也不相同；被膜態(tài)菌株的抗氧化能力高于浮游態(tài)，但是對于不同種類自由基會有不同的結(jié)果。該結(jié)果為進(jìn)一步研究乳酸菌在被膜態(tài)下抵抗環(huán)境脅迫的作用機(jī)制提供依據(jù)。

菌；抗氧化；生物膜；乳酸菌；抗逆性

0 引 言

乳酸菌（Lactic Acid Bacteria，LAB）在自然界中種類繁多且分布廣泛[1]，因其良好的益生特性[2-3]，被廣泛應(yīng)用于食品、飼料和藥品等領(lǐng)域。然而，發(fā)酵產(chǎn)品在加工及運(yùn)輸過程中，會受到一些如酸、堿、高溫等不利因素的影響，使乳酸菌活細(xì)胞數(shù)顯著減少，如果LAB對胃腸道環(huán)境不耐受，那么其發(fā)揮益生特性的能力也會受到影響。因此尋求提高LAB存活率的方法，對于有益乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)利用具有重要意義。目前常用的提高LAB存活率的方法有：改良菌種保護(hù)劑法、微膠囊法、添加低聚糖等物質(zhì)促進(jìn)菌株生長、基因重組改良LAB特性法以及生物膜法[4-8]。生物膜是細(xì)菌粘附于惰性物體或活體生物表面生長、繁殖，由其自身分泌的胞外多聚基質(zhì)所包被起來形成的一種具有高度組織化的微菌落聚集體[9]，是菌體為抵御不良環(huán)境而發(fā)展形成的一種自我保護(hù)模式。由于生物膜是菌體自身的生物合成，因此受到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。研究證明，生物膜狀態(tài)下的乳酸菌較浮游狀態(tài)耐熱、耐氧能力大幅度提升；使用含有生物膜的納米纖維膜作為發(fā)酵劑發(fā)酵酸奶，不但顯示出優(yōu)異的發(fā)酵能力，而且菌株在貨架期內(nèi)的存活率更高。由此可以發(fā)現(xiàn)，生物膜的形成不僅可以提高菌株存活率，還促進(jìn)菌株對不利環(huán)境的適應(yīng)，提高細(xì)菌的耐受性，確保菌株穩(wěn)定發(fā)揮益生作用[10-12]。

生物氧化（Biological Oxidation）是生物體內(nèi)有機(jī)物質(zhì)在酶的催化下發(fā)生氧化反應(yīng)生成CO2和H2O，并釋放大量能量的過程。由于一些內(nèi)源性或者外源性因素的影響，機(jī)體和細(xì)胞會處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[13]，從而引發(fā)糖尿病、阿爾茲海默癥、癌癥等一系列疾病并導(dǎo)致衰老[14-18]。目前對于乳酸菌抗氧化應(yīng)激已得到體內(nèi)外試驗(yàn)的驗(yàn)證，但是對其作用機(jī)制的研究尚不明確，對于被膜態(tài)菌株清除不同種類自由基能力的研究還未見報(bào)道。

本試驗(yàn)選擇課題組前期分離篩選得到的4株高產(chǎn)生物膜乳酸菌，對其在浮游態(tài)、被膜態(tài)下對酸、堿、膽鹽、模擬人工胃腸液的存活能力，以及抗氧化能力進(jìn)行探究，擬為提高乳酸菌在食品工業(yè)中的生存能力和利用率提供新的視角；同時(shí)也為乳酸菌抗氧化機(jī)理的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

本試驗(yàn)受試菌株分離自西藏地區(qū)牦牛乳制品，分別為2株乳酸片球菌RJ2-1-4、TG1-1-10（分別分離自酸曲拉和牦牛酸奶）和2株植物乳桿菌RJ1-1-4、RM1-1-11（分別分離自酸曲拉和牦牛奶），均保藏于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品生物技術(shù)團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

試驗(yàn)所用到的MRS培養(yǎng)基參考顧悅[19]的方法配制。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH），Coolaber公司；酵母提取粉、牛肉浸粉、大豆蛋白胨、牛膽鹽，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；醋酸鈉、檸檬酸氫二胺、磷酸氫二鉀、葡萄糖、維生素C、硫酸亞鐵、水楊酸、無水乙醇、三氯乙酸，購自國藥集團(tuán)化工試劑有限公司；焦性沒食子酸，購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；試驗(yàn)中使用的水均為去離子水。

