汪 貞 范德玲 周林軍 古 文 葛海虹 朱 偉
(1.生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所,江蘇 南京 210042;2.生態(tài)環(huán)境部固體廢物與化學(xué)品管理技術(shù)中心,北京 100029)
生態(tài)危害評(píng)估是定性和(或)定量評(píng)估生物體、系統(tǒng)或(亞)種群暴露于化學(xué)物質(zhì)中的潛在危害性,是化學(xué)品生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的首要任務(wù)。生態(tài)危害評(píng)估包括基于單一物種和基于生態(tài)系統(tǒng)兩種尺度的研究[1]。物種敏感度分布曲線(SSD)法是基于單一物種毒性測(cè)試數(shù)據(jù)的生態(tài)危害評(píng)估方法之一,被廣泛用于推導(dǎo)化學(xué)物質(zhì)的環(huán)境質(zhì)量基準(zhǔn)。水生微宇宙技術(shù)是一種通過人工構(gòu)建、模擬水生態(tài)系統(tǒng)組成和過程的試驗(yàn)?zāi)P停ㄟ^開展毒性測(cè)試進(jìn)而評(píng)估外源物質(zhì)進(jìn)入水生環(huán)境后的歸趨和對(duì)生物的危害。早在20世紀(jì)初,很多學(xué)者開始對(duì)微宇宙系統(tǒng)開展一系列研究,分析不同營(yíng)養(yǎng)級(jí)生產(chǎn)者、消費(fèi)者和分解者的關(guān)系,生物豐度和理化性質(zhì)聯(lián)系,種間競(jìng)爭(zhēng)和生物多樣性等,微宇宙技術(shù)已成為歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家化學(xué)品高層次生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要方式之一。
四溴雙酚A是一種大量生產(chǎn)并廣泛應(yīng)用的溴化阻燃劑,據(jù)統(tǒng)計(jì),每年有約12萬t四溴雙酚A及其衍生物為市場(chǎng)所需[2],占總溴化阻燃劑市場(chǎng)的60%左右[3]。四溴雙酚A雖然能以共價(jià)鍵的形式結(jié)合聚合物且不易溶于水,但是未結(jié)合的部分很容易釋放到生態(tài)環(huán)境中[4]。我國(guó)環(huán)渤海地區(qū)、長(zhǎng)江流域、云南洱海、珠江三角洲等水域均有四溴雙酚A檢出,個(gè)別水域檢出質(zhì)量濃度甚至高達(dá)4.77 μg/L[5-8]。四溴雙酚A對(duì)水生生物存在毒性并具有遷移性、持久性和蓄積性等特點(diǎn)[9-10],會(huì)對(duì)環(huán)境造成長(zhǎng)久的污染,更可能通過食物鏈的生物富集性和生物放大作用擴(kuò)散到整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中。國(guó)內(nèi)目前缺乏含有四溴雙酚A的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn),因此針對(duì)四溴雙酚A的綜合生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估難以進(jìn)行。
本研究通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化微宇宙系統(tǒng)試驗(yàn)?zāi)M真實(shí)的生態(tài)環(huán)境來評(píng)估四溴雙酚A在水生環(huán)境中的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。通過微宇宙系統(tǒng)試驗(yàn)得到四溴雙酚A的無顯著效應(yīng)濃度(NOEC),并與采用SSD法[11]推導(dǎo)出的四溴雙酚A在水環(huán)境中的預(yù)測(cè)無效應(yīng)濃度(PNEC)進(jìn)行對(duì)比,探索兩種生態(tài)危害評(píng)估方法的差異性,這對(duì)于提高我國(guó)化學(xué)品危害評(píng)估的系統(tǒng)性和科學(xué)性具有參考價(jià)值,也為我國(guó)開展不同層次的四溴雙酚A環(huán)境危害評(píng)估提供數(shù)據(jù)支持。
