ACS患者PCI后外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-326水平變化及意義

強(qiáng)鈺偉，郝明輝，郭 明

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京 101100)

急性冠狀動(dòng)脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)具有發(fā)病率高、致死率高的特點(diǎn)[1-2]。近年來，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention，PCI)廣泛應(yīng)用，ACS預(yù)后已明顯改善[3]，但仍有主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events，MACE)發(fā)生[4-5]。MiR-326參與缺血缺氧性腦損傷[6]、胃癌[7]、宮頸癌[8]和肝細(xì)胞肝癌[9]等疾病進(jìn)展，但與ACS預(yù)后的關(guān)系鮮有報(bào)道。去整合素-金屬蛋白酶17(a disintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17)是miR-326的靶點(diǎn)[10]，已被證實(shí)與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)[11]。筆者推測檢測miR-326或可預(yù)測ACS預(yù)后，本研究分析miR-326與ACS預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 前瞻性選取2016年4月—2017年3月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院就診的ACS患者205例作為研究對(duì)象。根據(jù)《急性冠脈綜合征急診快速診療指南》[12]診斷ACS。其中男性144例，女性61例，年齡28～78歲，平均(56.17±9.37)歲，體重指數(shù)(body mass index，BMI)6.59±3.01；其中ST段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI)50例，非ST段抬高型心肌梗死(non-ST elevation myocardial infarction，NSTEMI)106例，不穩(wěn)定型心絞痛(unstable angina，UA)49例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次確診為ACS并接受PCI治療；②發(fā)病48 h內(nèi)入院；③年齡<80歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并下肢動(dòng)脈疾病、慢性阻塞性肺疾病、高同型半胱氨酸血癥、卒中、自身免疫性疾病等；②有PCI治療禁忌證或不接受PCI治療；③心瓣膜病、擴(kuò)張性心肌病、胸主動(dòng)脈瘤；④嚴(yán)重肝、腎功能異常；⑤惡性腫瘤。

本研究所有受試者均簽署了知情同意書，本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-326水平檢測 抽取ACS患者入院24 h內(nèi)、PCI后3 d、7 d空腹肘部靜脈血，采用密度梯度離心法[13]獲取外周血中單個(gè)核細(xì)胞。步驟如下：25 ℃下以800 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，離心半徑為8 cm；取離心后下層沉淀物置入Ficoll分離液中獲取單個(gè)核細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法[14]檢測單個(gè)核細(xì)胞中miR-326水平。步驟如下：取TRIzol試劑加至裝有單個(gè)核細(xì)胞的試管中提取總RNA；檢測總RNA純度(A260/A280在1.8～2.1)后用Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；用PCR儀擴(kuò)增cDNA，擴(kuò)增條件為95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參為U6。miR-326序列F：5′-CCUCUGGGCCCUUCCUCCAG-3′，R：5′-GCTGTCAACGATACGCTACCTA-3′；U6序列F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。用2-DDct計(jì)算miR-326水平。

1.3隨訪及預(yù)后評(píng)價(jià) 采用電話隨訪或門診方式了解ACS患者預(yù)后情況。于ACS患者出院后隨訪，每3個(gè)月隨訪1次，共隨訪3年。本研究將隨訪過程中發(fā)生MACE定義為預(yù)后不良。MACE包括UA、再發(fā)心肌梗死、支架內(nèi)再狹窄、靶血管血運(yùn)重建及全因性死亡等。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和重復(fù)測量的方差分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)分析miR-326評(píng)價(jià)ACS患者預(yù)后的效能。采用Kaplan-Meier繪制高miR-326組和低miR-326組生存曲線，并用Log-Rank法比較差異。采用Cox回歸分析影響ACS患者預(yù)后的因素。采用限制性立方樣條擬合Cox回歸分析miR-326與ACS患者預(yù)后的關(guān)系。應(yīng)用R 3.6.3軟件繪制限制性立方樣條圖。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1ACS患者PCI后預(yù)后情況 205例ACS患者PCI后共有預(yù)后不良66例(32.20%)，其中再發(fā)UA15例(7.32%)，再發(fā)心肌梗死29例(14.15%)，支架內(nèi)再狹窄13例(6.34%)，靶血管再次血運(yùn)重建6例(2.93%)，心源性死亡3例(1.46%)。

