副干酪乳桿菌固態(tài)發(fā)酵棗粉工藝優(yōu)化及其品質(zhì)分析

張家萌，魏嘉雯，張惠玲，*

(1.寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021； 2.寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021)

副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)是一種兼性厭氧、革蘭氏陽性、異型發(fā)酵乳酸菌[1]，廣泛存在于發(fā)酵乳制品和人體腸道中，具有平衡腸道菌群、緩解結(jié)腸炎癥狀、增強(qiáng)人體免疫力等多種益生特性[2]。Van Hoorde等[3]研究表明，副干酪乳桿菌在發(fā)酵過程中會(huì)代謝產(chǎn)生酶和其他風(fēng)味調(diào)節(jié)物質(zhì)。Poveda等[4]用L.paracaseissp. CECT 7882菌株發(fā)酵奶酪，檢測(cè)到奶酪中的游離脂肪酸和醇類等物質(zhì)含量都有所增加，較傳統(tǒng)的奶酪風(fēng)味質(zhì)量明顯提升。Sunthornthummas等[5]的研究顯示，服用含有高活菌數(shù)的乳酸菌發(fā)酵制品對(duì)調(diào)節(jié)餐后血糖有良好的效果。

紅棗又名大棗，具有旱、澇適應(yīng)力強(qiáng)的特點(diǎn)，在我國有著悠久的種植歷史。紅棗富含氨基酸、多糖、多酚、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，被視為“上等補(bǔ)品”。然而，受到運(yùn)輸和保藏條件限制，鮮棗銷路不暢，而干棗價(jià)格又較低，經(jīng)濟(jì)效益不明顯[6]。近年來，利用發(fā)酵方式處理紅棗的研究逐漸增加，如利用乳酸菌發(fā)酵紅棗汁制得具有降血脂功能的紅棗功能型飲料，或者添加麩皮水解物等功能性物質(zhì)來提高產(chǎn)品的腸道益生功能[7]。

固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)發(fā)酵相比，具有環(huán)境友好、能耗低、產(chǎn)率高的特點(diǎn)，在生物制造和食品產(chǎn)業(yè)中受到越來越多的關(guān)注。近年來，利用固態(tài)發(fā)酵處理香蕉皮、花生殼、蘋果渣、甘蔗渣、柑橘渣、檸檬皮、麥麩和豆粕等工業(yè)廢渣生產(chǎn)酶制劑、香料和各種有機(jī)酸的研究逐漸增加[8]。寧夏盛產(chǎn)紅棗，以紅棗為主要原料的發(fā)酵研究主要集中于液態(tài)發(fā)酵方面，少有關(guān)于固態(tài)發(fā)酵的研究。但液態(tài)產(chǎn)品存在不易攜帶、保質(zhì)期較短等問題，且發(fā)酵相同質(zhì)量的原料需要更大的反應(yīng)器。針對(duì)以上問題，本研究利用固態(tài)發(fā)酵手段處理紅棗，基于副干酪乳酸菌固態(tài)發(fā)酵紅棗，減少底物中的還原糖含量，增加活性益生菌，得到具有高活菌數(shù)、高含量活性成分的紅棗益生菌粉，以期為紅棗的精加工提供更多的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干紅棗(寧夏同心圓棗)、豆粉、麥麩，均為市售；試驗(yàn)所用的副干酪乳桿菌TK1501菌種保藏于天津科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)室，保藏編號(hào)為CGMCC No.13130。

沒食子酸(分析純)、α-淀粉酶(生化試劑)、中性蛋白酶(生化試劑)，購于上海源葉生物科技有限公司；MRS培養(yǎng)基(生化試劑)、濃硫酸(色譜純)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)，購于天津市化學(xué)試劑一廠；β-巰基乙醇(分析純)、福林酚(分析純)，購于上海荔達(dá)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DWS-302型恒溫培養(yǎng)箱，天津市天宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；L3000型冷凍干燥機(jī)，美國Thermo Scientific公司；PHS-2C型PH計(jì)、AB204-S型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；VM-5S型水分測(cè)試儀，泰州市科拓儀器設(shè)備有限公司；高速粉碎機(jī)，東莞市華太電器有限公司；NAZDNM-9602A型酶標(biāo)儀，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；1260 Infinity型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；TCL-12型高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；SP-2012UV型紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司。

