miR-423-5p在牛肌肉組織中表達及其靶基因預測

陳 雯，張偉偉，2，*，邵淑麗，2，付學鵬，2，黃 鑫，2，李 鐵，2

(1.齊齊哈爾大學 生命科學與農(nóng)林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

MicroRNA(miRNA)，一種非編碼小分子RNA，其長度普遍為21～25個堿基。 這種小RNA廣泛存在于各種真核生物中，并具有較高的保守性。miRNA主要通過促進靶基因的mRNAs發(fā)生降解或者抑制靶基因的翻譯過程，對轉錄后水平具有負調(diào)控作用[1]。miRNA還參與細胞代謝、增殖、分化、凋亡等多種生物學功能[2-3]。生物體內(nèi)肌肉類型大致可分為心肌、平滑肌和骨骼肌三大類。心肌由成熟的心肌細胞組成，是心臟中特有的肌肉類型，其肌肉增殖分化能力較低[4]。平滑肌主要分布在血管、消化道、生殖道、呼吸道等組織中。當肺動脈平滑肌受到炎癥、缺氧、創(chuàng)傷等刺激后，平滑肌細胞可參與肺血管的重塑[5]。另外有研究表明，胰島素可促進小鼠結腸平滑肌細胞的增殖[6]，表明平滑肌細胞具有一定的增殖分化能力。骨骼肌是體內(nèi)活躍度以及可塑性較高的一類組織，約占總體重的40%。骨骼肌形成是一個十分復雜的過程，涉及到骨骼肌衛(wèi)星細胞和成肌細胞的增殖、分化和肌管形成[7]。

近年發(fā)現(xiàn)miRNAs在肌肉的生長和發(fā)育過程中發(fā)揮著極為重要的作用[8]。當血管壁受到損傷時，血管平滑肌細胞進入細胞周期開始增殖，在這個過程中有多種miRNAs參與調(diào)節(jié)該細胞的增殖與遷移。例如miR-92a通過靶向PTEN、miR-22通過靶向MECP2對血管平滑肌細胞的增殖以及遷移進行調(diào)控[9-10]。而miR-320d和miR-582則會促進人主動脈血管平滑肌細胞發(fā)生凋亡[11]。在骨骼肌細胞中同樣有大量的miRNAs調(diào)控其生長發(fā)育過程，例如miR-1[12]與miR-206[13]在小鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞中均下調(diào)HDAC4基因的表達進而促進細胞的分化[7-8]；miR-486抑制Pax7表達加速肌源性分化的進程[14]。miR-133通過調(diào)節(jié)SRF[15]、MAML[16]、IGF-1R[17]基因的表達促進肌細胞增殖；在小鼠成肌細胞中miR-214既可以促進細胞的增殖又可以促進其分化[18]。miRNAs具有組織特異性。miR-1、miR-206、miR-133在骨骼肌細胞中特異性表達[19]。在骨骼肌發(fā)育過程中，miRNA具有階段特異性。miR-133在成年豬的肌肉組織中表達高于胚胎中的表達水平；而miR-368、miR-376和miR-423-5p則在新生仔豬中的表達水平較高[20]。

miR-423是一個在人、小鼠、豬、牛等物種中相對保守的miRNA，能夠形成miR-423-3p和miR-423-5p兩種成熟序列。miR-423與多種疾病密切相關，如miR-423-5p可作為反映肝衰竭嚴重程度的分子標志[21]。在子宮內(nèi)膜癌[1]、肝癌[13]、胃癌[22]、大腸癌[23]等細胞系和動物模型中miR-423-3p促進細胞的增殖、遷移和侵襲[23]。近幾年有研究發(fā)現(xiàn)，miR-423與骨骼肌的生長發(fā)育具有一定的關系。miR-423與豬的骨骼肌的肌肉增殖、分化以及脂肪形成密切相關[24]，在豬骨骼肌不同的發(fā)育過程中miR-423-5p呈現(xiàn)出顯著的表達差異，miR-423-5p可以抑制靶基因SRF對肌肉分化進行負向調(diào)控，并最終調(diào)控骨骼肌的生長發(fā)育[25]。同時miR-423具有調(diào)節(jié)成骨細胞生成的能力[26]，其通過靶向融合同源物的抑制劑最終達到抑制肌肉的生成的目的[12]。另外隨著C2C12細胞的分化，miR-423-5p mRNA表達量呈明顯的上升趨勢[8，27]。這些無一不暗示著miR-423在細胞生長發(fā)育中具有重要的作用。

然而，miR-423-5p在牛肌肉組織中的表達及可能的作用尚不明確，因此，驗證miR-423-5p在牛肌肉組織中的表達以及在不同分化天數(shù)的MDSCs中的表達，預測存在miR-423-5p潛在結合位點的靶基因，可為明確miR-423-5p在MDSCs細胞增殖分化中的作用提供前期的實驗研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與組織