2.2兩組miR-326水平比較 根據(jù)ACS患者預(yù)后情況將其分為預(yù)后不良組和預(yù)后良好組。兩組miR-326水平隨時(shí)間進(jìn)展均呈升高趨勢，其組間、時(shí)點(diǎn)間、組間·時(shí)點(diǎn)間交互作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組miR-326水平比較Table 1 Comparison of miR-326 levels between two groups

2.3miR-326評(píng)價(jià)ACS患者預(yù)后的效能 PCI后7 d miR-326診斷ACS患者預(yù)后的ROC曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.886，高于PCI前miR-326和PCI后3 d miR-326診斷ACS患者預(yù)后的ROC AUC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=6.557、5.803，P<0.001)，見圖1，表2。

表2 miR-326評(píng)價(jià)ACS患者預(yù)后的效能Table 2 Efficacy of miR-326 in evaluating the prognosis of ACS patients

圖1 miR-326評(píng)價(jià)ACS患者預(yù)后的ROC曲線

2.4兩組一般資料比較 根據(jù)PCI后7 d miR-326診斷ACS患者預(yù)后的截?cái)帱c(diǎn)將205例ACS患者分高miR-326組(miR-326>0.24)116例和低miR-326組(miR-326≤0.24)89例。兩組在年齡、性別、BMI、高血壓史、高脂血癥史、糖尿病史、ACS家族史、ACS類型、血管病變支數(shù)和病變位置比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 兩組一般資料比較Table 3 Comparison of baseline data between two groups

表3 (續(xù))

2.5兩組生存預(yù)后比較 高miR-326組平均生存時(shí)間為35.52(95%CI：35.06～35.98)個(gè)月，高于低miR-326組[23.72(95%CI：21.44～26.00)個(gè)月]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-Rank χ2=107.902，P<0.001)，見圖2。

圖2 兩組生存曲線

2.6影響ACS患者預(yù)后的因素分析 將ACS患者預(yù)后(預(yù)后良好=0，預(yù)后不良=1)作為因變量，將ACS患者性別(女性=0，男性=1)、年齡(連續(xù)性變量)、BMI(連續(xù)性變量)、高血壓史(無=0，有=1)、高脂血癥史(無=0，有=1)、糖尿病史(無=0，有=1)、ACS家族史(無=0，有=1)、ACS類型(STEMI=1，NSTEMI=2，UA=3)、血管病變支數(shù)(單支=0，多支=1)、病變位置(左主干=1，前降支=2，回旋支=3，右冠狀動(dòng)脈=4)和miR-362(連續(xù)性變量)(PCI后7 d)作為自變量，分別納入Cox單因素回歸分析，結(jié)果顯示ACS家族史和miR-362與ACS患者預(yù)后有關(guān)(P<0.05)。進(jìn)一步將ACS家族史和miR-362作為自變量納入Cox多因素回歸分析，結(jié)果顯示miR-362是ACS患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.05)。見表5～6。

表5 ACS預(yù)后的單因素Cox回歸分析結(jié)果Table 5 Univariate Cox regression analysis results of prognosis of ACS

表6 ACS預(yù)后的多因素Cox回歸分析結(jié)果Table 6 Multivariate Cox regression analysis results of prognosis of ACS

2.7miR-362與ACS患者預(yù)后的關(guān)系 采用限制性立方樣條擬合Cox回歸分析miR-362(PCI后7 d)與ACS患者預(yù)后的關(guān)系。比較不同節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)對(duì)應(yīng)模型的AIC值，確定節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)為4時(shí)，AIC值最小(566.737)。miR-362與ACS患者預(yù)后有關(guān)(χ2=40.17，P<0.001)，且為非線性關(guān)系(χ2=27.33，P<0.001)。以PCI后7 d miR-326診斷ACS患者預(yù)后的截?cái)帱c(diǎn)為參考點(diǎn)，miR-326<0.24時(shí)，與miR-326=0.24比較，預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)升高；當(dāng)miR-326>0.24時(shí)，與miR-326=0.24比較，預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)降低，見圖3。