1.3 種子液與培養(yǎng)基制備

1.3.1 活化培養(yǎng)基

配置液態(tài)MRS培養(yǎng)基：取MRS培養(yǎng)基49.7 g，溶于1 000 mL水中，121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

1.3.2 種子液

一級(jí)種子液：向100 mL玻璃瓶中加入活化培養(yǎng)基20 mL，121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

二級(jí)種子液：向250 mL玻璃瓶中加入活化培養(yǎng)基100 mL，121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

1.3.3 棗粉制備

干棗原料分選→去核→50 ℃烘干→粉碎→過50目篩→棗粉(備用)。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基

取原料紅棗粉和豆粉依9∶1的比例混合均勻，稱取20 g，以料水比(質(zhì)量體積比，下同)1∶0.8的比例加水混合均勻，100 ℃滅菌30 min，冷卻后備用。

1.3.5 計(jì)數(shù)培養(yǎng)基

配置固態(tài)MRS培養(yǎng)基：取MRS培養(yǎng)基49.7 g、瓊脂粉20 g，溶于1 000 mL水中，121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

1.3.6 種子液活化

將甘油管中保藏的菌液按照10%的體積分?jǐn)?shù)接入無菌的活化培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。取活化菌液200 μL接入一級(jí)種子液中，37 ℃培養(yǎng)24 h，取1 mL經(jīng)一級(jí)活化的種子液接入二級(jí)種子液中，37 ℃培養(yǎng)24 h，完成二級(jí)活化。按照10%的接種量(接種種子液與基質(zhì)的體積質(zhì)量比，下同)，將經(jīng)二級(jí)活化的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃發(fā)酵，每隔6 h取樣。

1.4 發(fā)酵工藝流程

純紅棗固態(tài)基質(zhì)黏性大、孔隙率小，不利于固態(tài)發(fā)酵體系內(nèi)部的熱量散發(fā)。只有改變基質(zhì)疏松程度，提高散熱率，才能進(jìn)一步提高微生物的生物量[9]。因此，向純紅棗固態(tài)基質(zhì)中添加豆粉和麥麩，改善基質(zhì)碳氮比和疏松程度，加快熱量散發(fā)，以利于活菌數(shù)提高。

棗粉→添加不同比例輔料→加水混勻→滅菌(100 ℃，30 min)→接種，37 ℃密閉發(fā)酵→干燥破碎→成品。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1)麥麩添加量確定。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基豆粉添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)25%、料水比1∶0.9的條件下，設(shè)置麥麩添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)為4%、7%、10%、13%、16%，按照10%的接種量接入經(jīng)二級(jí)活化的種子液，37 ℃發(fā)酵24 h，然后冷凍干燥24 h，進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，檢測(cè)活菌數(shù)。

(2)豆粉添加量確定。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基麥麩添加量10%、料水比1∶0.9的條件下，設(shè)置豆粉添加量為10%、15%、20%、25%、30%。其他試驗(yàn)步驟同麥麩添加量確定。

(3)料水比確定。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基豆粉添加量25%、麥麩添加量10%的條件下，設(shè)置料水比分別為1∶0.5、1∶0.7、1∶0.9、1∶1.1、1∶1.3。其他試驗(yàn)步驟同麥麩添加量確定。

(4)發(fā)酵時(shí)間確定。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基豆粉添加量25%、麥麩添加量10%、料水比1∶0.9的條件下，按照10%的接種量接入經(jīng)二級(jí)活化的種子液，分別發(fā)酵12、18、24、30、36 h。其他試驗(yàn)步驟同麥麩添加量確定。

(5)接種量確定。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基豆粉添加量25%、麥麩添加量10%、料水比1∶0.9的條件下，設(shè)置接種量分別為4%、7%、10%、13%、16%。其他試驗(yàn)步驟同麥麩添加量確定。