1.1.3 儀器與設(shè)備

HF-SAFE 1500型生物安全柜、SMART-N純水機(jī)，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；SX-500型全自動高壓滅菌鍋，日本TOMY公司；PB 10型酸度計(jì)，德國Sartorius公司；5810R型高速低溫離心機(jī)，德國Eppendorf公司；紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 浮游態(tài)菌株供試菌液的制備

將活化至第三代的菌液倒入10 mL離心管，10 000 r/min離心5 min后棄上清液，再加入5 mL 0.85%的生理鹽水，吹打混勻后按照上述離心條件離心處理5 min，棄上清。如此重復(fù)3次以洗滌菌體，第3次洗滌完成后棄上清，再加入適量生理鹽水，調(diào)節(jié)菌液的吸光度OD595nm值在1.0左右。此時(shí)細(xì)菌的細(xì)胞濃度為1×107CFU/mL，由此制得浮游態(tài)菌株的供試菌液[11]。

1.2.2 被膜態(tài)菌株供試菌液的制備

將菌株活化至第二代后按照2%體積分?jǐn)?shù)的接菌量傳菌于新鮮培養(yǎng)基，吹打混勻后吸取5 mL于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)前用封口膜纏繞6孔板縫隙處，最后放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，得到被膜態(tài)菌株。按照1.2.1節(jié)中的方法將細(xì)菌的細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為1×107CFU/mL，由此獲得被膜態(tài)菌株的供試菌液[20]。

1.2.3 菌株最適生長pH值的測定

以2%體積分?jǐn)?shù)的接種量，將上文制備好的浮游態(tài)和被膜態(tài)供試菌液分別接種至pH值為9.0、8.0、7.0、6.0、5.0、4.0、3.0、2.0和1.0的MRS液體培養(yǎng)基，以未接菌的相應(yīng)pH值的培養(yǎng)基作為空白對照組，每個(gè)梯度設(shè)置兩個(gè)平行組。于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測定吸光度OD595nm值，篩選出不同狀態(tài)下耐酸能力較強(qiáng)的菌株并確定其耐受范圍。

1.2.4 菌株對不同濃度膽鹽耐受能力的測定

以2%體積分?jǐn)?shù)的接種量，將上文制備好的浮游態(tài)和被膜態(tài)供試菌液分別接種至含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.03%、0.10%、0.20%和0.30%的牛膽鹽MRS液體培養(yǎng)基，以未接菌的MRS液體培養(yǎng)基為空白對照，每個(gè)梯度設(shè)置兩個(gè)平行組。于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測定吸光度OD595nm值，從而篩選出不同狀態(tài)耐膽鹽能力較強(qiáng)的菌種及其相應(yīng)耐受范圍。

1.2.5 菌株對模擬人工胃液的耐受能力的測定

分別取浮游態(tài)和被膜態(tài)菌株的供試菌液，按照菌液∶胃液=1∶9的體積比例注入到人工胃液中，并混合均勻。在37 ℃條件下靜置培養(yǎng)3 h，之后適當(dāng)進(jìn)行梯度稀釋，選擇3個(gè)適宜稀釋度，各取1 mL加入滅菌培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)皿中加入適量培養(yǎng)基與菌液一起搖勻，于37 ℃條件下培養(yǎng)36～48 h后再進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。以人工模擬胃液中初始培養(yǎng)的菌株存活數(shù)作為空白對照組，求得平均值，計(jì)算存活率，從而篩選出對胃液有良好耐受性的菌株[20-21]。

胃液中存活率=(1/0)×100%（1）

式中1為經(jīng)過模擬胃液培養(yǎng)3 h后的平板菌落總數(shù)，(CFU/mL)；0為模擬胃液初始培養(yǎng)的平板菌落總數(shù)，(CFU/mL)。

1.2.6 菌株對人工模擬腸液的耐受能力的測定

分別取浮游態(tài)和被膜態(tài)菌株的供試菌液，按照菌液∶腸液=1∶9的體積比例注入到人工腸液，并混合均勻，在37 ℃條件下靜置培養(yǎng)3 h。之后按照1.2.5節(jié)中的方法培養(yǎng)并進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。以人工模擬腸液中初始培養(yǎng)的菌株存活數(shù)作為空白對照組，求得平均值，計(jì)算存活率，從而篩選出對人工模擬腸液有較好耐受性的菌株[22-23]。

