microRNA在HER2陽性乳腺癌曲妥珠單抗耐藥中的研究進展

楊天宇(綜述)，呂雅蕾(審校)

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北 石家莊 050011)

據(jù)統(tǒng)計，乳腺癌是女性第一高發(fā)惡性腫瘤，病死率位居女性腫瘤的第2位[1]。其中15%～20%的乳腺癌患者人表皮生長因子受體2(human epidermal growthfactor receptor 2，HER2)過表達或HER2原癌基因擴增[2]。HER2是一種跨膜糖蛋白，調(diào)控組織細胞增殖和分化，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分組成。其中胞外區(qū)的Ⅱ、Ⅳ結(jié)構(gòu)域分別含有帕妥珠單抗和曲妥珠單抗的結(jié)合位點，二者都可通過與相應(yīng)抗體彼此結(jié)合阻斷二聚體的形成而發(fā)揮抗腫瘤作用?？缒^(qū)由α-螺旋結(jié)構(gòu)組成，胞內(nèi)區(qū)為激酶區(qū)和腺嘌呤核苷三磷酸(adenosinetriphosphate，ATP)結(jié)合位點，通過激酶磷酸化作用參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]，啟動細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，維持細胞的生存和發(fā)育，促進細胞增殖和遷移等。microRNA是一種長度在18～25 nt左右的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，通過調(diào)控至少30%以上的基因表達，參與機體細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等多種生理、病理過程。1993年第1個microRNA被發(fā)現(xiàn)，至今已被發(fā)現(xiàn)1 000多種，它們通過特異性結(jié)合于靶mRNA的3′-UTR區(qū)域，抑制靶mRNA翻譯或直接將其降解，抑制基因表達[4]。microRNA的異常表達影響下游基因、蛋白表達水平及相關(guān)受體突變情況等，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展乃至治療效果中作用顯著，而其對基因或蛋白等受體的調(diào)控可通過激活HER2下游信號通路參與調(diào)控乳腺癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲及曲妥珠單抗耐藥等過程。

1 microRNA-375

王穎懿等[5]對41例乳腺癌患者與41例正常人進行的對照研究證實microRNA-375的表達在癌組織中均較正常組織表達要低。同樣一項針對經(jīng)過病理證實的48例乳腺癌患者的回顧性分析[6]也表明microRNA-375在乳腺癌組織中呈現(xiàn)出顯著低表達，且表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和HER2間存在相關(guān)性。這些都提示microRNA-375可以在一定程度上衡量判斷乳腺癌的預(yù)后及嚴重程度，隨著人們不斷深入的研究，發(fā)現(xiàn)microRNA-375與乳腺癌耐藥性相關(guān)，特別是與HER2陽性乳腺癌曲妥珠單抗耐藥存在緊密聯(lián)系。

1.1上調(diào)胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1，IGF-1R)誘導(dǎo)耐藥 IGF-1R是一種跨膜受體，基因定位于染色體15q25-26，由跨膜的β亞單位與胞外的α亞單位構(gòu)成，在核糖體中完成合成過程，屬于受體酪氨酸激酶。眾所周知，IGF-1R與HER2的下游信號通路相同，可能通過旁路激活磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/AKT/雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin,mTOR)信號傳導(dǎo)通路，從而模擬HER2相關(guān)信號通路的激活，使原本靶向HER2的曲妥珠單抗產(chǎn)生耐藥性[7]。IGF-1R與HER2可相互交聯(lián)形成異二聚體，促進HER2磷酸化，拮抗IGF-1R的作用則有助于恢復(fù)曲妥珠單抗耐藥株的敏感性。另外，IGF-1R、HER3、HER2三者可結(jié)合形成三聚體，激活相關(guān)下游信號，若減少HER3或IGF-1R的表達,，也可增強曲妥珠單抗耐藥株的敏感性，說明IGF-1R信號激活與曲妥珠單抗耐藥關(guān)系密切[8]。乳腺腫瘤細胞中，microRNA-375與其靶基因IGF-1R呈顯著負相關(guān)，高表達的microRNA-375可通過下調(diào)IGF-1R抑制PI3K/AKT信號通路的活化程度，進而抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等生理病理過程；而在曲妥珠單抗耐藥的HER2陽性乳腺癌細胞中，microRNA-375因DNA甲基化和組蛋白去乙酰化發(fā)生表觀遺傳沉默，導(dǎo)致其靶基因IGF-1R的表達水平上調(diào)，進而通過活化PI3K/AKT信號通路誘導(dǎo)乳腺癌細胞產(chǎn)生曲妥珠單抗耐藥性[9]。