(6)干燥方式確定。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基豆粉添加量25%、麥麩添加量10%、料水比1∶0.9的條件下，按照10%的接種量接入經(jīng)二級(jí)活化的種子液，發(fā)酵24 h。每份樣品稱取10.00 g放于直徑9 cm的玻璃平皿中，鋪平，進(jìn)行干燥。干燥條件分別設(shè)置為-50 ℃冷凍干燥、40 ℃低溫鼓風(fēng)干燥、65 ℃鼓風(fēng)干燥，在前述3種干燥條件下均分別設(shè)置烘干時(shí)間為6、12、18、24 h。烘干完成后，分別檢測(cè)水分含量、活菌數(shù)，并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.5.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以豆粉添加量、麥麩添加量、接種量和發(fā)酵時(shí)間為變量，依次編為A～D，進(jìn)行響應(yīng)面工藝優(yōu)化。編碼水平1、0、-1分別表示各變量的高、中、低水平，以活菌數(shù)和感官評(píng)價(jià)得分為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)。各變量高、中、低水平所對(duì)應(yīng)的值詳見表1。

1.6 指標(biāo)測(cè)定

1.6.1 穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

將發(fā)酵后的樣品干燥至含水量低于7%，把樣品分為8份，每份10 g，裝入無菌袋中抽真空密封，于(37±2)℃條件下保藏90 d。每隔15 d取樣一次，分別檢測(cè)樣品活菌數(shù)、pH值和水分含量，同時(shí)觀察樣品的顏色、氣味有無明顯變化。

1.6.2 感官評(píng)價(jià)

在單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)中，首先，對(duì)干燥后的固態(tài)粉末狀樣品進(jìn)行初步觀察評(píng)價(jià)；然后，取5 g粉末狀樣品加入約40 ℃的飲用水20 mL沖調(diào)，由20名食品專業(yè)的課題組學(xué)生(10男10女)組成評(píng)定小組，經(jīng)集中培訓(xùn)合格后，對(duì)沖調(diào)后的飲品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。感官評(píng)價(jià)項(xiàng)目、要求，及相應(yīng)的分值詳見表2。

對(duì)于按照優(yōu)化后的工藝制成的紅棗益生菌粉，由同一評(píng)定小組的20人，從組織形態(tài)、外觀、香氣和口感4個(gè)方面進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CBFIA 08003—2017《食用植物酵素》和文獻(xiàn)[10-11]中的固態(tài)飲料感官評(píng)價(jià)，詳見表3。

表1 變量編碼值

表2 感官評(píng)價(jià)賦分表

1.6.3 理化指標(biāo)測(cè)定

(1)活菌數(shù)檢測(cè)。采用傾注平板計(jì)數(shù)法，取1 g樣品加入9 mL滅菌生理鹽水，用渦旋振蕩器充分混合后，采用10倍梯度系列稀釋，選擇3個(gè)合適稀釋度的樣品，各取1 mL加入無菌玻璃平板中，倒入計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個(gè)濃度梯度做3組平行，取平均值。

(2)pH檢測(cè)。稱取樣品2 g，放入錐形瓶中，加入18 mL蒸餾水，用磁力攪拌器攪拌均勻，靜置10 min后測(cè)定樣品的pH值。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取平均值。

表3 綜合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

(3)含水量檢測(cè)。精確稱取2.00 g樣品均勻鋪滿金屬托盤，放入水分測(cè)試儀中進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取平均值。

1.6.4 質(zhì)量指標(biāo)測(cè)定

(1)糖類含量。樣品加3倍體積的水稀釋后，于50 ℃浸泡2 h。取混合液于4 000 r·min-1離心10 min，取上清液用過膜水稀釋20倍，過水膜備用。利用高效液相色譜檢測(cè)樣品中的葡萄糖、果糖和蔗糖含量。色譜條件：流動(dòng)相為乙腈-水溶液(體積比75∶25)，流速0.8 mL·min-1；色譜柱為Prevall Carb ES Column-W(250 mm×4.6 mm)，柱溫30 ℃；檢測(cè)器為蒸發(fā)光檢測(cè)器(Alltech 3300 ELSD)；漂移管溫度90 ℃；氣體流速2.4 L·min-1[12]。