腸液中存活率=(1/0)×100%（2）

式中1為經(jīng)過人工模擬腸液培養(yǎng)3 h后的平板菌落總數(shù)，(CFU/mL)；0為人工模擬腸液初始培養(yǎng)的平板菌落總數(shù)，(CFU/mL)。

1.2.7 菌株抗氧化能力的測定

1）細(xì)胞懸浮液的制備

將1.2.1一節(jié)中培養(yǎng)的三代菌液傾倒于10 mL離心管中，離心（4 ℃，4 000 r/min，10 min），棄去上清，吸取5 mL超純水吹打混勻，重復(fù)兩次，重懸，得到細(xì)胞懸浮液。

2）無細(xì)胞提取物(Cell Free Fermentation Supernatant, CFS)的制備

將上文中制得的細(xì)胞懸浮液利用超聲波破碎儀（280 W，破碎5 s，間隔5 s，共處理10 min）冰浴處理，經(jīng)顯微鏡檢查無完整細(xì)胞后離心（4 ℃，12 000 r/min，10 min）取上清液。

3）清除自由基DPPH·試驗(yàn)

用維生素C溶液、1 mL蒸餾水替代樣品，分別為陽性對照組和陰性對照組，用1 mL無水乙醇代替DPPH無水乙醇溶液為空白組，1.5 mL蒸餾水與同體積無水乙醇混合溶液調(diào)0。清除率按公式（3）計(jì)算：其中為樣品組的吸光值，為空白組的吸光值，0為對照組的吸光值[24]。

以0、50、100、150和200g/mL的維生素C為橫坐標(biāo)，對DPPH·清除率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程為：=0.398+7.033，2=0.992，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

4）清除HO·自由基試驗(yàn)

用維生素C溶液替代樣品為陽性對照組，空白組為蒸餾水。清除率按以公式（4）計(jì)算：其中為樣品組的吸光值，0為空白組的吸光值[25]。

以0、100、200、300、400、500、600、700、800g/mL的維生素C為橫坐標(biāo)，對HO·清除率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程為：=0.123+0.805，2=0.993，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

5）清除超氧陰離子試驗(yàn)

用維生素C溶液替代樣品為陽性對照組，空白組為蒸餾水。清除率按以公式（5）計(jì)算：其中樣為樣品組的吸光值，空為空白組的吸光值[26-27]。

以0、50、100、150、200、250、300g/mL的維生素C為橫坐標(biāo)，對超氧陰離子清除率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程為：=0.3+10.748，2=0.993，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

6）清除脂質(zhì)過氧化物試驗(yàn)

用維生素C溶液替代樣品為陽性對照組，空白組為蒸餾水。清除率按以公式（6）計(jì)算：其中樣為樣品組的吸光值，空為空白組的吸光值[27]。

以0、50、100、150、200g/mL的維生素C為橫坐標(biāo)，對脂質(zhì)過氧化物清除率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程為：=0.383+8.718，2=0.990，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 23.0中的one-way ANOVA和Origin 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析及作圖，測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同狀態(tài)下乳酸菌對酸、堿耐受結(jié)果

在人體眾多防御機(jī)制中，胃酸提供的強(qiáng)酸環(huán)境對微生物的影響最大。胃液的pH值因個(gè)體差異和飲食結(jié)構(gòu)的不同有較大波動，正常人胃液的pH值為1.5-2.0。食物在胃內(nèi)停留的時(shí)間從幾分鐘到幾小時(shí)不等，因此絕大多數(shù)微生物因不耐酸而被殺滅，只有極少數(shù)具有較強(qiáng)耐酸能力的乳酸菌能夠順利通過胃酸屏障，到達(dá)腸道內(nèi)發(fā)揮其益生作用。因此益生性乳酸菌必須具備耐酸特性，才能在胃腸消化道中保持一定的數(shù)量[28]。4株菌浮游態(tài)、被膜態(tài)菌株最適生長pH值范圍及耐酸、堿能力結(jié)果如圖 1所示。