1.2調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)參與耐藥過程 EMT是指上皮細胞在某些特定的生理、病理條件下失去上皮表型而轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞的生物學(xué)過程，這一過程伴隨著各種蛋白標志物(如E-cadherin、Vimentin、鋅指/同源域蛋白ZEB1、細胞角蛋白等)的改變與相關(guān)信號通路(如TGF-β、TNF-α/NF-κB、Wnt/β-catenin等)的激活或抑制。EMT對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移、耐藥方面具有重要意義，在誘導(dǎo)曲妥珠單抗耐藥的過程中也發(fā)揮著不可或缺的作用[10]。葉星明等[11]進行的關(guān)于HER2陽性乳腺癌親本敏感細胞株SKBR-3和耐藥細胞株SK-BR-3R對曲妥珠單抗的敏感性的研究顯示，耐藥細胞SK-BR-3R中miR-375、vimentin呈顯著低表達狀態(tài)，而E-cadherin的表達水平明顯上調(diào)；當將miR-375模擬物轉(zhuǎn)染耐藥細胞后，三者的表達水平均發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。預(yù)測并選取異黏蛋白(metadherin,MTDH)基因作為miR-375的靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-375能夠與MTDH miRNA的3′UTR發(fā)生特異性靶向結(jié)合，將特異性針對MTDH基因的siRNA轉(zhuǎn)染到SK-BR-3R中，發(fā)現(xiàn)與miR-375過表達時結(jié)果一致，MTDH表達水平明顯下調(diào)，E-cadherin和vimentin的表達水平均發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。由此可見microRNA-375通過調(diào)控EMT參與HER2陽性乳腺癌曲妥珠單抗耐藥；這一作用可能與靶向調(diào)控MTDH表達有關(guān)。Hu等[12]研究同樣證實，過表達的MTDH與乳腺癌的預(yù)后不良、轉(zhuǎn)移風(fēng)險的增加相關(guān)聯(lián)，表明miR-375可能通過對MDTH的調(diào)節(jié)發(fā)揮與乳腺癌相關(guān)的耐藥作用。

因此，microRNA-375可作為潛在的靶點逆轉(zhuǎn)Trastuzumab在HER2陽性乳腺癌中的耐藥情況。

2 microRNA-21

2.1抑制程序性細胞凋亡因子4(programmed cell death 4，PDCD4)或直接作用于PTEN促進腫瘤進展 多項研究證實，與正常乳腺組織相比，microRNA-21在乳腺癌細胞中呈過表達狀態(tài)[13]。高表達的miRNA-21可通過抑制PDCD4的活性使之失活或表達減少，也可直接作用于PTEN的3′UTR，下調(diào)PTEN的表達，促進乳腺癌細胞的異常增殖、侵襲和遷移[14]。PTEN可特異性催化三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol trisphosphate，PIP3)去磷酸化，降低PIP3的水平，進而負向調(diào)控PI3K/AKT信號通路，抑制細胞的過快生長及分化。而PI3K/AKT通路的持續(xù)活化可有效降低HER-2陽性乳腺癌細胞對曲妥珠單抗的敏感性，因此，PTEN基因缺失或突變被認為是曲妥珠單抗耐藥的標志性事件[15]。

2.2抑制PDCD4或直接作用于PTEN誘導(dǎo)耐藥 Gong等[16]的研究表明，在經(jīng)過體外培養(yǎng)和裸鼠體內(nèi)培養(yǎng)獲得Trastuzumab耐藥的HER2陽性乳腺癌細胞中，miRNA-21都呈現(xiàn)過表達狀態(tài)，同時發(fā)現(xiàn)miRNA-21通過介導(dǎo)PTEN沉默降低PTEN的表達，誘導(dǎo)Trastuzumab耐藥性的產(chǎn)生；當耐藥細胞中的miRNA-21被反義寡核苷酸干擾下調(diào)后，PTEN的表達水平發(fā)生逆轉(zhuǎn)，并且恢復(fù)了對曲妥珠單抗的敏感性。因此上調(diào)miRNA-21可誘發(fā)曲妥珠單抗耐藥。De等[17]也通過相關(guān)體內(nèi)外的研究實驗，顯示miRNA-21可作為HER2陽性乳腺癌中維持上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及構(gòu)造腫瘤免疫微環(huán)境的信號，一旦上調(diào)或異常表達，便會破壞此平衡，導(dǎo)致曲妥珠單抗耐藥，同時證實miRNA-21能夠直接靶向PDCD4和PTEN，介導(dǎo)二者表觀遺傳沉默，尤其是PTEN，很可能是miRNA-21高表達的HER2陽性乳腺癌產(chǎn)生曲妥珠單抗耐藥性的重要機制。

