STING-Caspase-1信號通路對創(chuàng)傷性顱腦損傷大鼠認(rèn)知功能障礙的作用

齊曼曼?王旭鵬?李妍?孫文波

【摘要】目的 探討干擾素基因刺激蛋白（STING）-半胱天冬酶（Caspase-1）信號通路在顱腦創(chuàng)傷致大鼠認(rèn)知功能障礙中的作用。方法 將48只清潔級雄性SD大鼠隨機分為4組，假手術(shù)組（S組）、模型組（M組）、STING抑制劑C-176組（C組）和STING激動劑ADU-s100組（A組）各12只。通過重物自由落體撞擊硬腦膜法建立創(chuàng)傷性顱腦損傷（TBI）模型。M組、C組和A組大鼠建立TBI模型后，C組和A組分別經(jīng)腹腔注射C-176 10 mg/kg和ADU-s100 10 mg/kg。S組只行骨瓣開窗術(shù)。建模后第7日行Morris水迷宮測試評估大鼠認(rèn)知功能，然后處死大鼠取其海馬組織，采用免疫熒光法測定STING/膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、活化Caspase-1/Neuron表達情況。結(jié)果 與S組比較，M組、C組和A組大鼠Morris水迷宮測試的潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少，目標(biāo)象限停留時間縮短，STING/GFAP、活化Caspase-1/Neuron陽性率上調(diào)（P均< 0.05）。與C組比較，M組、A組大鼠潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少，目標(biāo)象限停留時間縮短，STING/GFAP、活化Caspase-1/Neuron陽性率上調(diào)（P均< 0.05）。與A組比較，M組大鼠潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增加，目標(biāo)象限停留時間延長，STING/GFAP、活化Caspase-1/Neuron陽性率G下調(diào)（P均< 0.05）。結(jié)論 STING-Caspase-1信號通路可能參與了TBI中認(rèn)知功能障礙的病理生理過程。

【關(guān)鍵詞】干擾素基因刺激蛋白;創(chuàng)傷性顱腦損傷;認(rèn)知功能;細(xì)胞焦亡;大鼠;

Morris水迷宮測試

Effect of STING-Caspase-1 signaling pathway on cognitive impairment induced by traumatic brain injury in rat models Qi Manman， Wang Xupeng， Li Yan， Sun Wenbo. Department of Anesthesiology， Cangzhou Central Hospital， Cangzhou 061000， China

Corresponding author， Sun Wenbo， E-mail： 15103172838@ 139. com

【Abstract】Objective To explore the role of stimulator of interferon genes （STING）-Caspase-1 signaling pathway on cognitive impairment induced by traumatic brain injury （TBI） in rat models. Methods Forty-eight clean grade healthy male SD rats were randomly and evenly divided into the sham-operation group （S group）， model group （M group）， C-176 group （C group） and ADU-s100 group （A group）. TBI rat models were established by using a weight-drop head injury method. After the establishment of TBI rat models， C-176 （10 mg/kg） and ADU-s100 （10 mg/kg） were injected intraperitoneally in the C and A groups. Bone flap fenestration alone was performed in the S group. At 7 d after the model was established， Morris water maze was performed to assess the cognitive ability of rats. Then， the rats were sacrificed and the hippocampus was taken. Immunofluorescent staining was used to determine the expression levels of STING/glial fibrillary acidic protein （GFAP） and cleaved-Caspase-1/Neuron. Results Compared with the S group， the latency was significantly prolonged， the number of passing the platform was remarkably reduced， the time of stay in the target quadrant was considerably shortened， and the positive rates of STING/GFAP and cleaved-Caspase-1/Neuron were significantly up-regulated in the M， C and A groups （all P < 0.05）. Compared with the C group， the latency was significantly prolonged， the number of passing the platform was remarkably reduced， the time of stay in the target quadrant was considerably shortened， and the positive rates of STING/GFAP and cleaved-Caspase-1/Neuron were significantly up-regulated in the M and A groups （all P < 0.05）. Compared with the A group， the latency was significantly shortened， the number of passing the platform was remarkably increased， the time of stay in the target quadrant was considerably prolonged， and the positive rates of STING/GFAP and cleaved-Caspase-1/Neuron were significantly down-regulated in the M group （all P < 0.05）. Conclusion STING-Caspase-1 signaling pathway is probably involved with the pathophysiological process of cognitive impairment induced by TBI in rat models.