圖3 miR-362與ACS患者預(yù)后的限制性立方樣條圖

3 討 論

ADAM17作為miR-326的下游靶點(diǎn)，是多種細(xì)胞因子活化裂解的關(guān)鍵酶，參與血管的病理生理過程[15]。ADAM17在冠心病患者動(dòng)脈粥樣硬化斑塊表面高表達(dá)[16]，且可通過裂解腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1、白細(xì)胞介素6等參與血管慢性炎癥反應(yīng)[11,17]?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，筆者推測miR-326調(diào)控ADAM17參與了動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病及血管慢性炎癥反應(yīng)。本研究通過比較ACS患者PCI后外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-326水平，顯示隨時(shí)間進(jìn)展外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-326水平呈上升趨勢，且預(yù)后不良組PCI后3 d、7 d miR-326水平均低于預(yù)后良好組，提示外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-326水平與ACS患者預(yù)后有關(guān)，檢測其水平或可評(píng)價(jià)ACS患者預(yù)后。

以往關(guān)于ACS預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)多為生化指標(biāo)，如C反應(yīng)蛋白、胱抑素C及肌酸激酶同工酶等，上述指標(biāo)在ACS患者預(yù)后評(píng)估中均存在一定不足。何東旭等[18]采用ROC分析C反應(yīng)蛋白評(píng)價(jià)ACS患者預(yù)后的效能，結(jié)果顯示其評(píng)價(jià)預(yù)后的AUC為0.634，效能有限。此外，C反應(yīng)蛋白多在炎癥相關(guān)疾病中高表達(dá)，若評(píng)價(jià)合并炎癥的ACS患者預(yù)后，準(zhǔn)確度難免降低。王革等[19]采用ROC分析了胱抑素C評(píng)價(jià)ACS患者預(yù)后的效能，結(jié)果顯示其評(píng)價(jià)預(yù)后的AUC為0.748，有一定診斷效能，但敏感度和特異度均不高。肌酸激酶同工酶存在于心肌細(xì)胞中，可反映心肌細(xì)胞損傷情況，當(dāng)心肌損傷時(shí)其水平升高，于發(fā)病12～24 h到達(dá)峰值，隨后降低，48～72 h恢復(fù)至正常水平[20]。但由于肌酸激酶同工酶在體內(nèi)水平持續(xù)時(shí)間較短，且其水平與ACS發(fā)病時(shí)間有關(guān)，因此，在ACS預(yù)后評(píng)估中存在一定不足。本研究采用ROC分析了外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-326評(píng)價(jià)ACS患者預(yù)后的價(jià)值，結(jié)果顯示PCI后7 d miR-326評(píng)價(jià)ACS患者預(yù)后的AUC、敏感度和特異度分別為0.886、92.42%和79.86%，說明PCI后7 d miR-326評(píng)價(jià)ACS患者預(yù)后的效能較高，但特異度偏低，可輔助評(píng)價(jià)ACS患者預(yù)后。

為闡明外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-326與ACS患者預(yù)后的關(guān)系，筆者比較了高miR-326組和低miR-326組平均生存時(shí)間，結(jié)果顯示高miR-326組平均生存時(shí)間高于低miR-326組，該結(jié)果進(jìn)一步說明外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-326與ACS患者預(yù)后有關(guān)。本研究Cox回歸分析結(jié)果顯示PCI后7 d miR-362是ACS患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素。此外，限制性立方樣條擬合Cox回歸分析的結(jié)果顯示，當(dāng)miR-326>0.24時(shí)，ACS患者預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)隨其水平增加而降低。筆者認(rèn)為外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-326與ACS患者預(yù)后有關(guān)，可能原因如下：一是高水平miR-326可下調(diào)ADAM17表達(dá)，進(jìn)而抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成，此外，下調(diào)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子水平改善血管慢性炎癥反應(yīng)；二是miR-326-5p可增加內(nèi)皮祖細(xì)胞血管生成能力[21]，當(dāng)急性心肌梗死后，骨髓中內(nèi)皮祖細(xì)胞可進(jìn)入血液循環(huán)[22]，促進(jìn)心肌梗死區(qū)域血管生成，改善心臟功能。

本研究尚存在一定不足：一是作為單中心前瞻性研究，樣本量有限，且存在一定選擇偏倚；二是未開展基礎(chǔ)研究闡明miR-326影響ACS患者預(yù)后的機(jī)制。本課題組下一步將針對(duì)以上不足開展研究，以驗(yàn)證并充實(shí)本研究結(jié)論。

綜上所述，ACS患者PCI后外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-326水平隨時(shí)間進(jìn)展成升高趨勢。外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-326水平與ACS患者預(yù)后有關(guān)，PCI后7 d外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-326水平是ACS患者PCI后發(fā)生MACE的風(fēng)險(xiǎn)因素，檢測其水平可輔助評(píng)價(jià)預(yù)后。