Agilent 1290型高效液相色譜(美國(guó)Agilent公司),QTRAP 4500型質(zhì)譜(美國(guó)AB公司),DM2500型光學(xué)顯微鏡(德國(guó)Leica公司),DR2800型分光光度計(jì)(美國(guó)哈希公司),HQ 40d型多參數(shù)水質(zhì)分析儀(美國(guó)哈希公司),2100Q型便攜式濁度分析儀。
四溴雙酚A(分析純),纖維素(生物試劑級(jí)),幾丁質(zhì)(生物試劑級(jí))。試驗(yàn)用到的輪蟲培養(yǎng)基配制參考文獻(xiàn)[12],T82MV培養(yǎng)基配制參考文獻(xiàn)[13],魯哥氏液配制參考文獻(xiàn)[14]。
試驗(yàn)用的6種藻類,包括小球藻(Chlorella)、四尾柵藻(Scenedesmusquadricauda)、萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、羊角月牙藻(Selenastrumcapricornutum)、新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)和鐮形纖維藻(Ankistrodesmusfalcatus),均購自中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫;萼花臂尾輪蟲(Brachionuscalyciflorus)從南京師范大學(xué)引入;中華新米蝦(Neocaridinadenticulatasinensis)購自南京本地市場(chǎng);大型溞(Daphniamagna)由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。所有生物培養(yǎng)方法均參考文獻(xiàn)[12]。
參照美國(guó)材料實(shí)驗(yàn)協(xié)會(huì)(ASTM)的微宇宙技術(shù)導(dǎo)則開展為期63 d的微宇宙試驗(yàn)[13]。在體積5 L的燒杯中裝入200 g石英砂、0.5 g纖維素、0.5 g幾丁質(zhì)和3 L T82MV培養(yǎng)基以構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化微宇宙系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)室溫度維持在20~22 ℃,光照約為3 000 lux,明暗周期為12 h∶12 h。試驗(yàn)第0天加入6種藻類,每種藻類初始細(xì)胞濃度為104個(gè)/mL,第4天加入大型溞16只、萼花臂尾輪蟲90只和中華新米蝦12只。試驗(yàn)第7天,根據(jù)溶解氧(DO)、pH、大型溞數(shù)量等指標(biāo)剔除差異較大的微宇宙系統(tǒng),向穩(wěn)定的微宇宙系統(tǒng)中分別加入80.00、400.00、2 000.00、10 000.00 μg/L四溴雙酚A,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(ck組),每個(gè)處理做6個(gè)平行取平均值。
