豬腸道細(xì)菌培養(yǎng)組學(xué)研究進(jìn)展

周夢情，陳從英

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)國家重點實驗室，南昌 330045)

養(yǎng)豬業(yè)在我國國民經(jīng)濟(jì)中占有非常重要的地位，為人們提供了主要的肉食種類。同時，豬也是研究人類生理功能和疾病的重要模型動物[1]，與人體健康聯(lián)系較緊密。豬的重要經(jīng)濟(jì)性狀受到其腸道微生物組成、結(jié)構(gòu)和功能的影響。因此，豬腸道菌群是近年來的研究熱點領(lǐng)域之一。豬腸道細(xì)菌培養(yǎng)組學(xué)的研究也越來越重要，主要原因是：1)細(xì)菌16S rRNA基因測序技術(shù)能以極低的成本對豬腸道菌群進(jìn)行分析，但只能精確到細(xì)菌屬及屬以上分類水平，對于種或種以下水平的分類難以確認(rèn)[2]。對于微生物群落的研究，只分類到屬是遠(yuǎn)不夠的。2)1998年 開始的宏基因組分析包含了可培養(yǎng)與未培養(yǎng)的微生物。宏基因組研究揭示了腸道菌群的多樣性，但其難以區(qū)分豐度較低的菌株[3]。通過宏基因組可發(fā)現(xiàn)人體腸道中大量未培養(yǎng)菌株信息(約70%)[4]。宏基因組物種鑒定依賴已知數(shù)據(jù)庫信息，但還有大量物種無法鑒定；許多樣品中的優(yōu)勢物種目前并不存在已培養(yǎng)的參考菌株，再加上技術(shù)方面的問題，這些都在影響著宏基因組的發(fā)展。3)通過分離培養(yǎng)出優(yōu)勢物種的代表菌株，可通過測序得到其基因組信息，研究該菌株的功能以及用無菌小鼠進(jìn)行功能驗證，可擴(kuò)大對人類或其他哺乳動物腸道微生物組成和多樣性的認(rèn)識，證實腸道菌群與宿主表型性狀的因果關(guān)系，研究其作用機(jī)制等[5]。

使用培養(yǎng)組學(xué)對豬腸道菌群進(jìn)行研究，將對豬腸道菌群組成及功能有更全面的了解，可為研究菌群與宿主基因互作提供生物材料。本文主要從豬腸道菌群組成結(jié)構(gòu)、培養(yǎng)組學(xué)發(fā)展、豬腸道細(xì)菌培養(yǎng)組學(xué)的研究現(xiàn)狀等方面進(jìn)行綜述。

1 豬腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)

豬腸道菌群是指所有定殖在豬腸道里的大量細(xì)菌、病毒、真菌和古菌等構(gòu)成的集合。而細(xì)菌占絕大部分比例，是目前研究重點之一。仔豬是否在出生前就存在腸道菌群有一定爭議，對于出生前母豬子宮中是否有菌也還不確定[6]，一般認(rèn)為仔豬是出生后通過與外界環(huán)境、母體產(chǎn)道和乳汁以及糞便的接觸從而獲得菌群并開始在腸道定殖[7]。豬腸道菌群從需氧菌、兼性厭氧菌再到厭氧菌進(jìn)行定殖[8]。豬腸道菌群組成受多種因素影響，如宿主遺傳[9]、性別[10]、年齡以及日糧[8]等。成年豬腸道總表面積約在1 000 m2，腸道內(nèi)大約有30個屬的400～600種細(xì)菌，數(shù)量達(dá)1014個，是體細(xì)胞數(shù)的10倍[11]，分布于腸道的各個部位。健康哺乳動物體內(nèi)存在著500～1 000 余種細(xì)菌和其他微生物種類[12]，與營養(yǎng)物質(zhì)代謝[13]、宿主免疫[14]和代謝綜合征[15]等都緊密相關(guān)。其能消化分解碳水化合物[16]、合成B族維生素[17-19]、產(chǎn)生短鏈脂肪酸[20]等物質(zhì)。在健康狀態(tài)下，小腸(十二指腸、空腸和回腸)內(nèi)只含有少量細(xì)菌，盲腸和結(jié)腸中細(xì)菌數(shù)量最多[11]。

