大鼠陰道重建動物模型的構(gòu)建

張 寧，秦錫靜，張志強(qiáng) ，張敬坤，黃向華*，朱玉林

(1.河北省石家莊市第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，河北 石家莊 050011；2.湖南省常德市湘雅常德醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 常德 415000；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦科，河北 石家莊 050000)

正常陰道缺失是由先天性陰道發(fā)育不良(Mayer-Rokitansky-Küstner-Hauser,MRKH綜合征)或獲得性疾病(例如癌癥和創(chuàng)傷)引起的。為了滿足這些患者生理及心理的需求通常需要陰道重建。重建一個最接近正常陰道形態(tài)和功能的陰道是醫(yī)者遵循的原則和目標(biāo)[1]。陰道重建的方法主要包括非手術(shù)的頂壓法和手術(shù)治療。非手術(shù)治療曾被認(rèn)為是先天性無陰道患者的一線治療，但這種方法能否成功的關(guān)鍵在于患者會陰局部的條件及患者的依從性，需要較長時間的治療才能達(dá)到足夠的長度，治療過程中可能給患者增加較多的心理負(fù)擔(dān)。手術(shù)治療能在短期內(nèi)達(dá)到治療效果也減少了患者的心理負(fù)擔(dān)，因此成為目前常用的治療方法。目前陰道重建最常用的方法是在膀胱和直腸之間造穴再以腹膜，皮瓣，腸管或羊膜等組織重建陰道[2-3]。但是，這些方法均不能很好的重建陰道，使用自體組織會給患者帶來不必要的損傷和并發(fā)癥，異體組織又可能導(dǎo)致排斥反應(yīng)及感染外源性疾病。近年來隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展[4]，各種新型支架材料被應(yīng)用于陰道重建，如脫細(xì)胞真皮基質(zhì)[5]，防粘連膜[6]，脫細(xì)胞小腸黏膜下基質(zhì)[7]等，給陰道重建患者帶來了新的希望，但是何種材料更優(yōu)，各種材料的比較和選擇又給科研工作者及臨床醫(yī)生提出了新的挑戰(zhàn)。陰道重建動物模型的構(gòu)建就顯得尤為重要。本研究用小腸黏膜下基質(zhì)(small intestinal submucosa，SIS)作襯里構(gòu)建大鼠陰道重建動物模型，探討其可能性，并通過檢測相關(guān)指標(biāo)研究重建效果。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑 雌性Sprague-Dawley大鼠[河北省實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證號1403076。許可證號：SCXY(冀)2013-1-003]。免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(Abgent)，廣譜細(xì)胞角蛋白(AE1/AE3)單克隆抗體。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大鼠陰道重建動物模型的構(gòu)建 選擇體重200～250 g的成年雌性Sprague-Dawley大鼠用于陰道重建。1%戊巴比妥鈉(30～50 mg/kg)腹腔注射麻醉后將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上，局部備皮消毒。在陰道黏膜下注入腎上腺素生理鹽水形成水墊，從陰道黏膜和會陰皮膚交界處剪開，牽拉陰道黏膜將陰道黏膜從陰道口向上分離至陰道穹窿處，切除整個陰道，術(shù)中避免尿道和直腸的損傷。將生理鹽水預(yù)濕的SIS(前期實(shí)驗(yàn)制備[8])包裹于模具上并縫合連接處(橡膠管自制管型陰道模具，長度為13 mm，外徑為4 mm，膠管上剪數(shù)個菱形小孔，使模具既有支撐作用又減少對局部組織的壓迫)，置入原陰道處，上端固定于宮頸處，下端縫合于陰道外口。術(shù)后大鼠分籠喂養(yǎng)，術(shù)后3 d內(nèi)腹腔注射抗生素預(yù)防感染。

1.2.2標(biāo)本收集及免疫組織化學(xué)檢測 分別于術(shù)后14 d、1個月、3個月隨機(jī)處死6只大鼠，取出陰道全層進(jìn)行檢測，HE染色，免疫組織化學(xué)SP法檢測重建陰道組織中角蛋白(AE1/AE3 1∶100)，α平滑肌激動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA 1∶800)及神經(jīng)纖維標(biāo)記物-蛋白基因產(chǎn)物(PGP9.5 1∶400)的表達(dá)。4只大鼠于12周處死用于組織浴槽檢測。