牛骨骼肌衛(wèi)星細胞(MDSCs)由本實驗室制備保存。骨骼肌、小腸、心臟組織取自黑龍江省雙城市屠宰場健康成年西門塔爾牛，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱。

1.1.2 主要試劑

胎牛血清和馬血清購自Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd公司。ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix購自東洋紡(上海)生物科技有限公司。TB Green?Premix Ex TaqTM購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

利用含有30%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MDSCs細胞。當細胞匯合達85%后，更換為含2%馬血清的分化培養(yǎng)基進行分化處理，分別分化0、24和72 h，然后分別提取細胞的總RNA進行后續(xù)實驗。

1.2.2 RNA提取以及熒光定量PCR

將牛各組織塊在液氮中充分研磨后進行分裝，同樣將分化不同時間的細胞進行收集與分裝。然后利用Trizol法提取總RNA，并利用ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix以及莖環(huán)引物將其反轉錄成cDNA。然后利用TB Green?Premix Ex TaqTM進行熒光定量PCR，其反應體系為：TB Green Premix ExTaq5 μL，cDNA樣品2 μL，上下游引物各0.5 μL，DEPC-treated H2O 2 μL。反應條件如下：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。反應結束后獲得每個樣品的Ct值，運用2-△△Ct法計算基因的相對表達。所用引物如表1所示。

1.2.3 miR-423-5p靶基因預測

通過NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站與miRBase 21.0 (www.miRbase.org)數(shù)據(jù)庫查詢牛miR-423成熟體(miR-423-3p和miR-423-5p)及前體序列(pre-miR-423)相關信息，然后利用在線軟件TargetScan (http://www.targetscan.org/)和PicTar(http://www.pictar.org/)預測可能與miR-423-5p結合的靶基因。

1.3 統(tǒng)計學分析

用GraphPad Prism 6將數(shù)據(jù)進行處理分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，P<0.05表示具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 miR-423在?；蚪M中的位置及序列信息

為明確miR-423在?；蚪M中的相關信息，本文查詢了NCBI網(wǎng)站以及miRBase 21.0數(shù)據(jù)庫上公布的牛miR-423(Gene ID: 791045)信息，結果如圖1所示。miR-423位于?；蚪M第19號染色體的21 238 007～21 238 100 bp處，為內(nèi)含子miRNA。miR-423具有兩種成熟序列分別為bta-miR-423-5p：UGA GGG GCA GAG AGC GAG ACU UU(長度為23 bp)；bta-miR-423-3p： AAG CUC GGU CUG AGG CCC CUC AGU(長度為24 bp)。其前體序列(pre-miR-423)為ATA AAG GAA GTT AGG CTG AGG GGC AGA GAG CGA GAC TTT TCT ATT TTC CAA AAG CTC GGT CTG AGG CCC CTC AGT CTT GCT TCC TAC CCC GCG C(長度為94 bp)，位于NSRP1基因的第一個內(nèi)含子中。另外miRBase網(wǎng)站顯示，bta-miR-423-5p的表達豐度明顯高于bta-miR-423-3p，因此選擇bta-miR-423-5p進行后續(xù)實驗。

2.2 miR-423在各物種的同源性分析

通過查閱NCBI網(wǎng)站上公布的信息發(fā)現(xiàn)，miR-423在人(hsa)、鼠(mmu)、牛(bta)、豬(ssc)、馬(eca)、山羊(chi)等25種物種中普遍存在。選取hsa、mmu、bta等含有miR-423-3p和miR-423-5p兩種成熟序列的14個物種進行比較分析。miR-423在各物種的基因組中的位置見表2。在各物種之間pre-miR-423的同源性達66.96%(圖2-A)，miR-423-3p同源性為95.83%(圖2-B)，miR-423-5p的同源性為100%(圖2-C)。

表1 bta-miR-423-5p引物序列及內(nèi)參基因引物序列

圖1 miR-423在?；蚪M中的位置及序列信息Fig.1 miR-423 related information

表2 miR-423基因信息

續(xù)表2 Continued Table 2

2.3 miR-423-5p在牛肌肉組織中的表達

為明確miR-423-5p在牛不同肌肉組織中的表達情況，將提取的RNA利用莖環(huán)熒光定量PCR法對牛miR-423-5p的表達進行檢測，結果如圖3所示，小腸與骨骼肌中miR-423-5p的表達量明顯高于心臟組織。

2.4 miR-423-5p在牛MDSCs分化過程中的表達

骨骼肌中含有大量的具有增殖分化潛力的骨骼肌衛(wèi)星細胞(MDSCs)，因此進一步檢測了miR-423-5p在MDSCs增殖分化中的表達變化。將MDSCs分別分化0 h(MDSC-P)、24 h (MDSC-D1)和72 h (MDSC-D3)，如圖4所示，隨時間的延長細胞分化現(xiàn)象明顯，肌管數(shù)量明顯增加；提取總RNA后采用莖環(huán)熒光定量PCR方法檢測miR-423-5p的表達，結果如圖5所示，隨著分化時間的延長，miR-423-5p的表達量升高。