豬腸道菌群主要由厭氧菌、兼性厭氧菌和需氧菌組成，其中，以厭氧菌為主，約占99%；少部分為兼性厭氧菌或需氧菌[21]。從分類水平上看，豬腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)可通過門、綱、目、科、屬、種分類水平上菌群的種類和豐度反映?？傮w來看，豬腸道菌群主要是由厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和螺旋菌門(Spirochaetes)五個門的細(xì)菌組成[22]。其中，厚壁菌門和擬桿菌門是最具優(yōu)勢的兩大門。與之前報道的人類腸道菌群組成類似[12]。Patil等[23]研究發(fā)現(xiàn)，不同腸道部位的菌群組成有很大差異,十二指腸主要由厚壁菌門(90%)主導(dǎo)；空腸和回腸主要是厚壁菌門和變形菌門主導(dǎo)；盲腸中厚壁菌門(>75%)占主導(dǎo)地位；結(jié)腸中的菌群多樣性最高，包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和螺旋菌門。Han等[24]分析了不同日齡豬腸道菌群組成情況，發(fā)現(xiàn)其組成差異顯著。綜合以上研究結(jié)果可知，豬腸道菌群組成在水平結(jié)構(gòu)和垂直結(jié)構(gòu)上都存在顯著差異。

Ramayo-Caldas等[25]研究發(fā)現(xiàn)，豬腸道菌群組成的腸型分類與其體重和平均日增重顯著相關(guān)。Hu等[5]采用FMT(糞菌移植)發(fā)現(xiàn)，仔豬斷奶后腹瀉與腸道菌群相關(guān)。豬的腸道菌群是高度復(fù)雜但相對穩(wěn)定的，在某些情況下，這種穩(wěn)定被打破，可引起菌群紊亂，導(dǎo)致疾病發(fā)生和豬生產(chǎn)性狀等的改變。

2 培養(yǎng)組學(xué)發(fā)展

微生物學(xué)發(fā)展已進(jìn)入第三個黃金時期。第一個黃金時期主要是傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)，揭示了大量微生物以及發(fā)現(xiàn)了益生菌；第二個黃金時期主要是揭示細(xì)菌遺傳基礎(chǔ)；第三個黃金時期主要是揭示人體微生物組與健康的密切聯(lián)系。組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)，如16S rRNA 基因測序、宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組和宏蛋白質(zhì)組等組學(xué)分析技術(shù)提供了間接了解微生物組的手段。微生物學(xué)研究中，培養(yǎng)技術(shù)顯得十分重要。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)，受技術(shù)和條件限制，大多數(shù)的微生物仍未培養(yǎng)成功。但研究微生物與疾病或者與宿主表型的關(guān)系時，還需微生物活體，于是培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)得到了快速發(fā)展。

近年來，腸道菌群研究大都圍繞細(xì)菌展開。相對于細(xì)菌，真菌、病毒和古菌等微生物研究略少。培養(yǎng)法是分離細(xì)菌所用的最古老的技術(shù)。2012年，培養(yǎng)組學(xué)由Lagier等[26]提出，是一種通過改善培養(yǎng)條件培養(yǎng)細(xì)菌的方法。該方法除了通過改善培養(yǎng)條件盡可能模擬細(xì)菌原始生存環(huán)境外，還通過結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜 (MALDI-TOF MS)和16S rRNA基因測序等技術(shù)對分離得到的菌株進(jìn)行鑒定。培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)是了解特定菌或菌群在宿主中作用的關(guān)鍵，獲得的菌株可從機(jī)制上深入研究腸道菌群塑造、功能、新陳代謝和炎癥等。

2.1 培養(yǎng)組學(xué)中的細(xì)菌分離、鑒定和培養(yǎng)技術(shù)

2.1.1 細(xì)菌分離技術(shù) 目前，改良培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)條件優(yōu)化、共培養(yǎng)和微流控液滴培養(yǎng)等是腸道菌群的主要分離技術(shù)。相對于傳統(tǒng)分離技術(shù)，這些技術(shù)可擴(kuò)大腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的范圍。