1.2.3陰道組織的功能檢測 將6只正常大鼠及4只實(shí)驗(yàn)組大鼠處死后取出整個陰道組織，橫行切取陰道遠(yuǎn)端組織，使切下的組織為寬1～2 mm的環(huán)狀。將環(huán)狀組織連接到組織浴槽的張力傳感器上，浸入含有Krebs溶液的浴槽中(實(shí)驗(yàn)前Krebs溶液用95%O2和5%CO2的混合氣體平衡20～30 min，整個實(shí)驗(yàn)過程中持續(xù)通氣并使液體溫度維持在37 ℃)。組織固定好后調(diào)節(jié)預(yù)負(fù)荷至0.5 g并使其平衡60 min。實(shí)驗(yàn)前用高鉀溶液(124 mmol/L)評估陰道組織的活性，有活性的組織分別給予30 Hz，60 Hz及90 Hz的電場刺激，電壓均為30 V，均持續(xù)0.5 s，觀察陰道組織的張力變化情況。整個實(shí)驗(yàn)控制在取材后6 h之內(nèi)，實(shí)驗(yàn)過程中每15～20 min更換一次Krebs溶液以保證組織的活性。

2 結(jié) 果

2.1重建陰道的組織學(xué)檢測

2.1.1重建陰道巨檢 重建陰道14 d時，質(zhì)地比較韌，沒有彈性，隨時間延長質(zhì)地逐漸變軟，至3個月時明顯變軟，并且有一定的彈性(圖1)。

2.1.2重建陰道的免疫組織化學(xué)結(jié)果

2.1.2.1HE染色及AE1/AE3染色觀察 14 d時HE染色可見有部分上皮樣組織從陰道入口向上爬行，AE1/AE3染色陽性，伴有較多炎細(xì)胞浸潤，1個月時上皮組織能覆蓋整個陰道，3個月時上皮組織更加成熟，基底層可見釘狀突起(箭頭所示)，局部可見角化上皮組織，僅有少量炎細(xì)胞浸潤，與正常陰道組織大致相同(圖2)。

2.1.2.2α-SMA染色觀察 1個月時重建陰道組織中有少量組織表達(dá)α-SMA，提示有平滑肌的再生，3個月時α-SMA表達(dá)增多局部形成束狀，但是再生的平滑肌連續(xù)性欠佳，與正常陰道平滑肌差距明顯(圖3)。

2.1.2.3PGP 9.5染色觀察 直到術(shù)后3個月重建陰道組中才偶見PGP9.5陽性的神經(jīng)組織(圖4)。

2.2重建陰道的功能學(xué)檢測 正常陰道組織在頻率為30，60，90 Hz的電場刺激下收縮強(qiáng)度逐漸增大。重建陰道3個月時在頻率為30，60，90 Hz的電場刺激下有微弱的反應(yīng)，隨頻率增加收縮強(qiáng)度稍增強(qiáng)，但其收縮強(qiáng)度明顯小于正常陰道(圖5)。

3 討 論

陰道重建是滿足無陰道患者生理及心理需求的有效手段。近年來隨著組織工程的發(fā)展，各種新型材料的應(yīng)用，給無陰道患者帶來了新的希望。構(gòu)建陰道重建動物模型篩選最佳材料重建陰道就成為亟待解決的問題。

用于陰道重建的實(shí)驗(yàn)動物有綿羊、中國小型實(shí)驗(yàn)豬、兔子、大鼠和小鼠[9-10]。綿羊和中國小型實(shí)驗(yàn)豬體型較大，適于有初步研究結(jié)果后的進(jìn)一步研究，不適用于初期實(shí)驗(yàn)，小鼠由于其體型太小不利于手術(shù)操作及術(shù)后護(hù)理。大鼠體型適中，其陰道較寬且易與周圍組織分離，便于手術(shù)操作及術(shù)后護(hù)理，更適合于初期實(shí)驗(yàn)。雖然Zhang等[10]亦用大鼠進(jìn)行了陰道重建，但他們是部分陰道切除后的重建，不能很好的模擬臨床上先天性無陰道患者。課題組前期研究進(jìn)行了一些初步的嘗試[11]，能夠順利完成手術(shù)，但術(shù)后陰道模具脫落及閉鎖率較高，僅觀察到術(shù)后1個月，本研究進(jìn)一步改善手術(shù)操作，陰道模具及術(shù)后護(hù)理，使術(shù)后陰道模具脫落及閉鎖率明顯降低，還進(jìn)一步完善了重建陰道的相關(guān)檢測，尤其是組織浴槽對陰道功能的檢測，為支架材料的篩選奠定良好的基礎(chǔ)。