試驗(yàn)第7天開始,每周兩次測(cè)定微宇宙系統(tǒng)pH、葉綠素a和物種豐度等參數(shù),四溴雙酚A濃度每周測(cè)定1次。DO每周測(cè)定2次,每次測(cè)定記錄3次DO數(shù)據(jù),分別為早上光周期開始前、下午光周期結(jié)束前以及第2天光周期開始前,計(jì)算微宇宙系統(tǒng)光合作用產(chǎn)氧量以及呼吸作用耗氧量,計(jì)算式分別見式(1)、式(2)。試驗(yàn)期間每周向微宇宙系統(tǒng)加入輪蟲培養(yǎng)液1滴(約0.05 mL)、6種藻的混合液10 mL(每種藻的接種細(xì)胞濃度均為104個(gè)/mL)以補(bǔ)充取樣損失,根據(jù)需要加入大型溞和中華新米蝦使其在每個(gè)微宇宙系統(tǒng)內(nèi)的數(shù)量保持在3只以上。當(dāng)某物種全部死亡后,不再另行補(bǔ)充。
P=DO2-DO1
(1)
R=DO2-DO3
(2)
式中:P為微宇宙系統(tǒng)光合作用產(chǎn)氧量,mg/L;R為微宇宙系統(tǒng)呼吸作用耗氧量,mg/L;DO1、DO2、DO3分別為早上光周期開始前、下午光周期結(jié)束前以及第2天光周期開始前微宇宙系統(tǒng)的DO質(zhì)量濃度,mg/L。
水質(zhì)指標(biāo):DO、pH采用哈希HQ 40d型多參數(shù)水質(zhì)分析儀測(cè)定;葉綠素a采用分光光度法測(cè)定;濁度采用濁度分析儀測(cè)定。
物種豐度:中華新米蝦、大型溞豐度采用抽樣肉眼計(jì)數(shù);取攪拌均勻的微宇宙水樣用魯哥氏液固定,在顯微鏡下用浮游生物計(jì)數(shù)板對(duì)萼花臂尾輪蟲、藻類進(jìn)行計(jì)數(shù)。
四溴雙酚A濃度測(cè)定:取10 mL水樣離心后取其上清液過0.45 μm濾膜,采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定[15]。
根據(jù)試驗(yàn)期間四溴雙酚A濃度變化,采用時(shí)間加權(quán)計(jì)算微宇宙系統(tǒng)四溴雙酚A平均暴露濃度[16];物種豐度數(shù)據(jù)和理化指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后,用單因素方差分析和Dunnett’s檢驗(yàn)確定空白對(duì)照組與處理組差異的顯著性。引起顯著性差異的濃度為最低可觀察效應(yīng)濃度(LOEC),比LOEC小的上一級(jí)濃度視為無顯著效應(yīng)濃度(NOEC),最后以各采樣時(shí)間點(diǎn)的最敏感NOEC作為系統(tǒng)整體水平的NOEC。
采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析與差異顯著性檢驗(yàn)。
2.1.1 四溴雙酚A在微宇宙系統(tǒng)中的暴露濃度
由于四溴雙酚A在水中的溶解度較低,微宇宙系統(tǒng)中浮游植物和懸浮顆粒物能有效吸附疏水性四溴雙酚A,浮游動(dòng)物也能通過消化道和體表對(duì)其進(jìn)行吸收,加上其自身的可降解性,試驗(yàn)期間四溴雙酚A處理組的暴露濃度均逐漸減小(見圖1),通過對(duì)初始質(zhì)量濃度為80.00、400.00、2 000.00、10 000.00 μg/L的四溴雙酚A進(jìn)行時(shí)間加權(quán)平均運(yùn)算,得到微宇宙系統(tǒng)水體中四溴雙酚A的平均質(zhì)量濃度分別為10.80、55.11、259.42、1 356.61 μg/L,下文中四溴雙酚A在微宇宙系統(tǒng)中暴露濃度均用時(shí)間加權(quán)平均濃度表示。
圖1 微宇宙系統(tǒng)中四溴雙酚A變化趨勢(shì)Fig.1 Trend of tetrabromobisphenol A measured in microcosms
2.1.2 微宇宙系統(tǒng)中DO和pH的變化