由圖1可知，在pH值1.0-3.0時(shí)，極酸性環(huán)境完全抑制了浮游態(tài)菌株的生長，在pH值3.0時(shí)，被膜態(tài)RM1-1-11的菌體密度顯著高于浮游態(tài)（0.05）。隨著pH值遞增，菌體密度逐漸上升，浮游態(tài)的乳酸片球菌RJ2-1-4在pH值6.0時(shí)達(dá)到最大生長量，乳酸片球菌TG1-1-10、植物乳桿菌RJ1-1-4則在pH值7.0時(shí)達(dá)到最大生長量，而植物乳桿菌RM1-1-11則是在pH值9.0時(shí)達(dá)到最大生長量。在pH值7.0-9.0時(shí)，堿性環(huán)境對除RM1-1-11外其他3株菌的生長有一定抑制作用，但是4株被膜態(tài)乳酸菌生長量均高于浮游態(tài)。通過觀察圖1可以發(fā)現(xiàn)，在pH值為5.0-6.0的范圍內(nèi)，除RM1-1-11，浮游態(tài)菌株的生長量總體上高于被膜態(tài)菌株，出現(xiàn)這樣的結(jié)果可能是由于酸脅迫下，相關(guān)的酸敏感應(yīng)激蛋白變性甚至失去活性，生物膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而造成菌體間的拮抗，影響菌株的生長[29]。從上述結(jié)果可以得出，大部分被膜態(tài)菌株對酸堿環(huán)境的耐受能力比浮游態(tài)的高，而且存在菌株特異性。

2.2 不同狀態(tài)下乳酸菌對膽鹽耐受結(jié)果

膽鹽是肝細(xì)胞分泌的膽汁酸和?；撬峄蚋拾彼峤Y(jié)合得到的鈉鹽或鉀鹽，人體小腸中膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般維持在0.03%～0.30%，膽鹽能夠改變菌體細(xì)胞膜的通透性，從而抑制、殺滅乳酸菌。因此，乳酸菌要在人體內(nèi)發(fā)揮益生功效，必須對膽鹽有一定的耐受力[30]。4株乳酸菌浮游態(tài)和被膜態(tài)對膽鹽耐受能力如圖2所示。

由圖2可知，膽鹽濃度為0～0.03%時(shí)，菌株生長有小幅度上升，且被膜態(tài)菌株RJ2-1-4、TG1-1-10生長量顯著低于浮游態(tài)（0.05）；但隨著膽鹽濃度繼續(xù)增加，菌株生長受到抑制，此時(shí)除浮游態(tài)菌株TG1-1-10在0.10%膽鹽濃度生長量高于被膜態(tài)，其余3株菌被膜態(tài)菌株生長量均顯著高于浮游態(tài)。雖然菌株生長受到抑制，但是菌株被膜態(tài)對菌體起到保護(hù)作用，使得菌株對于高濃度膽鹽有一定耐受能力。

2.3 不同狀態(tài)下乳酸菌對人工模擬胃液的耐受能力

人體胃液的主要成分為胃蛋白酶和鹽酸，呈酸性，正常水平下維持在pH值3.0左右，空腹?fàn)顟B(tài)下甚至可達(dá)到pH值1.5，因此乳酸菌對于胃液的脅迫作用要有一定抵抗作用才能生長和發(fā)揮其益生功能。浮游態(tài)及被膜態(tài)菌株耐胃液能力測定結(jié)果如表1所示。

表1 浮游態(tài)和被膜態(tài)菌株在模擬人工胃液中存活情況

注：表中不同大寫字母表示同一株乳酸菌不同狀態(tài)時(shí)差異顯著；小寫字母表示不同乳酸菌在同一狀態(tài)下差異顯著（0.05），下同。

Note: Different capital letters in the table indicate that the same strain of lactic acid bacteria has significant differences in different states; lower case letters indicate that different lactic acid bacteria have significant differences in the same state (0.05). The same below.