【Key words】Stimulator of interferon genes;Traumatic brain injury;Cognitive function;Pyroptosis;

Rat;Morris water maze

創(chuàng)傷性顱腦損傷（TBI）是一種常見的、預(yù)后不良的意外傷害，近幾年發(fā)生率不斷攀高[1-2]。認(rèn)知功能障礙是TBI后常見并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[3-4]。TBI的病理生理過程非常復(fù)雜，半胱天冬酶-1（Caspase-1）介導(dǎo)的炎性反應(yīng)是細(xì)胞焦亡的經(jīng)典途徑，也是TBI發(fā)生發(fā)展的重要機制之一[5-6]。

Abdullah等[7]的研究表明，干擾素基因刺激蛋白（STING）信號通路的激活參與了TBI模型的腦損傷過程，并引起神經(jīng)細(xì)胞焦亡。STING信號通路作為胞內(nèi)感受器，其下游產(chǎn)物參與了多種炎癥反應(yīng)。但STING信號通路是否通過介導(dǎo)細(xì)胞焦亡進而調(diào)控TBI后海馬組織的炎性反應(yīng)尚未清楚。本課題組擬探討STING-Caspase-1信號通路對TBI大鼠認(rèn)知功能的作用。

材料與方法

一、動物選擇及分組

清潔級健康雄性SD大鼠48只，9 ～ 10周齡，350 ～ 400 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[許可證號：SYXK（京）2012-0036]。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組（S組）、模型組（M組）、STING抑制劑C-176組（C組）和STING激動劑ADU-s100組（A組）各12只。對M組、C組和A組大鼠建立TBI模型。參考文獻[8-9]，C組和A組建模后分別于腹腔注射C-176 10 mg/kg（上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司）和ADU-s100 10 mg/kg（上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司）。S組只行骨瓣開窗術(shù)。本研究符合動物實驗倫理規(guī)范，通過滄州市中心醫(yī)院倫理委員會審批[2020-006-01（Z）]。

二、TBI模型建立

于6% ～ 8%濃度的七氟烷下對大鼠進行麻醉誘導(dǎo)，采用面罩下自主呼吸吸入七氟烷（3% ～ 4%）和空氣（1 L/min）的方式進行麻醉維持。將大鼠俯臥固定于鋪有溫毯的操作臺上，設(shè)定溫毯加熱溫度為38℃，對其進行體溫監(jiān)測及心電監(jiān)測（上海玉研科學(xué)儀器有限公司，型號：XMTF-7000）。對大鼠作以下處理，頭部皮膚消毒，鋪巾，取正中切口并暴露頂骨，在前囟點后3.0 mm，中線右側(cè)1.5 mm處開直徑為6 mm的骨窗并保持硬膜完整。隨后固定于立體定位儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）上，將墊片（r = 2.5 mm）置于硬膜上，取20 g砝碼于25 cm高度自由落體式撞擊墊片上方撞桿，撞擊處腫脹而硬膜不破裂為TBI模型成功。用骨蠟封閉骨瓣，雙極電刀（武漢春光醫(yī)療美容儀器有限公司，型號：CHR-V）止血，縫合皮膚。

三、檢測指標(biāo)

1.采用Morris水迷宮測試評估空間記憶能力

進行Morris水迷宮測試前6 d為訓(xùn)練期。把實驗平臺置于水下1 cm，將大鼠面朝池壁隨機放于水中任一象限內(nèi)，當(dāng)大鼠找到平臺后，允許其在平臺上休息30 s，并記錄大鼠搜索平臺所用時間，即潛伏期。如果在90 s內(nèi)找不到平臺，將其放置在平臺上休息30 s，記錄搜索平臺的時間為90 s。確保所有象限在1 d內(nèi)使用1次。第7 日為記憶期。第8日進行測試，移除平臺，將大鼠面朝池壁隨機放于水中任一象限。采用動物行為視頻分析系統(tǒng)（上海吉量軟件科技有限公司）跟蹤記錄大鼠的潛伏期、運動軌跡和穿越平臺次數(shù)，并分析其空間記憶能力。

2.采用免疫熒光法測定STING/膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、活化Caspase-1/Neuron表達

結(jié)束Morris水迷宮測試后于七氟烷深麻醉下處死大鼠，經(jīng)主動脈灌注40 g/L多聚甲醛后，取其腦組織并在10% 多聚甲醛中固定48 h，隨后進行石蠟切片。將切片放入10 mmol/L檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中煮沸10 min，于常溫下用0.3% Trion孵育20 min，加入免疫封閉液于37℃溫箱內(nèi)孵育1 h，

分別滴加兔多克隆抗體STING（稀釋度1∶500，Abcam公司）和小鼠單克隆抗體GFAP（稀釋度1∶500，上海碧云天生物技術(shù)有限公司），兔單克隆抗體活化Caspase-1（稀釋度1∶500，Abcam公司）和小鼠單克隆抗體Neuron（稀釋度1∶500，Abcam公司）一抗，于4 ℃孵育箱中過夜，然后分別加入Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG（稀釋度1∶200，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）和FITC標(biāo)記山羊抗小鼠（稀釋度1∶200，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）37℃孵育1 h。滴加DAPI（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）后封片，于熒光顯微鏡（廣州明美電子有限公司）下觀察并計數(shù)，計算STING-Cy3/GFAP-FITC/DAPI、活化Caspase-1-Cy3/Neuron-FITC/DAPI三陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞的百分比，計數(shù)5個高倍視野取平均值。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)，正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、Morris水迷宮測試結(jié)果