試驗(yàn)過程中,微宇宙系統(tǒng)光合作用產(chǎn)氧量、呼吸作用耗氧量、光合呼吸比率(P/R)及pH變化見圖2。顯著性分析結(jié)果表明,各四溴雙酚A處理組及與ck組之間的光合作用產(chǎn)氧量、呼吸作用耗氧量均無明顯差異,第30天時(shí),各微宇宙系統(tǒng)的呼吸作用耗氧量均達(dá)到最低值,此后一周內(nèi),呼吸作用耗氧量又逐漸回升。光合呼吸比率可用于評(píng)價(jià)微宇宙系統(tǒng)能量流動(dòng)方向,本研究構(gòu)建的微宇宙系統(tǒng)光合呼吸比率基本保持在1以下,說明系統(tǒng)內(nèi)呼吸作用耗氧量大于光合作用產(chǎn)氧量,能量大多向較高營(yíng)養(yǎng)級(jí)的大型溞、萼花臂尾輪蟲及中華新米蝦方向流動(dòng)。
圖2 微宇宙DO和pH變化Fig.2 Dynamics of DO and pH in microcosms
pH可以反映微宇宙系統(tǒng)內(nèi)生態(tài)系統(tǒng)種群的代謝情況。試驗(yàn)過程中,各微宇宙系統(tǒng)的pH均在6.5~9.5波動(dòng),顯著性分析結(jié)果表明,4個(gè)四溴雙酚A處理組與ck組的pH沒有顯著性差異,表明四溴雙酚A沒有顯著擾亂微宇宙系統(tǒng)中生物種群的正常代謝。
2.1.3 微宇宙系統(tǒng)濁度和葉綠素a的變化
微宇宙系統(tǒng)濁度與葉綠素a的變化見圖3。濁度可以反映微宇宙系統(tǒng)水體中顆粒物含量,與藻細(xì)胞濃度以及各種生物的代謝產(chǎn)物濃度有關(guān)。試驗(yàn)中各微宇宙系統(tǒng)的濁度變化趨勢(shì)相近,統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明,四溴雙酚A處理組與ck組的濁度沒有顯著性差異。葉綠素a反映了微宇宙系統(tǒng)內(nèi)藻類生物量的變化。試驗(yàn)前28天,各微宇宙系統(tǒng)的葉綠素a變化幅度較小,28 d后葉綠素a變化幅度較大。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明,除個(gè)別暴露時(shí)間點(diǎn)外,四溴雙酚A處理組與ck組的葉綠素a沒有顯著性差異。
圖3 微宇宙系統(tǒng)濁度和葉綠素a的變化Fig.3 Dynamics of turbidity and chlorophyll a in microcosms
2.2.1 浮游動(dòng)物豐度變化
微宇宙系統(tǒng)浮游動(dòng)物豐度變化見圖4。由圖4(a)可見,四溴雙酚A處理組的大型溞豐度變化與ck組總體比較相似,且大型溞豐度與四溴雙酚A的暴露濃度沒有明顯的相關(guān)性,高濃度暴露組(259.42、1 356.61 μg/L)大型溞豐度在28 d后均高于低濃度暴露組(10.80、55.11 μg/L)及ck組,這可能與中華新米蝦豐度變化有關(guān)。數(shù)據(jù)顯著性分析結(jié)果也表明,四溴雙酚A處理組與ck組大型溞豐度變化沒有顯著差異。
由圖4(b)可知,試驗(yàn)第4~28天,各微宇宙系統(tǒng)中的萼花臂尾輪蟲豐度均處于較低水平,28 d后,ck組萼花臂尾輪蟲豐度開始逐漸升高,四溴雙酚A處理組的萼花臂尾輪蟲豐度在試驗(yàn)第49~63天均顯著下降??傮w看來,萼花臂尾輪蟲豐度并未隨四溴雙酚A暴露濃度的升高而出現(xiàn)規(guī)律性變化。
圖4 微宇宙系統(tǒng)大型溞、萼花臂尾輪蟲以及中華新米蝦的豐度變化Fig.4 Changes of daphnia,rotifer and shrimp abundances in microcosms
由圖4(c)可知,四溴雙酚A處理組中華新米蝦豐度急劇減少,在試驗(yàn)第7~14天一直處于下降趨勢(shì),第38~63天,中華新米蝦豐度基本穩(wěn)定。微宇宙系統(tǒng)的中華新米蝦豐度變化存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系,四溴雙酚A暴露濃度越高,中華新米蝦受到的影響越大,死亡率越高。
2.2.2 浮游植物豐度變化