從表1中可以看出：在胃液中培養(yǎng)3 h后，相比于菌株RJ2-1-4和TG1-1-10的存活率，菌株RJ1-1-4和RM1-1-11的存活率維持在較高水平，且前兩株菌的存活率與后兩株菌存在顯著差異（0.05）。

相比于浮游態(tài)菌株，被膜態(tài)各菌株在胃液中的存活率均有所提高，在胃液中培養(yǎng)3 h后，存活率由小到大依次是22.13%，36.59%，58.66%，76.28%，即菌株耐胃液能力由弱到強(qiáng)依次是TG1-1-10，RJ2-1-4，RJ1-1-4，RM1-1-11。由此可見，生物被膜狀態(tài)下的菌株對模擬胃液的耐受性更高。

2.4 不同狀態(tài)乳酸菌對模擬人工腸液的耐受能力

腸液呈微堿性，主要成分為胰蛋白酶和膽鹽，對于乳酸菌生長有脅迫作用。乳酸菌在人體腸道內(nèi)的活菌數(shù)達(dá)到108CFU/mL以上時(shí)，才滿足其發(fā)揮益生特性的要求[31]。浮游態(tài)及被膜態(tài)菌株耐腸液能力測定結(jié)果如表2所示。

表2 浮游態(tài)和被膜態(tài)菌株在模擬人工腸液中存活情況

從表2中可以看出：菌株在腸液中培養(yǎng)3 h后，浮游態(tài)存活率由小到大依次為34.60%，34.63%，37.78%，60.06%，即菌株RJ1-1-4，RJ2-1-4和RM1-1-11對腸液的耐受能力相近，而菌株TG1-1-10的耐受能力較高，與前三者存在顯著差異。

相比于浮游態(tài)菌株，被膜態(tài)各菌株在腸液中的存活率均有所上升，但上升幅度不同。在腸液中培養(yǎng)3 h后，存活率由小到大依次是41.46%，43.83%，64.97%，69.78%，即菌株RJ2-1-4和RJ1-1-4不存在顯著差異，耐受能力相對較低，菌株RM1-1-11和TG1-1-10之間也不存在顯著差異（0.05），但耐受能力相對較高。由此可見，被膜態(tài)菌株可提高對腸液環(huán)境的耐受性，提高菌株在腸道內(nèi)的存活率，使其能進(jìn)一步發(fā)揮其保留益生作用。

由上述對浮游態(tài)、被膜態(tài)菌株環(huán)境抗逆性的研究，不難發(fā)現(xiàn)生物被膜狀態(tài)下的菌株對不良環(huán)境的耐受性更強(qiáng)。為了驗(yàn)證被膜態(tài)菌株的抗氧化特性是否強(qiáng)于浮游態(tài)菌株，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)不同種類自由基來探究不同狀態(tài)下菌株的抗氧化能力。

2.5 不同狀態(tài)菌乳酸菌株抗氧化能力

乳酸菌的抗氧化應(yīng)激已經(jīng)得到體內(nèi)外的試驗(yàn)證實(shí)，但是對其機(jī)理研究尚不明確。且對于被膜態(tài)菌株抗氧化的研究較少，因此通過對生物膜狀態(tài)下菌株抗氧化能力進(jìn)行研究，可以為氧化應(yīng)激機(jī)理的研究提供新思路。

浮游態(tài)和被膜態(tài)菌株對不同自由基的清除率如圖3所示。4株菌均有清除自由基能力，但是不同狀態(tài)對不同種類自由基的清除能力不同，且同一種屬之間清除率也不相同。對于DPPH·自由基，菌株RJ2-1-4、TG1-1-10、RM1-1-11浮游態(tài)與被膜態(tài)對自由基清除能力無顯著差異（0.05），但是經(jīng)過超聲波破碎后，除RM1-1-11，其他兩株乳酸片球菌清除率均降低；而RJ1-1-4浮游態(tài)菌株對DPPH·清除率較被膜態(tài)高，其中浮游態(tài)菌懸液的清除率為214.12g/mL；大部分菌株經(jīng)超聲波破碎后清除率呈現(xiàn)下降趨勢，說明菌株對DPPH·自由基的清除作用并非單憑胞內(nèi)某些活性物質(zhì)，與其活細(xì)胞的一些抗氧化機(jī)制密切相關(guān)。對于HO·自由基，兩株乳酸片球菌均表現(xiàn)出無細(xì)胞提取物對HO·的清除能力均顯著高于菌懸液的，菌株RJ2-1-4被膜態(tài)無細(xì)胞提取物對HO·的清除能力為713.81g/mL，而菌株TG1-1-10浮游態(tài)無細(xì)胞提取物對HO·的清除能力為637.01g/mL。兩株植物乳桿菌則表現(xiàn)出被膜態(tài)對HO·的清除能力均顯著高于浮游態(tài)的（0.05）。對于超氧陰離子，與HO·自由基結(jié)果相似，乳酸片球菌RJ2-1-4不同狀態(tài)下菌懸液對超氧陰離子均無清除能力，而菌懸液無細(xì)胞提取物的清除率與被膜態(tài)無細(xì)胞提取物相近，達(dá)到93.80g/mL。說明細(xì)胞內(nèi)可能存在某些具備清除超氧陰離子的物質(zhì)且不同菌株間存在差異。對于脂質(zhì)過氧化物，菌株對其都表現(xiàn)出不同抑制作用，但是4株菌均表現(xiàn)出被膜態(tài)菌懸液的清除能力最好，其中RM1-1-11被膜態(tài)菌懸液的清除率最高，為122.82g/mL。這可能是由于清除脂質(zhì)過氧化物的酶等物質(zhì)大多存在于細(xì)胞表面，且菌株在成膜過程中會分泌類似物質(zhì)，從而表現(xiàn)出被膜態(tài)菌懸液清除能力好[32]。由上述結(jié)果可知，總體上被膜態(tài)菌株的抗氧化能力高于浮游態(tài)，但是對于不同種類自由基會有不同的結(jié)果，具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