(2)有機(jī)酸含量。樣品加3倍體積的水稀釋后，于4 ℃浸泡4 h。取混合液于4 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液用過膜水稀釋，過水膜備用。利用高效液相色譜檢測(cè)樣品中的有機(jī)酸。色譜條件：流動(dòng)相為5 mmol·L-1H2SO4溶液，流速0.4 mL·min-1；色譜柱為Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)；柱溫30 ℃；紫外檢測(cè)波長210 nm；進(jìn)樣量20 μL。

(3)γ-氨基丁酸(GABA)含量。樣品加3倍體積的水稀釋后，于4 000 r·min-1離心10 min，取上清液用過膜水稀釋，過水膜備用。參照文獻(xiàn)[13]，利用高效液相色譜檢測(cè)基質(zhì)中的GABA含量。

(4)總酚含量。參照文獻(xiàn)[14]，移取樣品提取液0.5 mL，加入稀釋1倍的福林酚試劑0.5 mL，混勻，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Na2CO3溶液1.5 mL，用蒸餾水定容至10 mL，混合均勻，75 ℃反應(yīng)10 min，于760 nm波長處測(cè)定吸光值。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品。

(5)游離氨基酸含量。取1 g樣品溶于9 mL去離子水，4 ℃靜置4 h，4 000 r·min-1離心20 min，取上清液備用。參照文獻(xiàn)[15]，采用茚三酮比色法檢測(cè)樣品中的游離氨基酸含量。

(6)粗多糖含量。參照文獻(xiàn)[16]，每份樣品稱取0.5 g，用超聲復(fù)合酶法提取多糖。根據(jù)SN/T 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的測(cè)定 苯酚-硫酸法》，測(cè)定粗多糖含量。

(7)黃酮含量。參照SN/T 4592—2016《出口食品中總黃酮的測(cè)定》，測(cè)定樣品中的總黃酮含量。

(8)膳食纖維含量。稱取2 g樣品，粉碎過100目篩，加入95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇脫糖30 min，4 000 r·min-1離心10 min，60 ℃干燥24 h；再次粉碎加水調(diào)節(jié)pH(控制pH值在6.0左右)，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的α-淀粉酶，50 ℃酶解40 min，100 ℃滅酶10 min；加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的中性蛋白酶，50 ℃酶解40 min，100 ℃滅酶10 min，4 000 r·min-1離心10 min；濾液加入3倍體積的95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇，60 ℃沉淀 12 h，4 000 r·min-1離心10 min，干燥稱重，得可溶性膳食纖維含量[17]。依次用10 mL去離子水、10 mL 75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇、10 mL丙酮洗滌濾渣，干燥稱重，得不溶性膳食纖維含量[18]。

(9)乙醇含量。根據(jù)GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》測(cè)定樣品中的乙醇含量。

(10)總酸含量。根據(jù)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》測(cè)定食品中的總酸含量。

1.6.5 微生物安全指標(biāo)檢測(cè)

分別依據(jù)GB/T 13092—2006《飼料中霉菌總數(shù)的測(cè)定》、GB/T 18869—2019《飼料中大腸菌群的測(cè)定》、GB/T 23743—2009《飼料中凝固酶陽性葡萄球菌的微生物學(xué)檢驗(yàn) Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基計(jì)數(shù)法》、GB/T 13091—2018《飼料中沙門氏菌的測(cè)定》，測(cè)定樣品中的霉菌、大腸菌群、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 副干酪乳桿菌固態(tài)發(fā)酵棗粉工藝的單因素優(yōu)化

2.1.1 麥麩添加量對(duì)產(chǎn)品活菌數(shù)和感官品質(zhì)的影響

圖1 麥麩添加量對(duì)產(chǎn)品活菌數(shù)和感官評(píng)價(jià)得分的影響Fig.1 Effect of wheat bran content on viable count and sensory evaluation score of products