3 microRNA-200c

3.1靶向zeb1/zeb2抑制腫瘤進展 Zeb1(也被稱為δef)和Zeb2(也被稱為sip1)是EMT的兩種主調(diào)控因子，通過直接控制抗轉(zhuǎn)移黏附分子E-鈣黏蛋白的轉(zhuǎn)錄啟動EMT。研究顯示，miRNA-200c可通過抑制ZEB1、ZEB2，恢復(fù)E-鈣黏蛋白的水平，進而通過拮抗EMT的功能，顯著減少乳腺癌細胞的遷移和侵襲，增強乳腺癌細胞對曲妥珠單抗的敏感性[18]。miRNA-200c在乳腺癌中顯著降低，從而使靶標分子ZEB1與ZEB2上調(diào)，進而上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達水平，Zeb1、Zeb2都能夠通過結(jié)合到E-鈣黏蛋白啟動子內(nèi)的兩個二分體E-盒基序啟動EMT，抑制其轉(zhuǎn)錄，最終使腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移力及耐藥性顯著增強。

3.2靶向ZNF217和Zeb1對耐藥產(chǎn)生 作為EMT的主要調(diào)節(jié)器，TGF-β信號在調(diào)節(jié)乳腺癌的惡性表型及耐藥性中發(fā)揮重要作用[19]。在曲妥珠單抗耐藥細胞中檢測到microRNA-200c下調(diào)及TGF-β信號顯著升高，并導(dǎo)致乳腺癌的高侵襲性。在乳腺癌中，miRNA-200c可以直接靶向調(diào)控乳腺癌ZEB1與ZNF217的表達。microRNA-200c下調(diào)，作用于ZNF217，ZNF217上調(diào)自分泌TGF-β，通過轉(zhuǎn)錄激活TGF-β促進EMT，而Zeb1是EMT中TGF-β信號的介導(dǎo)物。TGF-β參與EMT誘導(dǎo)途徑，通過損害上皮黏附蛋白E-鈣黏蛋白的表達或功能觸發(fā)上皮細胞去分化，同時TGF-β信號轉(zhuǎn)錄激活zeb1，導(dǎo)致基因表達譜改變[20]，對microRNA-200c產(chǎn)生反饋抑制作用，從而增加乳腺癌細胞的侵襲性與耐藥程度。通過miRNA microarray篩選同樣顯示miRNA-200c在曲妥珠單抗耐藥乳腺癌細胞中的表達水平顯著降低，并證實了miRNA-200c可以同時提高乳腺癌對曲妥珠單抗的敏感性、降低細胞侵襲和遷移能力、逆轉(zhuǎn)EMT并抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

microRNA-200c的恢復(fù)、ZEB1或ZNF217的沉默或TGF-β信號傳導(dǎo)的阻斷均能提高曲妥珠單抗的敏感性，抑制乳腺癌細胞的侵襲性。

4 microRNA-221

4.1microRNA-221的特征與表達 microRNA-221位于Xp11.3染色體上，屬miRNA-221/222基因家族，和miRNA-222擁有相同的種子序列。多項研究表明miRNA-221在甲狀腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤組織中表達異常增高，且具有癌基因作用[21-22]。強表達的miRNA-221與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。衛(wèi)淑芳等[23]研究顯示乳腺癌患者血漿miRNA-221過表達，其表達水平在治療前后均與腫瘤分期及耐藥呈正相關(guān)。