1）乳酸片球菌RJ2-1-4、TG1-1-10和植物乳桿菌RJ1-1-4、RM1-1-11，4株乳酸菌在不同pH值環(huán)境中時(shí)，被膜態(tài)乳酸菌菌體密度總體上高于浮游態(tài)菌株。當(dāng)pH值為5.0-6.0時(shí)，浮游態(tài)乳酸片球菌RJ2-1-4、TG1-1-10和植物乳桿菌RJ1-1-4生長量高于被膜態(tài)；乳酸片球菌RJ2-1-4、RM1-1-11在pH值7.0-9.0時(shí)，被膜態(tài)菌株生長量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，且菌體密度高于浮游態(tài)。

2）耐膽鹽試驗(yàn)中，浮游態(tài)和被膜態(tài)4株乳酸菌的生長量都會隨著膽鹽濃度的升高而下降。在膽鹽濃度為0.30%的環(huán)境下，浮游態(tài)菌株中只有菌株TG1-1-10表現(xiàn)出一定的耐受性，而被膜態(tài)菌株中，除了菌株RM1-1-11外，其他菌株都具有一定耐受性。

3）模擬人工胃液的耐受性試驗(yàn)中，4株乳酸菌均表現(xiàn)出一定耐受性，但耐受能力各異。浮游態(tài)菌株中，菌株RJ1-1-4存活率最高，為56.49%；TG1-1-10存活率最低，為6.29%，說明菌株TG1-1-10的耐受能力最差。被膜態(tài)乳酸菌的耐受能力顯著提高（0.05），其中菌株RM1-1-11表現(xiàn)出最強(qiáng)耐受能力，存活率可以達(dá)到76.28%。模擬人工腸液的耐受性試驗(yàn)中，浮游態(tài)菌株TG1-1-10存活率最高，為60.06%；菌株RJ1-1-4的存活率最低，為34.60%。被膜態(tài)乳酸菌對腸液的耐受能力顯著提高（0.05），耐受能力較好的菌株TG1-1-10存活率可由原來的60.06%提升至69.78%。

4）4株乳酸菌對于不同種類自由基均有一定清除能力，清除率從高到低分別為HO·、DPPH·、脂質(zhì)過氧化、超氧陰離子。其中RJ2-1-4被膜態(tài)無細(xì)胞提取物、TG1-1-10浮游態(tài)無細(xì)胞提取物對HO·清除率分別為713.81g/mL和637.01g/mL，RJ1-1-4浮游態(tài)菌懸液對DPPH·清除率為214.12g/mL， RM1-1-11被膜態(tài)菌懸液對脂質(zhì)過氧化物的清除率為122.82g/mL，RJ2-1-4浮游態(tài)無細(xì)胞提取物對超氧陰離子清除率為93.80g/mL。