上皮組織是最先再生的組織。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠重建陰道14 d時可見有部分上皮組織從陰道入口向上爬行，1個月時上皮組織能覆蓋整個陰道，3個月時上皮組織進(jìn)一步成熟。平滑肌的再生較慢，術(shù)后3個月時才有少量肌束形成，有研究發(fā)現(xiàn)平滑肌的再生可能是由成纖維細(xì)胞及來自循環(huán)中的干細(xì)胞分化而成，或是由周圍正常組織中的平滑肌細(xì)胞及其祖細(xì)胞遷移而來[12]。神經(jīng)組織再生最慢，術(shù)后3個月重建陰道組中才偶見PGP9.5陽性的神經(jīng)組織。

陰道的收縮性決定了陰道的功能，其收縮的組織學(xué)基礎(chǔ)就是陰道平滑肌。大鼠陰道平滑肌內(nèi)層呈環(huán)行分布，外層呈縱行分布，陰道近端平滑肌層較薄，而遠(yuǎn)端平滑肌層厚度增加，至陰道口水平，環(huán)行平滑肌明顯增厚形成括約肌樣結(jié)構(gòu)。人們使用組織浴槽的方法研究了子宮平滑肌[13]，腸道平滑肌[14]，氣管平滑肌[15]等各種平滑肌的功能，但迄今為止，關(guān)于陰道功能的研究很少，僅少數(shù)學(xué)者用組織浴槽的方法研究了各種藥物對糖尿病動物模型和卵巢切除術(shù)后陰道組織收縮功能及強(qiáng)度變化的影響和內(nèi)源性的肽類對人類陰道組織功能的影響?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，大鼠陰道近端的橫向組織環(huán)和縱向組織條，僅對高鉀溶液(K+124 mmol/L)有微弱的反應(yīng)，而對EFS沒有反應(yīng)或反應(yīng)微弱。只有陰道遠(yuǎn)端的橫向組織環(huán)顯示出可重復(fù)的收縮反應(yīng)，這些組織環(huán)被用于進(jìn)一步研究。因此，選用了陰道遠(yuǎn)端的橫向組織環(huán)來評估重建陰道的功能。

實(shí)驗(yàn)前首先要驗(yàn)證組織的活性，用高鉀溶液(K+124 mmol/L)檢測陰道組織的收縮情況，組織有收縮反應(yīng)說明活性好，可以應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在電場刺激的其他條件不變電壓從5 V增加到100 V時(間隔5 V)，陰道的收縮強(qiáng)度僅輕度增加，在20～30 V時達(dá)到峰值，收縮強(qiáng)度變化不明顯；其他條件不變頻率從10 Hz增加到100 Hz(間隔為10 Hz)，陰道的收縮強(qiáng)度逐漸增加，在80～90 Hz時達(dá)到峰值，收縮強(qiáng)度變化明顯；其他條件不變持續(xù)時間的變化主要影響收縮波波峰的寬度，收縮強(qiáng)度變化不明顯?？傊?，電場刺激的頻率變化對陰道收縮強(qiáng)度的影響最大，因此將電壓固定30 V，持續(xù)時間固定在0.5 s，選擇頻率為30，60和90 Hz的電場刺激來評估陰道的功能。正常陰道組織在頻率為30，60和90 Hz的電場刺激下，收縮強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。重建陰道在頻率為30 Hz的電場刺激下僅有微弱的反應(yīng)，隨頻率增加收縮強(qiáng)度稍增強(qiáng)，與正常陰道組織有類似的變化趨勢，但收縮強(qiáng)度差距明顯。

大鼠陰道重建模型可以從組織學(xué)及功能學(xué)上評估重建陰道的功能，便于各種支架材料間的比較。但是單純應(yīng)用支架材料構(gòu)建陰道仍不能達(dá)到理想的效果，組織工程除了有支架組織外還應(yīng)該復(fù)合合適的種子細(xì)胞，近年研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合種子細(xì)胞后能加速組織的修復(fù)與再生[16]。選擇合適的種子細(xì)胞加速平滑肌的再生，促進(jìn)陰道功能的恢復(fù)將是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

總之，本研究成功構(gòu)建了大鼠陰道重建模型，并應(yīng)用免疫組織化學(xué)及組織浴槽對重建陰道進(jìn)行了組織學(xué)及功能學(xué)研究。借助大鼠陰道重建模型可以評估多種支架材料的用于陰道重建的效果，為進(jìn)一步構(gòu)建更好的重建陰道奠定了基礎(chǔ)。(本文圖見封三)