改良培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件優(yōu)化可以大幅度改善腸道菌群的培養(yǎng)情況，改良培養(yǎng)基組分即添加短肽類物質(zhì)、微量元素和信號分子等，培養(yǎng)條件優(yōu)化則是改變培養(yǎng)溫度、pH及時間等，均可提高未培養(yǎng)細(xì)菌的可培養(yǎng)性。研究表明，YCFA培養(yǎng)基能提供70%人類腸道微生物生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，因此，將YCFA培養(yǎng)基與選擇性培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合起來可以進(jìn)行靶向細(xì)菌分離[27]。Li等[28]通過在厭氧培養(yǎng)基中添加十八碳烯酸(TVA)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的菌群大部分屬于未培養(yǎng)的瘤胃菌群。Zou等[29]基于腸道細(xì)菌的特性篩選出11種培養(yǎng)基，并涂布0.1%半胱氨酸，增加了腸道細(xì)菌的可培養(yǎng)性。在腸道菌群中，微生物間的互作對于菌群生存相當(dāng)重要。共培養(yǎng)是一種培養(yǎng)兼性和互養(yǎng)微生物的有效方法[30]。來自同一腸道環(huán)境的微生物往往具有協(xié)同作用，Nichols等[31]發(fā)現(xiàn)，輔助菌株MSC105可對未培養(yǎng)細(xì)菌MSC33的生長起誘導(dǎo)作用。微流控液滴培養(yǎng)是在微觀條件下對流體進(jìn)行精確控制，利用微流控可以模擬腸道中存在的微結(jié)構(gòu)，充分挖掘菌群的功能。Jalili-Firoozinezhad等[32]通過構(gòu)建雙通道微流控裝置，制備出一種厭氧腸道芯片，將從人類糞便中分離出的復(fù)雜腸道微生物樣本培養(yǎng)數(shù)天，可培養(yǎng)出200多種不同的細(xì)菌，其豐度和比例與在人類糞便中觀察到的相似。

改良培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)條件優(yōu)化、共培養(yǎng)和微流控液滴培養(yǎng)等具有代表性的細(xì)菌分離技術(shù)在近幾年得到了快速發(fā)展。每種技術(shù)都有其優(yōu)勢，必要時可進(jìn)行多種分離技術(shù)聯(lián)用，多角度對未培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行分離。

2.1.2 鑒定技術(shù) 傳統(tǒng)的菌株鑒定方法操作繁瑣且較為耗時，準(zhǔn)確性較差。目前，基于基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)和16S rRNA基因測序是培養(yǎng)組學(xué)菌株鑒定中最常用的技術(shù)。MALDI-TOF MS是一種基于細(xì)菌表面蛋白分子量的快速菌株鑒定技術(shù)。通過測定細(xì)菌特異性的蛋白質(zhì)組成，采用質(zhì)譜技術(shù)將測定得到的蛋白質(zhì)和多肽按分子量大小排列，形成蛋白質(zhì)組指紋圖，通過特征模式峰進(jìn)行菌株鑒定[33]。與傳統(tǒng)菌株鑒定方法相比，MALDI-TOF MS檢測速度快，靈敏度高，準(zhǔn)確率較高。Seng等[34]分析其11年臨床微生物鑒定經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)，MALDI-TOF MS同時具備時效性高與成本低的特點。得益于現(xiàn)有菌株數(shù)據(jù)庫的相對完善，現(xiàn)階段，MALDI-TOF MS已經(jīng)能夠鑒定出大部分菌株[35]，包括臨床常見厭氧菌，即使一些生化反應(yīng)相似、不易區(qū)分的厭氧菌也可進(jìn)行區(qū)分。MALDI-TOF MS 技術(shù)操作簡單，鑒定準(zhǔn)確、快速且可高通量進(jìn)行菌株鑒定,可作為豬腸道菌株鑒定及篩選的重要輔助工具。

16S rRNA基因測序是一種通用的利用細(xì)菌16S rRNA序列測序進(jìn)行細(xì)菌物種鑒定方法。16S rRNA是核糖體RNA的一個亞基，16S rRNA基因為編碼該亞基的基因，長度約1 542 bp。16S rRNA基因序列包括9個可變區(qū)和10個保守區(qū)，保守區(qū)序列是所有細(xì)菌共有，可反映物種間的親緣關(guān)系，而可變區(qū)序列則能體現(xiàn)物種間的差異。不同細(xì)菌之間16S rRNA基因的可變區(qū)顯著不同，對菌株進(jìn)行全長16S rRNA基因測序可對所有可變區(qū)進(jìn)行比較。由于Illumina測序(二代測序)所產(chǎn)生的單條read長度在75～300 bp間，目前，16S rRNA基因全長序列是通過sanger測序(一代測序)獲得。Johnson等[36]對16S rRNA基因進(jìn)行PacBio CCS測序(三代測序)發(fā)現(xiàn)，三代測序16S rRNA基因全長在種屬鑒定上的多樣性比二代測序更豐富，提高了種屬鑒定的分辨率和準(zhǔn)確度。