隨著麥麩添加量的增加，產(chǎn)品活菌數(shù)與感官評(píng)價(jià)得分均呈先上升后下降的趨勢(shì)(圖1)，當(dāng)麥麩添加量為10%時(shí)，產(chǎn)品活菌數(shù)與感官評(píng)價(jià)評(píng)分均達(dá)最大值。麥麩含量會(huì)影響發(fā)酵基質(zhì)的疏松程度和氧氣傳遞，當(dāng)麥麩添加量大于13%時(shí)，基質(zhì)疏松程度明顯增大，氧氣含量上升，導(dǎo)致活菌數(shù)下降[19]。麥麩對(duì)產(chǎn)品口感有明顯不良影響，麥麩含量過高，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品口感粗糙，且有不愉快氣味產(chǎn)生。綜上，麥麩添加量宜為10%。

2.1.2 豆粉添加量對(duì)產(chǎn)品活菌數(shù)和感官品質(zhì)的影響

在試驗(yàn)條件下，隨著豆粉添加量的增加，活菌數(shù)快速增長(圖2)，但感官評(píng)價(jià)得分先緩增后下降，在25%的豆粉添加量下取得最高的感官評(píng)價(jià)得分。當(dāng)豆粉添加量>25%時(shí)，菌體快速繁殖，產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，使樣品口感偏酸，并且產(chǎn)生尖酸氣味，致使感官評(píng)價(jià)得分下降。綜上，豆粉添加量宜為25%。

2.1.3 料水比對(duì)產(chǎn)品活菌數(shù)和感官品質(zhì)的影響

隨著料水比的降低，產(chǎn)品的活菌數(shù)和感官評(píng)價(jià)得分均呈先上升后下降的趨勢(shì)(圖3)。當(dāng)料水比為1∶0.5時(shí)，基質(zhì)難以拌勻，有少量干粉狀物質(zhì)存在，副干酪乳桿菌幾乎不能生長；當(dāng)料水比在1∶0.9～1∶1.1，產(chǎn)品活菌數(shù)無明顯差別，但當(dāng)料水比為1∶0.9時(shí)，產(chǎn)品的感官評(píng)價(jià)得分略高；當(dāng)料水比為1∶1.3時(shí)，基質(zhì)為黏稠狀液體，不能算作固態(tài)發(fā)酵。考慮到基質(zhì)中含水量高會(huì)延長凍干時(shí)間，綜合上述分析，料水比宜為1∶0.9。

圖2 豆粉添加量對(duì)產(chǎn)品活菌數(shù)和感官評(píng)價(jià)得分的影響Fig.2 Effect of soybean flour content on viable count and sensory evaluation score of products

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)品活菌數(shù)和感官品質(zhì)的影響

隨著發(fā)酵時(shí)間延長，產(chǎn)品的活菌數(shù)和感官評(píng)價(jià)得分均呈先增長后減小的趨勢(shì)(圖4)，并在24 h達(dá)到最大值。若發(fā)酵時(shí)間過長，基質(zhì)中會(huì)積累較多有機(jī)酸，導(dǎo)致感官評(píng)價(jià)得分略降。綜合活菌數(shù)和感官評(píng)價(jià)得分，發(fā)酵時(shí)間宜為24 h。

圖3 料水比對(duì)產(chǎn)品活菌數(shù)和感官評(píng)價(jià)得分的影響Fig.3 Effect of ratio of material to water on viable count and sensory evaluation score of products

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)品活菌數(shù)和感官評(píng)價(jià)得分的影響Fig.4 Effect of fermentation time on viable count and sensory evaluation score of products

2.1.5 接種量對(duì)產(chǎn)品活菌數(shù)和感官品質(zhì)的影響

隨著接種量增加，產(chǎn)品的活菌數(shù)和感官評(píng)價(jià)得分先增加后減少(圖5)。當(dāng)接種量較低時(shí)，接入基質(zhì)中的副干酪乳桿菌數(shù)量少，生長緩慢；當(dāng)接種量大于10%時(shí)，接入基質(zhì)中的副干酪乳桿菌數(shù)量較多，菌體繁殖快速，產(chǎn)酸量大，且快速發(fā)酵過程中產(chǎn)生刺激性氣味，導(dǎo)致感官評(píng)價(jià)得分降低；當(dāng)接種量為10%時(shí)，產(chǎn)品的活菌數(shù)和感官評(píng)價(jià)得分均最高。綜上。接種量宜為10%。

圖5 接種量對(duì)產(chǎn)品活菌數(shù)和感官評(píng)價(jià)得分的影響Fig.5 Effect of inoculation amount on viable count and sensory evaluation score of products