Morris水迷宮測試結(jié)果顯示，與S組比較，M組、C組和A組大鼠潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少，目標(biāo)象限停留時間縮短;與C組比較，M組、A組大鼠潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少，目標(biāo)象限停留時間縮短;與A組比較，M組大鼠潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增多，目標(biāo)象限停留時間延長（P均< 0.05）;4組大鼠游泳速度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），見表1、圖1。

二、海馬組織STING和活化Caspase-1表達的比較

與S組比較，M組、C組和A組大鼠的海馬組織STING/GFAP、活化Caspase-1/Neuron陽性率上調(diào);與C組比較，M組、A組大鼠的海馬組織STING/GFAP、活化Caspase-1/Neuron陽性率上調(diào);與A組比較，M組大鼠的海馬組織STING/GFAP、活化Caspase-1/Neuron陽性率下調(diào)（P均< 0.05），見表2與圖2、3。

討論

嚴(yán)重的創(chuàng)傷應(yīng)激以及神經(jīng)細(xì)胞的損傷可致TBI患者出現(xiàn)嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙和明顯的精神問題[10]。本研究組通過重物自由落體撞擊硬腦膜法制備TBI模型，此法由于去除了顱骨，可避免因顱骨的差異性導(dǎo)致的損傷差異，當(dāng)重物砸下時，完整的硬腦膜分散了沖擊力，形成彌漫性腦損傷而不至于使損傷太過嚴(yán)重，提高了大鼠的生存率[11]。Morris水迷宮測試作為神經(jīng)行為學(xué)經(jīng)典實驗，可反映大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力[12]。本研究結(jié)果表明，TBI大鼠海馬組織代謝紊亂，空間記憶能力下降，提示海馬組織受損并伴有認(rèn)知功能障礙進而說明TBI模型制備成功。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是哺乳動物大腦內(nèi)分布最廣泛的一類細(xì)胞，也是膠質(zhì)細(xì)胞中體積最大的一種[13]。以往的觀點是星形膠質(zhì)細(xì)胞只是起到支持作用，而不直接參與行為調(diào)節(jié)和學(xué)習(xí)記憶過程。近年來，科學(xué)家們開始仔細(xì)研究星形膠質(zhì)細(xì)胞的各種潛在作用，發(fā)現(xiàn)其可調(diào)節(jié)葡萄糖代謝，維持線粒體穩(wěn)定，促進學(xué)習(xí)記憶[14]。亦有研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞可以通過STING通路參與神經(jīng)元的炎性反應(yīng)進而介導(dǎo)各種精神疾病的病理生理過程[15]。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物，GFAP升高是中樞神經(jīng)系統(tǒng)對損傷作出反應(yīng)的標(biāo)志性信號[16]。

環(huán)狀鳥苷酸腺苷合酶（cGAS）-STING信號通路即是胞質(zhì)DNA（細(xì)胞死亡后，核中DNA進入胞質(zhì)中）與cGAS結(jié)合后傳遞至第二信使環(huán)化二核苷酸（cGAMP），二聚體的STNG與cGAMP結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象改變，再通過一系列反應(yīng)，募集TANK結(jié)合激酶1蛋白，進而磷酸化并激活干擾素調(diào)節(jié)因子和核因子活化B細(xì)胞κ輕鏈增強子，后者誘導(dǎo)了I型干擾素并激活了Caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡[17-18]。Caspase-1具促炎性，其催化活性受到炎性體依賴于信號的自身激活作用的嚴(yán)格調(diào)控[19]。依賴于炎性體的Caspase-1活化所致的具有高度炎性特征的細(xì)胞死亡即為細(xì)胞焦亡。細(xì)胞焦亡是一把雙刃劍，其在消滅病原體的同時，過度免疫反應(yīng)也會誘發(fā)多種自身免疫[20-21]。

本研究結(jié)果表明，TBI后大鼠出現(xiàn)認(rèn)知障礙，同時伴有SING/GFAP、活化Caspase-1/GFAP表達上調(diào);當(dāng)加入STING激動劑后大鼠死亡率增加，認(rèn)知功能障礙加重，SING/GFAP、活化Caspase-1/GFAP表達上調(diào)顯著;當(dāng)加入STING抑制劑后，大鼠認(rèn)知功能改善，SING/GFAP、活化Caspase-1/GFAP表達下調(diào)，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞可能通過STING-Caspase-1通路參與了TBI模型中認(rèn)知功能障礙的病理生理過程。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2020-11-29）

（本文編輯：洪悅民）