目前，MALDI-TOF MS和16S rRNA基因測序這兩種鑒定技術(shù)已獲得普遍認(rèn)可。但由于16S rRNA基因測序成本高和耗時長等原因，大部分研究都會優(yōu)先選擇MALDI-TOF MS這種經(jīng)濟(jì)有效且快速的菌株鑒定方法。

2.1.3 培養(yǎng)技術(shù) 微生物培養(yǎng)技術(shù)包括需氧培養(yǎng)、二氧化碳培養(yǎng)、微需氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)。根據(jù)不同的樣品及不同的培養(yǎng)目的，可選用不同的培養(yǎng)技術(shù)。

需氧培養(yǎng)是將分離出的少量細(xì)菌轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中，置于適宜溫度的培養(yǎng)箱中，無特殊要求的細(xì)菌均可生長。Sangwan等[37]從環(huán)境中分離出一種細(xì)菌ChthoniobacterflavusEllin428，該菌株為好氧異養(yǎng)，在多種生物培養(yǎng)基上都生長良好。二氧化碳培養(yǎng)是某些細(xì)菌嗜二氧化碳，只在高濃度的二氧化碳環(huán)境中生長或生長得更好。James-Holmquest等[38]研究表明，Neisseriagonorrhoeae菌株需在二氧化碳環(huán)境中生長，且濃度越高越適宜。微需氧培養(yǎng)是在含有5%～6%氧氣、5%～10%二氧化碳和85%氮氣的氣體環(huán)境中，將微需氧菌接種到培養(yǎng)基上，35 ℃進(jìn)行培養(yǎng)。微需氧菌如彎曲菌屬等在大氣和絕對無氧環(huán)境中不能存活。Hansen等[39]對100名兒童的結(jié)腸活檢組織進(jìn)行微需氧培養(yǎng)，得到129株革蘭陰性微需氧菌，大多為彎曲菌屬和螺桿菌屬。厭氧培養(yǎng)是厭氧菌對氧敏感，培養(yǎng)過程中需無氧環(huán)境的一種培養(yǎng)技術(shù)，適用于專性厭氧菌與兼性厭氧菌。Browne等[40]使用厭氧培養(yǎng)從健康人腸道中分離出137種菌，這些菌都屬于新的菌種，該研究表明，相當(dāng)大比例的腸道細(xì)菌是可培養(yǎng)的。

哺乳動物腸道中蘊(yùn)藏著巨量的微生物。腸道菌群細(xì)胞總量約1014個，其中99%是厭氧細(xì)菌，絕大部分需進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。目前,在公共數(shù)據(jù)庫中具有完整基因組序列信息的細(xì)菌和古菌已超過20萬個，相當(dāng)高比例的細(xì)菌還未被分離培養(yǎng)[41]。KOMODO數(shù)據(jù)庫的出現(xiàn)為解決該問題提供了重要工具，這個數(shù)據(jù)庫有來自18 049種不同微生物和3 335個培養(yǎng)基配方的信息，能基于細(xì)菌或古菌16S rRNA基因序列來預(yù)測其菌生長所需的合適培養(yǎng)基配方[42]，該數(shù)據(jù)庫對豬腸道細(xì)菌培養(yǎng)組學(xué)具有十分重要的意義。對于培養(yǎng)組學(xué)，除了分離和培養(yǎng)條件的多樣化，還使用各種高通量測序技術(shù)鑒定(圖1)，即培養(yǎng)組學(xué)是一種高通量的培養(yǎng)方法。