2.1.6 干燥方式對(duì)產(chǎn)品含水量、活菌數(shù)和感官品質(zhì)的影響

-50 ℃冷凍干燥、40 ℃鼓風(fēng)干燥、65 ℃鼓風(fēng)干燥將樣品含水量降至7%所需的時(shí)間分別為24、18、12 h(圖6)。待樣品含水量降至7%時(shí)，-50 ℃冷凍干燥、40 ℃鼓風(fēng)干燥、65 ℃鼓風(fēng)干燥樣品中的活菌數(shù)分別為6.34×108、4.53×108、7.50×106CFU·g-1，說明-50 ℃冷凍干燥和40 ℃鼓風(fēng)干燥對(duì)產(chǎn)品活菌數(shù)的影響較小，而65 ℃鼓風(fēng)干燥樣品中的活菌數(shù)明顯下降；-50 ℃冷凍干燥樣品的感官評(píng)價(jià)得分最高，且產(chǎn)品有明顯的紅棗香氣，40 ℃鼓風(fēng)干燥樣品的感官評(píng)價(jià)得分次之，65 ℃鼓風(fēng)干燥樣品的質(zhì)地較硬，且有焦糊味，感官評(píng)價(jià)得分最低。綜上，-50 ℃冷凍干燥所需時(shí)間最長，但其產(chǎn)品的活菌數(shù)和感官評(píng)價(jià)得分優(yōu)于另外2種干燥方式的產(chǎn)品，宜選擇-50 ℃冷凍干燥作為產(chǎn)品的干燥方式。

圖6 干燥方式對(duì)產(chǎn)品含水量、活菌數(shù)和感官評(píng)價(jià)得分的影響Fig.6 Effect of drying method on water content，viable count and sensory evaluation score of products

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以豆粉添加量(A)、麥麩添加量(B)、接種量(C)、發(fā)酵時(shí)間(D)為供試因素，開展4因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)(表4)。

基于試驗(yàn)數(shù)據(jù)，分別對(duì)活菌數(shù)(R1)、感官評(píng)價(jià)得分(R2)進(jìn)行二次方程的回歸擬合：

R1=6.95+0.16A-0.42B+0.11C+0.33D-0.39AB-0.72AC-0.73AD-0.087BC-0.50BD+0.50CD-1.42A2-0.86B2-0.83C2-0.60D2；

(1)

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

R2=87.46-2.57A-7.14B+2.5×10-3C-0.95D+0.34AB-3.45AC-1.47AD-1.88BC+0.42BD-1.47CD-2.90A2-7.00B2-3.10C2-4.17D2。

(2)

對(duì)構(gòu)建的方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示，所構(gòu)建的方程均達(dá)到極顯著(P<0.01)水平。關(guān)于R1、R2的方程的失擬項(xiàng)均不顯著(P>0.05)，說明方程的擬合程度較好[20]。關(guān)于R1的方程中，B、AC、AD、A2、B2、C2、D2項(xiàng)均通過了P<0.01的顯著性檢驗(yàn)；關(guān)于R2的方程中，A、B、B2、D2項(xiàng)均通過了P<0.01的顯著性檢驗(yàn)。

對(duì)供試因素及其交互作用進(jìn)行響應(yīng)面分析(圖7～圖10)。從各因素及其交互作用對(duì)產(chǎn)品活菌數(shù)的影響來看，曲面圖皆為開口向下的凸形曲面，說明響應(yīng)值在試驗(yàn)因素變化范圍內(nèi)存在極高值。AC、BD曲面彎曲程度大，且等高線均為密集的橢圓形，說明接種量與豆粉添加量、麥麩添加量與發(fā)酵時(shí)間的交互作用明顯，且對(duì)活菌數(shù)有明顯影響；AB、BC曲面彎曲程度大，但等高線均為圓形，說明兩者交互作用明顯，但對(duì)活菌數(shù)沒有明顯影響。