4株高產(chǎn)生物膜乳酸菌在生物被膜狀態(tài)下對于酸、堿、膽鹽、人工胃腸液均有一定的耐受性，可以提高LAB在不良環(huán)境中的存活率。但是抵御不良環(huán)境的能力存在菌株差異性，即使是同一種屬的不同菌株間也不相同。因此，研究乳酸菌的生物膜，使菌株以被膜態(tài)生長，不僅可以有效提高菌株的存活率，從而增加其對外界不良環(huán)境的抵抗能力，而且對乳酸菌更好的發(fā)揮益生功效具有重要的意義。

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Stress resistance and antioxidant properties of lactic acid bacteria with high biofilm production

Zhang Yue, He Yinfeng※, Gu Yue, Wang Yan, Zheng Yanxue

(,,010018,)

Most bacteria in the natural environment choose to live in the biofilm state, due mainly to better advantage over the planktonic state. The resistance of strains to the external environment can be significantly improved, when lactic acid bacteria behave in the form of a biofilm state. Therefore, it is a benefit to investigate the stress resistance of strains in biofilm state for the production mechanism behind the lactic acid bacteria biofilm under environmental stress. In this study, two strains ofRJ2-1-4, TG1-1-10 and two strains ofRJ1-1-4, RM1-1-11 (They were both high-yield biofilm strains) were selected to systematically explore the tolerance of planktonic and biofilm strains to acid, alkali, bile salt, simulated artificial gastrointestinal fluid, and antioxidant ability. The results showed that the growth of strain was inhibited under the condition of extremely acid, but the growth of biofilm state RM1-1-11 at pH 3.0 was significantly higher than that of the planktonic state (0.05). The density of bacteria increased with the increase of pH value, whereas, the alkaline environment in pH 7.0-9.0 inhibited the growth of three strains except TG1-1-10. The growths of membranous strains RJ2-1-4 and TG1-1-10 were significantly lower than those of planktonic state (0.05), particularly that the growth of strain increased slightly, when the concentration of bile salt was 0-0.03%. However, the growth of strain was inhibited as the concentration of bile salt continued to increase. In addition, the TG1-1-10 growth of planktonic strain was higher than that of biofilm strain, whereas the growth of the other three strains in the biofilm state was significantly higher than those of planktonic strain. After the strains were treated in the simulated artificial gastrointestinal fluid for 3 hours, it was found that the survival rate of biofilm strains in the gastric and intestinal juices improved, compared with the planktonic strains. There was a certain clearance ability of four strains for different kinds of free radicals. The clearance rates were ranked in order: HO·>DPPH·> lipid peroxidation > superoxide anion. Specifically, the clearance rate of RJ2-1-4 planktonic bacteria suspension on DPPH· was 214.12g/mL, while the clearance rate of RJ2-1-4 biofilm CFS to superoxide anion was 93.8g/mL, and the clearance rates of RJ2-1-4 biofilm CFS and TG1-1-10 planktonic CFS on HO· were 713.81g/mL and 637.01g/mL, respectively. The clearance rate of lipid peroxides by RM1-1-11 biofilm suspension was 122.82g/mL. Lactic acid bacteria in biofilm state had certain protective effects on acid, alkali, bile salt and artificial gastrointestinal fluid, but there was specificity among strains, even in the same genus. The anti-oxidation ability of biofilm strain was higher than that of planktonic state, but there was a definite difference in different kinds of free radicals. The finding can provide a significant support to a further investigation on the resistance of lactic acid bacteria to environmental stress in biofilm states.

bacteria; antioxidation; biofilm; lactic acid bacteria; stress resistance

張悅，賀銀鳳，顧悅，等. 高產(chǎn)生物膜乳酸菌抗逆性及其抗氧化特性[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2021，37(6)：282-288.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.06.034 http://www.tcsae.org

Zhang Yue, He Yinfeng, Gu Yue, et al. Stress resistance and antioxidant properties of lactic acid bacteria with high biofilm production[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(6): 282-288. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.06.034 http://www.tcsae.org

2020-10-13

2021-03-09

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31960467)；內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2019BS03002)；內(nèi)蒙古自治區(qū)研究生科研創(chuàng)新資助項(xiàng)目(B20191147Z)

張悅，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。Email：etsu_1007623969@163.com

賀銀鳳，博士，教授，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。Email：heyinf6468@163.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.06.034

TS201.3

A

1002-6819(2021)-06-0282-07