圖1 培養(yǎng)組學(xué)工作流程Fig.1 The workflow of culturomics

2.2 細(xì)菌培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)進(jìn)展

目前，培養(yǎng)組學(xué)已獲得廣泛關(guān)注并取得顯著成就，但其研究主要集中于人體腸道菌群的培養(yǎng)。在培養(yǎng)組學(xué)之前，已培養(yǎng)的14 300種原核生物中有2 172種 (15%)是從人體中分離，另外12 128種(85%)則是從環(huán)境中分離得到[43]。自培養(yǎng)組學(xué)發(fā)展至今，與人體相關(guān)且已分離培養(yǎng)的微生物數(shù)量增加到了2 671種[44]。

已有研究表明，使用培養(yǎng)組學(xué)得到的人體腸道微生物的多樣性高于根據(jù)基因組分析預(yù)測的多樣性[43,45]。Lagier等[46]對糞便樣本開展培養(yǎng)組學(xué)研究時，將212種培養(yǎng)條件總結(jié)優(yōu)化為18種最佳培養(yǎng)條件，可把腸道中70%的微生物分離培養(yǎng)，共鑒定出1 057種微生物種類，其中，531種屬于人體腸道菌群，豐富了人類腸道菌群中可培養(yǎng)細(xì)菌的種類。Pfleiderer等[47]首次在神經(jīng)性厭食癥患者糞便樣本中開展培養(yǎng)組學(xué)研究，共使用88種培養(yǎng)條件，得到12 700個 不同菌落，鑒定到4個門中133種細(xì)菌。并且存在之前從未從人類腸道中分離出的19種細(xì)菌，有11種經(jīng)基因組測序鑒定為新的細(xì)菌種類。腸道中厭氧微生物占比極高，由于需要創(chuàng)建、維持厭氧環(huán)境以及厭氧菌生長較緩慢等諸多原因，厭氧微生物培養(yǎng)非常耗時[48]。在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑可使嚴(yán)格厭氧微生物在有氧環(huán)境下成功培養(yǎng)[49]。Park和Yu[50]將半胱氨酸、谷胱甘肽、抗壞血酸、尿酸和α-酮戊二酸一起添加到培養(yǎng)基中時，可使620種(共測試623個菌株)菌株生長，包括兼性厭氧細(xì)菌(154種)、嚴(yán)格厭氧菌(82種)以及真菌和產(chǎn)甲烷菌。培養(yǎng)組學(xué)為細(xì)菌的分離鑒定提供了較全面的培養(yǎng)條件，Lagier等[51]通過對培養(yǎng)條件分析表明，在血培養(yǎng)瓶中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，分離得到的菌株中56%為新物種；在培養(yǎng)液中添加經(jīng)過過濾滅菌的瘤胃液，可以得到40%的新物種；添加5%的綿羊血，分離得到的菌株中25%為新物種。

16S rRNA基因測序或宏基因組測序，都極大豐富了腸道微生物組數(shù)據(jù)庫。測序技術(shù)與培養(yǎng)組學(xué)之間是互補(bǔ)的，Hamad等[52]利用培養(yǎng)組學(xué)方法，從14份糞便樣本中分離出17 800個真菌菌落，經(jīng)ITS1與ITS2擴(kuò)增子測序得到的腸道真菌群落信息與培養(yǎng)組學(xué)存在較大差異，兩者對糞便真菌多樣性的分析形成了互補(bǔ)。此互補(bǔ)不僅存在于腸道真菌研究中，也存在于腸道細(xì)菌研究中。Zou等[29]利用11種培養(yǎng)基大規(guī)模分離培養(yǎng)155個健康人糞便樣本，共獲得6 487個 菌落，經(jīng)測序得到1 520個高質(zhì)量的人體微生物細(xì)菌基因組，定義為可培養(yǎng)參考基因組(culturable genome reference，CGR)。與之前報道的1 000種人體胃腸道細(xì)菌的測序結(jié)果相比，超過80種細(xì)菌是新發(fā)現(xiàn)的。1 520個基因組覆蓋人體內(nèi)所有主要細(xì)菌門和屬，其中，264個基因組在現(xiàn)有的參考基因組中未發(fā)現(xiàn)。細(xì)菌參考基因組數(shù)量的增加可提高宏基因組測序數(shù)據(jù)的利用率(從50%提高到70%)，使人類微生物群的分辨率更高。