4.2microRNA-221通過靶向PTEN調(diào)節(jié)曲妥珠單抗耐藥 高表達的miRNA-221不僅可以使乳腺癌細胞對他莫西芬的耐藥性增強，還能夠明顯促進T47D或MCF-7等乳腺癌細胞對多西他賽的耐藥性[24]，同時，miRNA-221也是曲妥珠單抗耐藥性產(chǎn)生過程中的一個關(guān)鍵因素，Ye等[25]針對HER2陽性乳腺癌細胞SK-BR-3進行的體外研究實驗顯示，將miRNA-221前體的重組慢病毒導(dǎo)入SK-BR-3后，miRNA-221傳遞高效、表達增加，轉(zhuǎn)染相應(yīng)的合成抑制劑干擾miRNA-221則使其表達水平顯著下降；當暴露于Trastuzumab時，SK-BR-3因miRNA-221被抑制而大量凋亡，上調(diào)miRNA-221的表達則抑制了SK-BR-3對曲妥珠單抗的敏感性，使其凋亡數(shù)目大大減少。同時在過表達miRNA-221的裸鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了肺部轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)，對照組則未有相關(guān)發(fā)現(xiàn)。因此miRNA-221過表達可有效抑制HER2陽性乳腺癌細胞凋亡，促進其侵襲、轉(zhuǎn)移，并降低其對曲妥珠單抗的敏感性。進一步研究顯示miRNA-221與PTEN的表達呈明顯負相關(guān)，并且PTEN的強表達可顯著抑制miRNA-221誘導(dǎo)的HER2陽性乳腺癌細胞的侵襲，大幅度恢復(fù)了其對Trastuzumab的敏感性。因而上調(diào)miRNA-221可以靶向PTEN參與HER2陽性乳腺癌曲妥珠單抗耐藥性的產(chǎn)生。

5 其他microRNA

葉秋文等[26]采用miRNA-30 d的模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染到HER2過表達和低表達的乳腺癌細胞中，并對細胞中miRNA-30 d、自噬相關(guān)基因Beclin 1和LC 3的表達情況以及曲妥珠單抗耐藥的程度進行分析，結(jié)果表明miRNA-30 d在HER2高表達的乳腺癌細胞中過表達，且能使Beclin 1和LC 3的表達明顯下調(diào)，同時可顯著增強BT474細胞對曲妥珠單抗的敏感性，而轉(zhuǎn)染miRNA-30 d抑制劑降低其表達后，BT474細胞的耐藥性則明顯升高。上述研究結(jié)果證實miRNA-30 d可能通過調(diào)控Beclin 1和LC 3的表達影響赫賽汀耐藥過程的產(chǎn)生。Li等[27]研究顯示，HER2 3′未翻譯區(qū)(3′UTR)所介導(dǎo)的HER3上調(diào)促進乳腺癌細胞的增殖、生長，同時導(dǎo)致HER2陽性乳腺癌患者對Trastuzumab治療的抵抗；含miR-125a/b元件的HER2 3′未翻譯區(qū)可誘導(dǎo)miR-125a/b的解離，下調(diào)HER3 mRNA，從而恢復(fù)癌細胞對Trastuzumab的敏感性。強表達的miRNA-182可能通過靶向抑制下游的FOXO1基因，降低HER2陽性乳腺癌細胞對曲妥珠單抗的敏感性[28]。lncRNA-UCA1通過miR-18a靶向YAP1調(diào)節(jié)乳腺癌Trastuzumab耐藥，其中miR-18a通過抑YAP1和CDK6，促進PTEN表達，進而增強曲妥珠單抗的治療療效[29]。

6 結(jié) 語

microRNA家族中，越來越多的microRNA與HER2陽性乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移和曲妥珠單抗耐藥相關(guān)。作為HER2陽性乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移、曲妥珠單抗耐藥的關(guān)鍵因素，microRNA很可能成為潛在的靶點，為HER2陽性乳腺癌的治療及逆轉(zhuǎn)曲妥珠單抗耐藥提供新方法。而曲妥珠單抗耐藥與microRNA、HER2之間有著密不可分的聯(lián)系，目前已有通過已知的耐藥機制研發(fā)出的關(guān)于逆轉(zhuǎn)乳腺癌曲妥珠單抗耐藥的研究成果(如帕妥珠單抗、T-DM1、依維莫司)應(yīng)用于臨床，并取得一定療效，但仍需進一步探索，開發(fā)出更有效的臨床藥物逆轉(zhuǎn)耐藥。

綜上所述，研究microRNA家族在HER2陽性乳腺癌中的作用及其機制，不僅為HER2陽性乳腺癌患者的治療及靶向藥物研發(fā)提供了理論指導(dǎo)，也為逆轉(zhuǎn)HER2陽性乳腺癌耐藥策略的建立提供科學(xué)依據(jù)。