從各因素及其交互作用對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)價(jià)得分的影響來看，AC、CD曲面陡峭，等高線均為密集的橢圓形，說明接種量與豆粉添加量、接種量與發(fā)酵時(shí)間的交互作用明顯，且對(duì)感官評(píng)價(jià)得分影響明顯；BC、BD曲面坡度較大，等高線為稀疏的圓形，說明麥麩添加量與接種量、麥麩添加量與發(fā)酵時(shí)間的交互作用明顯，但對(duì)感官評(píng)價(jià)得分無明顯影響。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與分析

圖7 不同因素對(duì)活菌數(shù)影響的三維曲面圖Fig.7 Three-dimensional surface plot of factors on viable count of products

圖8 因素交互作用對(duì)活菌數(shù)影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface plot of interactions of factors on viable count of products

圖9 不同因素對(duì)感官評(píng)價(jià)得分影響的三維曲面圖Fig.9 Three-dimensional surface plot of factors on sensory evaluation score of products

圖10 因素交互作用對(duì)感官評(píng)價(jià)得分影響的響應(yīng)面圖Fig.10 Response surface plot of interactions of factors on sensory evaluation score of products

對(duì)所構(gòu)建的方程進(jìn)行分析，得到的最佳發(fā)酵工藝條件為：豆粉添加量24.21%，麥麩添加量8.74%，接種量10.40%，發(fā)酵時(shí)間24.92 h。在此工藝條件下，基于所構(gòu)建方程的預(yù)測(cè)活菌數(shù)為7.05×108CFU·g-1，感官評(píng)價(jià)得分為89.21。為了驗(yàn)證上述結(jié)果的可靠性，在得到的最佳工藝條件下進(jìn)行試驗(yàn)。考慮到實(shí)際操作的方便性，將工藝參數(shù)修正為：豆粉添加量24%，麥麩添加量9%，接種量10%，發(fā)酵時(shí)間24 h。經(jīng)實(shí)測(cè)，產(chǎn)品活菌數(shù)為7.21×108CFU·g-1，感官評(píng)價(jià)得分為90.24。驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果與預(yù)測(cè)值接近，說明所構(gòu)建的二次回歸方程準(zhǔn)確有效，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的擬合程度較好，具有一定的實(shí)用價(jià)值[21]。

由于制得的紅棗粉末中仍含有大量未發(fā)酵完的有機(jī)原料和乳酸菌活菌，在適宜的溫度和濕度條件下微生物會(huì)繁殖生長，因此一些功能成分，如酚類物質(zhì)、糖類和酯類物質(zhì)在一定條件下會(huì)產(chǎn)生變化，造成產(chǎn)品變質(zhì)[22]。為此，特開展穩(wěn)定性試驗(yàn)，檢測(cè)發(fā)酵后的樣品在存放過程中的活菌數(shù)、含水量和pH值變化情況(表5)，檢驗(yàn)樣品是否會(huì)在短期存放過程快速變質(zhì)。

在產(chǎn)品存放期間，含水量無明顯變化，pH值緩慢下降，60 d內(nèi)活菌數(shù)未明顯下降，說明產(chǎn)品有一定的穩(wěn)定性。含活菌的功能性產(chǎn)品想要發(fā)揮其相應(yīng)的益生作用，需要保證活菌數(shù)≥106CFU·g-1。在試驗(yàn)期間(90 d)，產(chǎn)品的活菌數(shù)均符合該要求。綜上，該產(chǎn)品有一定的穩(wěn)定性。這可能得益于固態(tài)產(chǎn)品含水量低，微生物基本處于休眠狀態(tài)，因而產(chǎn)品具有較好的保藏性。