Gouba等[53]從健康人糞便樣品中分離出腸球菌科的一個新種Enterococcus burkinafasonensis sp.nov.中的菌株Marseille-Q0835T，并對其表型特征進(jìn)行描述，更新了人類菌株庫。Amadou等[54]從一名肥胖患者糞便樣品中分離出新的細(xì)菌Lachnoclostridiumbouchesdurhonense，該菌可在含有5%綿羊血的哥倫比亞瓊脂上進(jìn)行培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)的不斷優(yōu)化，越來越多的細(xì)菌可從腸道中分離出，將此前在腸道中從未分離的菌種成功培養(yǎng)。雖存在工作量大、菌株測序步驟較為繁瑣和培養(yǎng)條件苛刻等不足，但技術(shù)與方法的不斷創(chuàng)新有助于培養(yǎng)組學(xué)的發(fā)展。實體菌株的獲得為人體微生物組相關(guān)研究如株水平的研究，細(xì)菌、病毒和真菌的培養(yǎng)，生物信息分析技術(shù)優(yōu)化等奠定了基礎(chǔ)。也是微生物產(chǎn)物轉(zhuǎn)化如活菌藥物庫、精準(zhǔn)醫(yī)療的物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 培養(yǎng)組學(xué)在豬腸道菌群研究中的利用現(xiàn)狀

豬腸道細(xì)菌的培養(yǎng)是豬腸道菌群研究的重要內(nèi)容之一，利用培養(yǎng)組學(xué)分離鑒定豬腸道菌群中未分離的菌株，通過MALDI-TOF MS或16S rRNA基因測序分析、全基因組測序和注釋以及主要表型特征描述等方法，可鑒定新物種及其基因組，并對其在豬腸道菌群中的作用進(jìn)行深入研究[55]。但目前，由于豬培養(yǎng)組學(xué)數(shù)據(jù)相對不足，了解相關(guān)微生物物種間的相互作用局限性較大[56]。為充分了解豬腸道微生態(tài)系統(tǒng)是如何工作的，以及研究腸道菌群與宿主相互作用關(guān)系，腸道中未分離菌株的分離培養(yǎng)十分重要，培養(yǎng)組學(xué)也已成為豬腸道微生態(tài)研究中的重要支撐技術(shù)之一。

目前，培養(yǎng)組學(xué)研究大多集中在人體腸道細(xì)菌培養(yǎng)[46]，而對豬腸道培養(yǎng)組學(xué)的研究較少。腸道培養(yǎng)組學(xué)可將此前從未在豬腸道中被分離培養(yǎng)的菌株成功培養(yǎng)。豬腸道中的某些菌(如產(chǎn)甲烷菌)使用傳統(tǒng)方法難以分離和培養(yǎng)；使用培養(yǎng)組學(xué)方法可從豬糞便樣本中分離出甲型甲烷弧菌[57]。Stanley等[58]應(yīng)用分離培養(yǎng)的方法，從豬結(jié)腸黏膜中分離出一種梭狀芽胞桿菌和兩種擬桿菌菌株，并表明，這3株細(xì)菌顯著水解黏蛋白。Li等[59]應(yīng)用培養(yǎng)組學(xué)方法從野豬腸道中分離培養(yǎng)得到156株乳酸菌，且其中5株乳酸菌菌株具有益生菌性質(zhì)，可作為候選益生菌或是飼料添加劑。同樣，Betancur 等[60]從哥倫比亞克里奧爾豬糞便中分離出3株植物乳桿菌菌株，并確定其具有抗菌活性，可抑制潛在的致病微生物。張錦華等[61]從豬腸道各個區(qū)段中共分離出2 317株腸道細(xì)菌，通過鑒定其中兩株菌為枯草芽孢桿菌，為產(chǎn)蛋白或是多肽類抗生素的活性菌株。Xu等[62]從健康母豬的新鮮糞便分離出LactobacillusreuteriYSJL-12，對其進(jìn)行了全基因組測序，飼料中添加LactobacillusreuteriYSJL-12喂養(yǎng)斷奶仔豬和育肥豬，可預(yù)防豬的腹瀉，提高飼料轉(zhuǎn)化率，增強(qiáng)仔豬抗病能力，促進(jìn)仔豬生長。也有研究報道，使用培養(yǎng)組學(xué)從豬糞便樣本中獲得的寇氏普氏菌(Prevotellacopri)，可影響豬肌肉生長及脂肪沉積等性狀，這為進(jìn)一步研究豬腸道菌群與重要經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)系提供了參考[63]。