2.5 miR-423-5p靶基因預測

為了研究miR-423-5p在生物體內(nèi)可能的作用機制，利用在線軟件TargetScan和PicTar查詢可能與miR-423-5p結合的靶基因。預測結果顯示，大約有210個基因mRNA 的3′ UTR含有bta-miR-423-5p潛在的結合位點。再次利用TargetScan進行靶基因的反向篩選，篩選結果顯示，在210個靶基因中有12個基因含有bta-miR-423-5p的結合位點。結果如表3所示。

** P<0.01; *** P<0.001.圖5 miR-423-5p在MDSCs分化過程的表達Fig.5 Expression of miR-423-5p in MDSCs during differentiation

3 討論

miR-423是一種廣泛分布在各物種中的MicroRNA，然而在物種牛中與其相關的信息尚未見報道。因此，本文介紹了miR-423-5p在?；蚪M中相關信息，并進行了與其他物種間的同源性分析。分析結果發(fā)現(xiàn)，牛(bta-miR-423)與人(hsa-miR-423)、鼠(mmu-miR-423)、豬(ssc-miR-423)等14個物種間的同源性達66.96%。另外對其兩個成熟體進行分析比較，結果發(fā)現(xiàn)，miR-423-5p在各物種中的同源性高達100%，而miR-423-3p在各物種中的同源性則為95.83%。結果表明，miR-423無論是前體序列還是成熟體序列均顯示為較高的種間保守性。

表3 miR-423-5p靶基因預測結果

miR-423-5p在細胞的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，如在豬骨骼肌中其通過抑制SRF基因的表達進而負向調(diào)節(jié)細胞的分化[2]。由于miR-423-5p具有高度的保守性，基于此特性，本實驗檢測了牛肌肉中miR-423-5p的表達，結果表明，其在骨骼肌中表達量明顯高于其他兩種肌細胞。心臟中的心肌主要由成熟的心肌細胞組成，而該細胞具有較低的增殖分化的能力。小腸包括黏膜層和肌層，其中肌層主要由平滑肌細胞以及未分化的細胞組成，說明該組織具有一定的增殖分化的能力。眾所周知，骨骼肌中含有大量的骨骼肌衛(wèi)星細胞，該細胞具有較強的增殖分化的能力，結果顯示，miR-423-5p在骨骼肌中表達量最高，不難看出其與細胞的增殖分化存在某種聯(lián)系。有研究表明，在小鼠早期增殖的成肌細胞中觀察到miR-423-5p出現(xiàn)明顯上調(diào)，在肌源性分化4 d后達到最高水平[12]。本實驗結果表明，miR-423-5p在分化的MDSCs中表達較高，且隨時間的延長而升高，推測miR-423-5p可能促進MDSCs的分化，但其在細胞中的具體功能還需要進一步驗證。

miRNA的“種子序列”是靶基因mRNA的3′UTR主要的結合位點，具有一定的調(diào)控作用[28]。為了能夠進一步了解miR-423-5p在細胞中的作用及機制，利用TargetScan預測以及反向篩選了可能與miR-423-5p結合的靶基因，結果發(fā)現(xiàn)，在牛體內(nèi)有12個基因mRNA的3′UTR具有miR-423-5p潛在的結合位點，其中部分靶基因參與細胞的增殖、分化、凋亡等過程。如血小板反應蛋白基因家族成員3(Thbs3)，作為一種細胞外基質分子，THBSs家族成員參與了豬骨骼肌生長發(fā)育過程[29]。Ly6神經(jīng)毒素1(Lynx1)是一種GPI-錨定蛋白。在人肺癌細胞中，通過siRNAs敲除Lynx1后促進了肺癌細胞的增殖，而Lynx1過表達則抑制了細胞的增殖[30]，這表明Lynx1是一種肺癌生長的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子。神經(jīng)生長因子誘導物(VGF)，一種由神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導的多肽，參與神經(jīng)突的生長和神經(jīng)保護[31]。在視神經(jīng)細胞中當VGF基因被敲低時，細胞的增殖被抑制[32]。WNT基因家族成員9B(WNT9B)，是調(diào)節(jié)祖細胞增殖與分化平衡的關鍵因子。當細胞中的Six2被敲低時，Wnt9b/β-catenin則促進其分化[33]。在成年斑馬魚腎臟發(fā)育和再生中Wnt蛋白具有重要作用[34]。這些研究結果預示著miR-423-5p可能參與細胞的增殖分化過程，然而這些靶基因究竟是否能夠與miR-423-5p結合還需進一步實驗驗證；而這些靶基因在牛骨骼肌中的作用同樣需進一步的驗證。