微宇宙系統(tǒng)總藻豐度變化見圖5。由圖5可見,試驗(yàn)第0~7天所有微宇宙系統(tǒng)的總藻豐度均呈指數(shù)增長(zhǎng),隨后總藻豐度在生態(tài)系統(tǒng)中的捕食者和四溴雙酚A的相互作用下呈現(xiàn)波動(dòng)變化。試驗(yàn)后期(第49~63天),各微宇宙系統(tǒng)的總藻豐度均有不同程度的下降,這可能與大型溞和中華新米蝦的種群豐度穩(wěn)定有關(guān)。四溴雙酚A處理組與ck組相比,總藻豐度沒有顯著差異。
圖5 微宇宙系統(tǒng)總藻豐度變化Fig.5 Changes of total algae species abundances in microcosms
參照ASTM的微宇宙技術(shù)導(dǎo)則,以不同物種的豐度以及理化指標(biāo)作為生態(tài)危害效應(yīng)的終點(diǎn),對(duì)四溴雙酚A處理組和ck組在不同暴露時(shí)間點(diǎn)的物種豐度和理化指標(biāo)進(jìn)行顯性方差分析,結(jié)果見表1。整個(gè)微宇宙系統(tǒng)存在一條4個(gè)營(yíng)養(yǎng)級(jí)的食物鏈(藻類-萼花臂尾輪蟲-大型溞-中華新米蝦),其中中華新米蝦作為頂級(jí)捕食者在暴露初期(14~28 d)的LOEC一直維持最高水平(1 356.61 μg/L),與ck組相比,中華新米蝦豐度顯著下降,說明四溴雙酚A的毒性作用是影響中華新米蝦豐度的關(guān)鍵因素。在不同暴露時(shí)間點(diǎn)、不同四溴雙酚A暴露濃度下,大型溞豐度與ck組均未出現(xiàn)顯著差異,說明大型溞受四溴雙酚A毒性影響較小。此外,高pH可能減少四溴雙酚A對(duì)大型溞的毒性[17]。萼花臂尾輪蟲的豐度變化與大型溞和中華新米蝦均不相同,具體表現(xiàn)在LOEC在第49~56天維持在55.11 μg/L,在此階段四溴雙酚A處理組的中華新米蝦、大型溞豐度與ck組相比均未發(fā)生顯著增減,萼花臂尾輪蟲豐度卻出現(xiàn)顯著下降,這可能是微宇宙系統(tǒng)試驗(yàn)后期四溴雙酚A濃度降低促使大型溞豐度回升,影響了萼花臂尾輪蟲種群恢復(fù),在試驗(yàn)第63天LOEC下降至10.80 μg/L,表明四溴雙酚A的生物毒性也會(huì)導(dǎo)致萼花臂尾輪蟲豐度顯著減少。藻類作為生產(chǎn)者也受到類似的捕食壓力,試驗(yàn)第7天四溴雙酚A處理組藻類豐度與ck組沒有顯著差異。四尾柵藻、羊角月牙藻和鐮形纖維藻均為藻類中的優(yōu)勢(shì)種群且對(duì)四溴雙酚A的暴露具有較高抗性,所以在各暴露時(shí)間結(jié)點(diǎn)均未觀測(cè)到與ck組的顯著差異,優(yōu)勢(shì)種群的主導(dǎo)地位使得其余藻類的變化不明顯。當(dāng)大型溞和中華新米蝦種群處于穩(wěn)定期,羊角月牙藻豐度出現(xiàn)顯著下降,羊角月牙藻在第42、56天的LOEC為259.42 μg/L,可能是受到捕食脅迫作用導(dǎo)致。總藻豐度在不同暴露時(shí)間點(diǎn)、不同四溴雙酚A暴露濃度下與ck組間差異均不顯著,表明四溴雙酚A化學(xué)暴露對(duì)藻類的影響較小。葉綠素a受到藻類豐度影響明顯,但葉綠素a在試驗(yàn)第21天的LOEC為1 356.61 μg/L,葉綠素a濃度顯著升高,這可能是由于捕食者大量減少導(dǎo)致,后續(xù)試驗(yàn)期間各四溴雙酚A處理組的葉綠素a均未出現(xiàn)連續(xù)的顯著變化,因此認(rèn)為葉綠素a受藻類豐度和捕食者壓力的共同作用影響。
表1 物種豐度以及理化指標(biāo)在不同暴露時(shí)間點(diǎn)的LOEC1)
從理化指標(biāo)來看,由于微宇宙系統(tǒng)的穩(wěn)定性,pH在整個(gè)試驗(yàn)過程中均保持在穩(wěn)定的水平,說明微宇宙系統(tǒng)內(nèi)部化學(xué)變化較小。pH在多營(yíng)養(yǎng)級(jí)系統(tǒng)比單一營(yíng)養(yǎng)級(jí)系統(tǒng)的波動(dòng)小[18],說明生物的多樣性(浮游動(dòng)物和植物)對(duì)水體的pH有一定的緩沖作用。P/R在第42天的LOEC為1 356.61 μg/L,P/R顯著下降,說明微宇宙系統(tǒng)中藻類作為生產(chǎn)者其光合作用產(chǎn)氧量不及消費(fèi)者(大型溞、萼花臂尾輪蟲和中華新米蝦等浮游動(dòng)物)的呼吸耗氧量,但是從整個(gè)試驗(yàn)周期來看,未發(fā)生兩個(gè)或兩個(gè)以上連續(xù)暴露時(shí)間的P/R顯著變化,可見四溴雙酚A作為外源污染物沒有明顯干擾微宇宙系統(tǒng)種群間的能量交換。