除活菌外，發(fā)酵后基質(zhì)中的多項(xiàng)活性物質(zhì)含量有所增加(表6)。其中，粗多糖、乳酸、蘋果酸、檸檬酸、乙酸、游離氨基酸、GABA含量均有明顯增加。副干酪乳桿菌有產(chǎn)胞外多糖的能力，同時(shí)發(fā)酵體系還提供了合成胞外多糖所必需的乙酸和蔗糖等物質(zhì)，為合成多糖提供了良好的營養(yǎng)條件[23]。副干酪乳桿菌可以通過谷氨酸脫羧酶(GAD)體系產(chǎn)生GABA[24]。蘋果酸、乙酸、乳酸含量增加的原因可能是，固態(tài)發(fā)酵體系中存在頂空層(氣相層)和物料層，菌體參與了有氧代謝和厭氧代謝2種代謝途徑，乳酸菌在厭氧代謝中，利用其他物質(zhì)合成蘋果酸，同時(shí)有氧代謝會(huì)利用蘋果酸產(chǎn)生少量乙酸和乳酸[25]。富馬酸含量沒有發(fā)生明顯變化，說明該菌既不產(chǎn)生也不利用富馬酸。副干酪乳桿菌代謝過程產(chǎn)生了大量的有機(jī)酸，體系pH降低，激活了植物內(nèi)某些內(nèi)源性蛋白酶的活性，在酸性環(huán)境和酶的共同作用下，大分子的蛋白質(zhì)被降解，導(dǎo)致游離氨基酸含量增加[26]。有研究顯示，乳酸菌發(fā)酵可以有效分解小麥蛋白，形成小分子多肽和氨基酸。因此，發(fā)酵后游離氨基酸含量明顯增加，基質(zhì)具有更好的消化性和生理活性[27]。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

表6 發(fā)酵前后基質(zhì)中質(zhì)量指標(biāo)的變化

發(fā)酵后基質(zhì)中的葡萄糖和蔗糖含量明顯減少，說明副干酪乳桿菌在發(fā)酵過程中主要消耗葡萄糖和蔗糖進(jìn)行生長代謝。發(fā)酵過程中果糖含量無明顯變化，說明該菌幾乎不分解代謝果糖。發(fā)酵后黃酮、總酚含量分別下降了6.8%、20.3%。這可能是因?yàn)?，副干酪乳桿菌沒有產(chǎn)生多酚類物質(zhì)的能力，而固態(tài)發(fā)酵環(huán)境中氧氣含量較高，可能對(duì)黃酮和酚類等成分有一定的破壞作用，因此造成該類物質(zhì)含量下降。

檢測(cè)的5個(gè)樣品中有1個(gè)樣品檢出大腸埃希菌，經(jīng)檢驗(yàn)，系取樣過程染菌；其他樣品中均未檢測(cè)到金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、霉菌。由于上述試驗(yàn)均處于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，所有原材料均經(jīng)過嚴(yán)格篩選，所有流程也都嚴(yán)格按照無菌操作進(jìn)行，因此染菌風(fēng)險(xiǎn)較小。

對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，產(chǎn)品沖泡后香氣純正，有濃郁紅棗香，口感酸甜度適中，口感協(xié)調(diào)度較高，但順滑度、均一狀態(tài)和溶解性較差。這可能是由產(chǎn)品含有麥麩、紅棗顆粒所致，還需改進(jìn)。總體而言，用副干酪乳桿菌固態(tài)發(fā)酵制得的紅棗益生菌粉沖泡后口感良好，總體評(píng)價(jià)得分為7.35。

圖11 綜合評(píng)價(jià)結(jié)果雷達(dá)圖Fig.11 Radar chart of comprehensive evaluation results

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面試驗(yàn)，確定了副干酪乳桿菌固態(tài)發(fā)酵棗粉的最佳發(fā)酵條件為：豆粉添加量24%，麥麩添加量9%，料水比1∶0.9，接種量10%，發(fā)酵時(shí)間24 h，-50 ℃冷凍干燥24 h。該工藝條件下制得樣品的穩(wěn)定性好，在(37±2)℃條件下存放60 d后活菌數(shù)仍然大于108CFU·g-1。該工藝條件下制得的紅棗益生菌粉產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)均能達(dá)到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求，并且粗多糖、GABA、游離氨基酸含量較發(fā)酵前提高。綜上所述，在此工藝條件下，副干酪乳桿菌固態(tài)發(fā)酵紅棗制得的紅棗益生菌粉不僅含有大量活菌，還提高了部分活性物質(zhì)的產(chǎn)量，且產(chǎn)品綜合評(píng)價(jià)得分較高，有濃郁棗香味，口感酸甜度適中且協(xié)調(diào)度較高，是一種口感良好、有較高營養(yǎng)價(jià)值的固態(tài)飲料。