隨著培養(yǎng)組學(xué)的繼續(xù)發(fā)展，豬腸道中的微生物會被逐漸分離，直接引起宿主表型變化和疾病發(fā)生的因果菌株也會被鑒別。

4 展 望

4.1 腸道部位多樣性有助于培養(yǎng)組學(xué)發(fā)展

目前為止，豬腸道菌群的復(fù)雜性和多樣性尚未得到深入探索，培養(yǎng)組學(xué)的出現(xiàn)可為菌群研究提供新思路。在人體腸道菌群培養(yǎng)組學(xué)研究中,僅糞便樣本中就可發(fā)現(xiàn)較多新菌種。但采用糞便菌群代表腸道菌群是存在一定偏離的，理想情況應(yīng)是進(jìn)行全腸道菌群檢測。對于豬腸道菌群，不同腸道部位(如盲腸、結(jié)腸)樣本可分離培養(yǎng)出更多新菌種。豬作為大動物的一種，相對于人來說，易進(jìn)行單一因素研究。因此，豬腸道菌群培養(yǎng)組學(xué)研究潛力巨大。

4.2 細(xì)菌基因組信息有助于培養(yǎng)組學(xué)發(fā)展

微生物組學(xué)研究中，已有參考基因組的微生物數(shù)量遠(yuǎn)低于自然界存在的微生物數(shù)量?？捎萌鷾y序結(jié)合二代測序?qū)悠愤M(jìn)行單菌基因組組裝，二代測序數(shù)據(jù)可對三代測序數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行校正；同時，三代測序數(shù)據(jù)可以進(jìn)行參考基因組優(yōu)化，獲得完整的細(xì)菌基因組信息?，F(xiàn)階段已分離的細(xì)菌約為15 000種，絕大多數(shù)微生物還未進(jìn)行分離培養(yǎng)，原因之一是不了解不同微生物培養(yǎng)條件(尤其是培養(yǎng)基配方)。KOMODO數(shù)據(jù)庫可利用菌株的基因組信息來提示培養(yǎng)基的選擇或培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的添加，實現(xiàn)目標(biāo)菌株的分離培養(yǎng)。

4.3 培養(yǎng)組學(xué)不足與應(yīng)用前景

目前，培養(yǎng)組學(xué)為新型菌群研究技術(shù)，但限制因素依然存在。

4.3.1 菌株鑒定效率低 培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)可以得到大量不可能培養(yǎng)或難于培養(yǎng)的菌株，但存在某些高通量測序技術(shù)難以鑒定的菌株。菌株鑒定效率低且成本高是限制因素之一。但隨著MALDI-TOF MS 技術(shù)和高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，該限制因素正在不斷解決中。

4.3.2 培養(yǎng)基成分和生長條件不全面 大多數(shù)腸道中的細(xì)菌不會在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中生長，且任何細(xì)菌的生長都需要營養(yǎng)和適宜的大氣環(huán)境。不同培養(yǎng)條件下，細(xì)菌生長會有明顯差異。目前，已出現(xiàn)可控制pH、培養(yǎng)溫度和氧氣濃度的培養(yǎng)箱，但某些細(xì)菌需要的特殊營養(yǎng)物質(zhì)需要不斷進(jìn)行摸索。簡化培養(yǎng)步驟，發(fā)展新的培養(yǎng)技術(shù)是改善培養(yǎng)組學(xué)的一個新方向。

4.3.3 培養(yǎng)組學(xué)應(yīng)用前景 培養(yǎng)組學(xué)研究獲得的實體菌株，在機(jī)制研究和精準(zhǔn)醫(yī)療方面應(yīng)用前景廣闊。但培養(yǎng)組學(xué)相對來說是一個較新的研究技術(shù)，培養(yǎng)基的設(shè)計以及培養(yǎng)條件的多樣化都需要重視。目前，對于豬腸道菌群的認(rèn)識還處于初級階段，宏基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和免疫組學(xué)等單個組學(xué)可獲得腸道菌群的局部信息。但隨著培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)、高通量測序技術(shù)及多組學(xué)的發(fā)展，豬腸道菌群領(lǐng)域的神秘將逐漸被揭示，對于腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能的理解也將更加深入。

致謝

感謝黃路生院士對本論文的精心指導(dǎo)！