文獻(xiàn)[11]利用SSD法推導(dǎo)出的四溴雙酚A的PNEC為42.9 μg/L。本研究根據(jù)微宇宙系統(tǒng)試驗(yàn)各指標(biāo)的綜合評(píng)估,得出四溴雙酚A在7~56 d的NOEC為10.80 μg/L,63 d的NOEC低于10.80 μg/L。與基于單物種毒性試驗(yàn)得出的PNEC(42.9 μg/L)相比低約75%。可見,根據(jù)SSD法估算出的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)值與模擬生態(tài)環(huán)境下實(shí)際NOEC值存在較大的差距。
水生態(tài)危害評(píng)估方法中,微宇宙系統(tǒng)和基于單一物種的SSD法所估算出的生態(tài)危害濃度并不存在簡(jiǎn)單的外推關(guān)系[12]。微宇宙系統(tǒng)試驗(yàn)?zāi)芴峁㏒SD法所不能實(shí)現(xiàn)的物種間關(guān)系的代謝變化、暴露于化學(xué)物質(zhì)的內(nèi)部水環(huán)境和物質(zhì)間的因果關(guān)系等信息,但仍存在可重復(fù)性差和龐雜數(shù)據(jù)合理分析不足等弊端。利用微宇宙系統(tǒng)的方法估計(jì)四溴雙酚A的生態(tài)危害性,通過不同營(yíng)養(yǎng)級(jí)構(gòu)成的小型生態(tài)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)區(qū)域或整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的危害評(píng)估,直觀地反映生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)各因子相互作用的結(jié)果,可以對(duì)基于SSD法所估算出四溴雙酚A的PNEC進(jìn)行互補(bǔ)與對(duì)比,為四溴雙酚A水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)制定提供數(shù)據(jù)支持。
(1) 四溴雙酚A微宇宙系統(tǒng)中,pH基本保持穩(wěn)定,沒有顯著性變化,P/R值總體小于1。四溴雙酚A的化學(xué)暴露是影響中華新米蝦豐度的關(guān)鍵因素,但其對(duì)藻類、大型溞、萼花臂尾輪蟲的影響不顯著。
(2) 通過對(duì)微宇宙系統(tǒng)中物種豐度,系統(tǒng)理化指標(biāo)等的觀察分析,得到微宇宙系統(tǒng)7~56 d的NOEC為10.80 μg/L,63 d的NOEC低于10.80 μg/L,低于基于單物種毒性試驗(yàn)得出的PNEC(42.9 μg/L),產(chǎn)生差異的原因可能是微宇宙系統(tǒng)的種間競(jìng)爭(zhēng)和各營(yíng)養(yǎng)級(jí)在不同介質(zhì)中的交互作用的影響。
(3) 利用微宇宙系統(tǒng)評(píng)估四溴雙酚A的生態(tài)危害性,通過不同營(yíng)養(yǎng)級(jí)構(gòu)成的小型生態(tài)系統(tǒng)能夠更直觀地反映生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)各因子相互作用的結(jié)果,為四溴雙酚A水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)制定提供數(shù)據(jù)支持。